董 杰,劉若寒,李守軍,2,周 沛,2*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院 廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510642;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院 廣東省寵物工程技術(shù)研究中心,廣東 廣州 510642)

犬圓環(huán)病毒(canine circovirus,CanineCV)是一類無(wú)囊膜DNA病毒,病毒核酸為共價(jià)閉合的單鏈環(huán)狀DNA分子,基因組大小為2.3 kb,病毒粒子大小為15～25 nm[1]?；蚪M序列分析顯示CanineCV具有圓環(huán)病毒屬典型的2個(gè)主要開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORFs):ORF1 編碼復(fù)制酶蛋白(replication associatedprotein,Rep)和ORF2 編碼衣殼蛋白(capsidprotein,Cap)[2]。脊椎動(dòng)物CanineCV是通過(guò)重組進(jìn)化而來(lái),Rep基因的 N 端來(lái)自微小病毒,C末端來(lái)自類小 RNA 病毒。不同犬種的CanineCV Cap蛋白差異可達(dá) 8%,與Cap基因相比,Rep基因的變異程度更小,相對(duì)保守[3]。自2012年美國(guó)首次報(bào)道CanineCV以來(lái),多個(gè)國(guó)家相繼報(bào)道了從犬科動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)新的CanineCV毒株,說(shuō)明在全球犬科動(dòng)物群體中已呈現(xiàn)較為廣泛的流行[2,4-12]。

CanineCV感染動(dòng)物后引起的臨床癥狀尚不明確,該病毒多與其他病原體混合感染,可能表現(xiàn)出許多不同的臨床癥狀,以嘔吐、出血性腹瀉等為主要癥狀。因此檢測(cè)CanineCV對(duì)于預(yù)防、控制和治療犬圓環(huán)病毒病具有重要意義。

早期主要是通過(guò)高通量測(cè)序方法從犬血清樣品中發(fā)現(xiàn)CanineCV。目前,在臨床樣本檢測(cè)中,多以普通PCR為主,也有運(yùn)用原位雜交、投射電子顯微技術(shù)進(jìn)行病理學(xué)檢查[13]。相比普通PCR無(wú)法定量、敏感性差,原位雜交等技術(shù)操作復(fù)雜,耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn),實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantification PCR,qPCR )技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、敏感性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),在臨床檢測(cè)中更具優(yōu)勢(shì)。而EvaGreen qPCR具有PCR抑制率低[14]、可以使用較高濃度、穩(wěn)定性強(qiáng)、安全性高等遠(yuǎn)勝于SYBR Green qPCR的優(yōu)點(diǎn)。

在當(dāng)下CanineCV理化特性、復(fù)制過(guò)程、致病性以及部分流行病學(xué)特征尚不明確的情況下,本研究擬建立1種基于EvaGreen染料的CanineCV qPCR檢測(cè)方法,并利用該方法對(duì)廣東地區(qū)收集的177份犬腹瀉樣本進(jìn)行CanineCV檢測(cè)分析,從而了解CanineCV在臨床上的基本感染情況。

1 材料與方法

1.1 樣本2019年4月-2020年12月,在廣東省廣州市、東莞市、惠州市、深圳市的部分寵物醫(yī)院以及東莞市某犬收容所共采集腹瀉犬只的血清樣本114份以及肛拭子63份。所有樣本在低溫情況下運(yùn)輸至本實(shí)驗(yàn)室,并立即保存于-80℃冰箱。

1.2 病毒株、細(xì)菌與細(xì)胞所有病毒株CanineCV-DG由廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

