王 煉,王雪飛,劉 丹,耿敏杰,郭志偉,崔 娜,劉建平,夏雅娟,楊 英

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 動物醫(yī)藥學院,河南 鄭州 450000;2.內蒙古農(nóng)業(yè)大學 獸醫(yī)學院,內蒙古 呼和浩特 010018;3.內蒙古巴彥淖爾市疾病預防控制中心,內蒙古 巴彥淖爾 014000;4.內蒙古包頭市疾病預防控制中心,內蒙古 包頭 014010;5.內蒙古地方病防治研究中心,內蒙古 呼和浩特 010031)

As2O3會對機體正常細胞產(chǎn)生毒性作用。有證據(jù)顯示As2O3會因劑量不同產(chǎn)生復雜的雙向作用。低劑量的砷劑會引起人肝臟細胞增殖,而高劑量的則抑制細胞增殖,降低細胞存活率,誘導細胞凋亡[1-2]。然而,As2O3也會對癌細胞產(chǎn)生毒性作用。研究發(fā)現(xiàn),As2O3能夠致使肝癌、頭頸部鱗狀細胞癌、小細胞肺癌[2-4]等多種癌細胞的存活率下降,誘導癌細胞凋亡。在臨床上,As2O3已被用于肝癌、急性早幼粒細胞白血病等癌癥的治療。但是,As2O3對機體正常細胞和癌細胞的作用機制仍不清晰。近年來的研究表明砷是潛在的內分泌干擾物,可以影響機體甲狀腺激素(thyroid hormone,TH)信號通路[5]。前期研究也顯示,As2O3能夠引起大鼠血清TH水平異常[6]。因此本研究以大鼠肝臟細胞系BRL-3A和肝癌細胞系RH-35為研究對象,通過檢測不同劑量As2O3作用2種細胞后,甲狀腺激素受體β1(thyroid hormone receptor β1,TRβ1)和細胞周期蛋白Dl(cyclin protein D1,Cyclin D1)基因和蛋白的變化,探索As2O3作用TH信號通路的具體機制,為As2O3的臨床應用以及防治砷中毒提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑As2O3,分析純(二級,北京化工廠,CAS:1327-53-3,批號890314);DMEM(Gibco,12100-046);胎牛血清FBS(Gibco,10099-133);0.25%胰酶(Gibco,25200-056);ITS(Gibco,41400-45);EGF(Sigma,E9644);HEPES粉(Sigma,H4-034);兔多克隆抗體Cyclin D1以及鼠單克隆抗體β-actin(均購于Santa Cruz 生物試劑公司);小鼠單克隆抗體TRβ1(購于Abcam生物試劑公司);HRP 標記的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG(購于優(yōu)科卓業(yè)生物醫(yī)學技術(北京)有限公司);兔抗山羊IgG、RIPA蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑、4×蛋白上樣緩沖液(均購于聯(lián)科生物);PVDF膜(Millipore 公司);RN28 EASYspin Plus組織細胞RNA提取試劑盒(北京艾德萊);ReverAid First Strand cDNA SynthesisKit k1622(Thermo,00270332);FastStart Universal SYBR Green Master(ROX,04913914001);SuperSignalR West Femto Maximum Sensitivity Substrate(Thermo,34095);丙烯酰胺、N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺、過硫酸胺、四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、Tris base、甘氨酸、Tween-20(Sigma公司);BCA Protein Assay試劑盒(TaKaRa,T9300A);脫脂奶粉(BD,231100)。

1.2 主要儀器熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS,1×71);CO2培養(yǎng)箱(Thermo);低溫離心機(Eppendorf,5430R);全自動酶標儀(Thermo,MK3);BIOER基因擴增儀TC-48/H(t)(BIOER,日本);實時定量PCR儀(Applied biosystems,美國);穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀DYY-6D型(北京六一儀器廠);全自動凝膠成像系統(tǒng)(VILBER LOURMAT,法國);超純水機(UPH,成都超純科技有限公司)。

1.3 試驗細胞大鼠BRL-3A和RH-35細胞均購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.4 As2O3的制備稱取經(jīng)105℃干燥2 h的As2O30.049 5 g,用7.5 mL NaOH(1 mol/L)溶解,加入32.5 mL PBS,調整pH值為7,用PBS溶液定容至50.0 mL,得到0.005 mol/L As2O3。經(jīng)0.2 μm過濾器過濾除菌,分裝,4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 細胞的培養(yǎng)BRL-3A和RH-35 2種細胞均以DMEM為基礎培養(yǎng)基,添加10%胎牛血清、0.1 IU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素,5%CO2細胞培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng),0.25%胰酶消化傳代。取對數(shù)生長期的BRL-3A和RH-35細胞,分別用0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細胞,用DMEM培養(yǎng)液重懸細胞,每孔接種(2～4)×104個細胞于6孔板中培養(yǎng)。將培養(yǎng)板移入5%CO2的培養(yǎng)箱,37℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細胞約長成80%的豐度時接入不同濃度的As2O3溶液,分別培養(yǎng)12,24,48 h。