陽(yáng)性對(duì)照病毒和細(xì)菌:犬瘟熱病毒(canine distemper virus,CDV)、犬細(xì)小病毒(canine parvovirus,CPV)、犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)、貓細(xì)小病毒(feline panleukopenia virus,FPV)、貓杯狀病毒(feline calicivirus,FCV)病毒株以及大腸桿菌菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存;犬冠狀病毒(canine corona virus,CCoV)、犬腺病毒2型(canine adenovirus 2,CAV2)、犬副流感病毒(canine parainfluenza virus,CPIV)、犬鉤端螺旋體C-51株和黃疸出血型鉤端螺旋體NADL株,此八聯(lián)苗弱毒株為碩騰輝瑞公司產(chǎn)品。F81細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 主要儀器與試劑TaKaRa梯度PCR儀購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;NanoDrop One超微量分光光度計(jì)購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;Roche LightCycler?480 Ⅱ qPCR儀購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司;DH5α感受態(tài)細(xì)胞(TRELIEFTM5α Chemically Competent Cell,貨號(hào):TSC01)購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司; pMD18-T載體(貨號(hào):D101A)購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成在NCBI網(wǎng)站上下載全部CanineCV的全基因組序列,使用Mega X 10.1.8進(jìn)行序列比對(duì),在Rep基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物qPCR-F/R,用于構(gòu)建CanineCV的EvaGreen qPCR檢測(cè)方法(表1)。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)引物

1.5 構(gòu)建EvaGreen qPCR檢測(cè)陽(yáng)性參考質(zhì)粒使用qPCR-F/R引物,以CanineCV-DG全基因?yàn)槟０?利用GeneStar 2×Taq PCR StarMix預(yù)混酶擴(kuò)增EvaGreen qPCR檢測(cè)方法所需的PCR產(chǎn)物,將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接,構(gòu)建陽(yáng)性參考質(zhì)粒。經(jīng)PCR鑒定陽(yáng)性的菌液送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司廣州分公司進(jìn)行測(cè)序,對(duì)構(gòu)建正確的質(zhì)粒進(jìn)行批量制備,作為EvaGreen qPCR檢測(cè)的陽(yáng)性參考質(zhì)粒。

1.6 CanineCV EvaGreen qPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品模板的條件,反應(yīng)的總體系為20 μL,以陽(yáng)性參考質(zhì)粒為模板,其中Bio-Rad SsoFastTMEvaGreen?SuperMix預(yù)混酶 10.0 μL,質(zhì)粒模板1.0 μL,上、下游引物0.6 μL(終濃度為300,400,500 nmol/L),剩余體系用無(wú)核酸酶水補(bǔ)齊。擴(kuò)增條件為預(yù)變性95℃ 30 s;變性95℃ 5 s;退火(56,57,58,59℃ 20 s,45個(gè)循環(huán);熔解曲線程序?yàn)?5℃ 15 s;58℃ 1 min;95℃延伸。通過(guò)比較熔解曲線、熔解峰、交叉閾值(crossing point,Cp)值等判定出最適條件。

1.7 EvaGreen qPCR檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立使用優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。根據(jù)以下公式[15]將EvaGreen qPCR陽(yáng)性參考質(zhì)粒的質(zhì)量濃度(mg/L)轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的粒子拷貝數(shù)(copies/μL):粒子拷貝數(shù)(copies/μL)=6×1023(copies/μL) ×質(zhì)粒質(zhì)量濃度(g/mL)/MW(g/mol)。用無(wú)核酸酶水將已知質(zhì)量濃度的陽(yáng)性參考質(zhì)粒直接進(jìn)行10倍倍比稀釋,共稀釋9個(gè)數(shù)量級(jí)(109～103copies/μL)。使用本研究?jī)?yōu)化后方法進(jìn)行檢測(cè),每個(gè)數(shù)量級(jí)皆設(shè)置3個(gè)組內(nèi)重復(fù),結(jié)果由Roche LightCycler?480 Ⅱ qPCR儀器自帶軟件自動(dòng)生成分析。

1.8 EvaGreen qPCR檢測(cè)方法的靈敏度驗(yàn)證取3.88×109copies/μL陽(yáng)性參考質(zhì)粒依次進(jìn)行10倍倍比稀釋,共9個(gè)數(shù)量級(jí)(109～101copies/μL)的陽(yáng)性參考質(zhì)粒作為檢測(cè)模板,分別進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增和EvaGreen qPCR擴(kuò)增。

普通PCR擴(kuò)增使用GeneStar 2×Taq PCR StarMix預(yù)混酶,反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)變性94℃ 2 min;變性94℃ 30 s;退火57℃ 30 s;延伸72℃ 30 s,變性、退火、延伸程序進(jìn)行30個(gè)循環(huán);終延伸72℃ 5 min。