1.6 總RNA的提取與cDNA合成按照TaKaRa RNAiso Plus操作說明書提取細胞總RNA,按照Thermo公司的ReverAid First Strand cDNA SynthesisKit說明操作合成cDNA,-20℃保存待用。

1.7 熒光定量 PCR 檢測 TRβ1、CyclinD1基因相對表達量以不同時間不同處理組及對照組的樣品的反轉錄產(chǎn)物作為模板,用待測基因引物和內參基因引物進行PCR擴增,引物序列見表1,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應體系見表2。Cyclin D1的反應程序參考相應文獻,余下因子反應條件為:94℃ 5 min預變性;94℃ 30 s變性,60℃ 30 s退火,72℃ 30 s延伸,反應40個循環(huán);72℃延伸10 min,4℃ 10 min。以β-actin為內參,采用2-ΔΔCt法計算TRβ1、Cyclin D1基因的相對表達量。

表1 熒光定量PCR引物

表2 熒光定量PCR擴增體系

1.8 Western blot 檢測收集各處理組及對照組細胞,用預冷的PBS洗滌3次,加入適量的含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液(350～400)μL,冰上裂解細胞30 min,12 000 r/min,離心10 min,取上清。BCA法測定樣品蛋白質濃度。加入4×蛋白上樣緩沖液,煮沸10 min,-20℃保存待用。Western blot分析參照文獻[10]操作。

2 結果

2.1 RNA完整度檢測如圖1所示,提取的BRL-3A和RH-35細胞的RNA均呈現(xiàn)出2個條帶,28S rRNA條帶較18S rRNA的亮,兩者的比例大于2∶1,說明所提取的RNA完整性好,能夠滿足后續(xù)RT-qPCR試驗的需要。

圖1 BRL-3A和RH-35細胞RNA凝膠電泳圖

2.2 As2O3對BRL-3A細胞TH信號通路關鍵因子TRβ1、Cyclin D1蛋白水平的影響如圖2所示,與對照組相比,As2O3作用BRL-3A細胞12 h,各組TRβ1表達均降低,其中1.563和3.125 μmol/L組顯著降低(P<0.01),6.250 μmol/L組明顯降低(P<0.05)。As2O3作用24 h,1.563 μmol/L組TRβ1表達明顯升高(P<0.05),6.250 μmol/L組TRβ1表達顯著升高(P<0.01)。As2O3作用48 h,6.250 μmol/L組TRβ1表達顯著升高(P<0.01)。

圖3 蛋白質免疫印跡檢測As2O3作用BRL-3A 12(A),24(B)和48 h (C) Cyclin D1的蛋白表達水平

如圖3所示,與對照組相比,As2O3作用BRL-3A細胞12 h,1.563 μmol/L組Cyclin D1蛋白表達顯著升高(P<0.01),6.250 μmol/L組Cyclin D1的蛋白表達顯著降低(P<0.01);As2O3作用BRL-3A 24 h,3.125 μmol/L組Cyclin D1蛋白表達顯著升高(P<0.01),6.250 μmol/L組Cyclin D1的蛋白表達顯著降低(P<0.01);As2O3作用BRL-3A 48 h,各組Cyclin D1的蛋白表達均顯著降低(P<0.01)。

2.3 As2O3對BRL-3A細胞TH信號通路關鍵因子TRβ1、Cyclin D1基因水平的影響如圖4所示,與對照組相比,As2O3作用BRL-3A細胞12 h,1.563和6.250 μmol/L組TRβ1 mRNA表達量均顯著升高(P<0.01);As2O3作用BRL-3A 24 h,各組TRβ1 mRNA表達量均顯著降低(P<0.01);As2O3作用BRL-3A 48 h,6.250 μmol/L組TRβ1 mRNA表達量顯著升高(P<0.01)。表明隨著作用時間增加,高濃度As2O3誘導BRL-3A TRβ1 mRNA表達升高。與對照組相比,As2O3作用BRL-3A細胞12 h,1.563 μmol/L組Cyclin D1 mRNA表達量顯著升高(P<0.01),而6.250 μmol/L組顯著降低(P<0.01);As2O3作用BRL-3A細胞24 h,3.125 μmol/L組Cyclin D1 mRNA表達量顯著升高(P<0.01),6.250 μmol/L 組顯著降低(P<0.01);As2O3作用48 h,各組Cyclin D1 mRNA表達量均顯著降低(P<0.01)。表明低濃度的As2O3作用12 h誘導BRL-3A Cyclin D1 mRNA異常高表達,而高濃度則引起Cyclin D1 mRNA異常低表達。

2.4 As2O3對RH-35細胞TH信號通路關鍵因子TRβ1、Cyclin D1蛋白水平的影響如圖5所示,與對照組相比,As2O3作用RH-35細胞12 h,各組TRβ1蛋白表達量顯著升高(P<0.01);As2O3作用RH-35 24 h,1.563 μmol/L組TRβ1表達量明顯升高(P<0.05),其余組顯著升高(P<0.01);As2O3作用RH-35 48 h,3.125和6.250 μmol/L組TRβ1表達顯著升高(P<0.01),1.563 μmol/L組明顯降低(P<0.05)。表明中高濃度As2O3能誘導RH-35 TRβ1異常高表達,低濃度As2O3隨著作用時間的增長而誘導TRβ1表達降低。

圖4 RT-qPCR法檢測BRL-3A細胞TRβ1(A)和Cyclin D1(B)的基因表達水平

圖5 蛋白質免疫印跡檢測As2O3作用RH-35細胞12(A),24(B)和48 h (C) TRβ1的蛋白表達水平

圖6 蛋白質免疫印跡檢測As2O3作用RH-35細胞12(A),24(B)和48 h (C) Cyclin D1的蛋白表達水平

由圖6可知,與對照組相比,As2O3作用大鼠RH-35細胞12,24,48 h,各組Cyclin D1 蛋白表達量均顯著降低(P<0.01)。隨著濃度的升高,As2O3抑制Cyclin D1蛋白表達的作用增強,表明As2O3能誘導RH-35細胞Cyclin D1異常低表達。

2.5 As2O3對RH-35細胞TH信號通路關鍵因子TRβ1、Cyclin D1基因水平的影響由圖7可知,與對照組相比,As2O3作用RH-35細胞12,24 h,各組TRβ1 mRNA表達量顯著升高(P<0.01);As2O3作用RH-35 48 h,3.125和6.250 μmol/L組TRβ1 mRNA表達量顯著升高(P<0.01),1.563 μmol/L組顯著降低(P<0.01)。基因結果與蛋白結果基本一致,表明中高濃度As2O3能誘導RH-35 TRβ1異常高表達,低濃度As2O3隨著作用時間的增長而逐漸降低RH-35 TRβ1 mRNA的表達。與對照組相比,As2O3作用RH-35細胞12,24,48 h,各組Cyclin D1 mRNA表達量均顯著降低(P<0.01)?；蚪Y果與蛋白表達結果一致,表明As2O3能誘導RH-35細胞Cyclin D1異常低表達。

圖7 RT-qPCR法檢測RH-35細胞TRβ1(A)和Cyclin D1(B)的基因表達水平

3 討論

研究顯示,TH能影響多種正常細胞和癌細胞的增殖[11-14]。TRβ1是介導TH的生理作用的重要受體之一,研究發(fā)現(xiàn)TRβ1通過轉錄抑制Cyclin D1,抑制細胞增殖,改變細胞對激素的敏感性[15]。SEBASTIAN等[13]的研究也顯示,TRβ1通過調控Cyclin D1,進而誘導肝臟細胞增殖。PERRI等[16]報道TRβ1介導的Cyclin D1表達異常引起甲狀腺乳頭狀癌細胞系的增殖效應。

砷能影響TH水平,亦能對介導TH功能的甲狀腺激素受體(thyroid hormone receptors,TRs)產(chǎn)生不良影響,從而影響TRs介導的目的基因表達。早期研究發(fā)現(xiàn),砷中毒對基因轉錄有抑制作用[17]。進一步的研究其機制,結果顯示低劑量的砷通過影響TRs轉錄與翻譯,發(fā)揮其毒性作用[18]。砷中毒干擾小鼠TRβ1基因表達,4 mg/L AsIII能引起小鼠大腦及小腦TRβ1基因及蛋白表達均顯著下降[19-20]。也有研究結果顯示,0.15 mg/L的AsⅤ和AsIII均能降低鳙魚苗TRβ1的基因轉錄水平[21]。斑馬魚AsIII中毒48 h后,TRβ1基因轉錄水平降低[18]。

研究顯示,As2O3作用大鼠肝臟細胞系BRL-3A和肝癌細胞系RH-35,引起2種細胞的TRβ1基因和蛋白的異常表達。As2O3作用BRL-3A細胞,高濃度組隨著作用時間的增長,引起TRβ1表達先降低后持續(xù)升高,Cyclin D1表達持續(xù)降低;低濃度的As2O3隨著作用時間的增加,引起TRβ1表達先升高而后降低,Cyclin D1表達降低。As2O3作用RH-35細胞,中高濃度的As2O3誘導RH-35細胞TRβ1高表達,抑制Cyclin D1的表達。低劑量的As2O3作用RH-35細胞48 h,引起TRβ1表達降低,然而其抑制Cyclin D1表達的效應仍然非常明顯。由此,本試驗發(fā)現(xiàn)As2O3隨著作用時間的增加,呈現(xiàn)出促進BRL-3A細胞和RH-35細胞TRβ1的表達、抑制Cyclin D1表達的作用,高濃度組作用強于低濃度組。

綜上,As2O3調節(jié)BRL-3A和RH-35細胞的TRβ1,誘導Cyclin D1異常低表達,發(fā)揮其對2種細胞的毒性作用。TRβ1可能構成1個新的早期干預砷中毒的靶點。As2O3作用機制較為復雜,細胞試驗與機體試驗還有很大的差距,因此,As2O3的作用機制還需要進一步的動物試驗深入去研究。