EvaGreen qPCR使用本研究?jī)?yōu)化后方法進(jìn)行擴(kuò)增,每個(gè)數(shù)量級(jí)皆設(shè)置3個(gè)組內(nèi)重復(fù),結(jié)果由Roche LightCycler?480ⅡqPCR儀器自帶軟件生成分析。

1.10 EvaGreen qPCR檢測(cè)方法的特異性檢驗(yàn)為驗(yàn)證本研究所建方法的特異性,提取CDV、CPV、CIV、FPV、FCV、CAV2、CCoV、CPIV、犬鉤端螺旋體C-51株和黃疸出血型鉤端螺旋體NADL株以及大腸桿菌菌株的核酸作為模板,使用本研究?jī)?yōu)化后方法進(jìn)行檢測(cè),每個(gè)病原體的檢測(cè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)組內(nèi)重復(fù),結(jié)果由RocheLightCycler?480ⅡqPCR儀器自帶軟件生成分析。

1.11 EvaGreen qPCR檢測(cè)方法使用優(yōu)化后的CanineCV EvaGreen qPCR檢測(cè)方法對(duì)114份犬血清樣本以及63份肛拭子臨床樣本總核酸進(jìn)行檢測(cè),以基因組DNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增,使用本研究?jī)?yōu)化后方法進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果由Roche LightCycler?480ⅡqPCR儀器自帶軟件生成分析。

2 結(jié)果

2.1 EvaGreen qPCR陽(yáng)性參考質(zhì)粒的構(gòu)建以CanineCV-DG為模板,使用qPCR-F/R引物可擴(kuò)增出目的片段,并將其連接在pMD18-T克隆載體上,構(gòu)建陽(yáng)性參考質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。圖1為陽(yáng)性參考質(zhì)粒的菌液PCR鑒定結(jié)果,可見(jiàn)明亮清晰的217 bp單一條帶,位置與陽(yáng)性對(duì)照一致,說(shuō)明陽(yáng)性參考質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 EvaGreen qPCR檢測(cè)方法的優(yōu)化通過(guò)優(yōu)化引物濃度、退火溫度來(lái)確定EvaGreen qPCR檢測(cè)CanineCV的最佳條件。經(jīng)對(duì)反應(yīng)體系的優(yōu)化后確定最佳退火溫度為58℃、最佳引物濃度為300 nmol/L。

最終確定EvaGreen qPCR檢測(cè)反應(yīng)體系(表2)和反應(yīng)程序:預(yù)變性95℃ 30 s;變性95℃ 5 s;退火58℃ 20 s,變性、退火程序進(jìn)行45個(gè)循環(huán);熔解曲線程序?yàn)?5℃ 15 s;58℃ 1 min;95℃延伸。結(jié)果結(jié)合擴(kuò)增曲線和Cp值一起判讀,如果擴(kuò)增曲線高于軟件根據(jù)背景熒光產(chǎn)生的閾值線,則認(rèn)為檢測(cè)的樣本為陽(yáng)性。

表2 EvaGreen qPCR檢測(cè)反應(yīng)體系

2.3 EvaGreen qPCR檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線將陽(yáng)性參考質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋,獲得3.88×103～3.88×109copies/μL的陽(yáng)性參考質(zhì)粒,以此作為模板,在最優(yōu)退火溫度58℃和最優(yōu)引物濃度300 nmol/L條件下進(jìn)行EvaGreen qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。擴(kuò)增曲線(圖2),標(biāo)準(zhǔn)曲線圖由羅氏LightCycler?480 Ⅱ儀器自帶軟件分析生成(圖3),標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)出良好的線性回歸,縱坐標(biāo)y為Cp值,橫坐標(biāo)x為標(biāo)準(zhǔn)樣本拷貝數(shù)科學(xué)計(jì)數(shù)法因數(shù)10的對(duì)數(shù),建立的回歸方程為y=-3.457x+41.460,擴(kuò)增效率Efficiency=1.946,誤差值Error=0.010 8。利用GraphPad Prism8.0.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,得到相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5,說(shuō)明該線性回歸模型具有較好的擬合性。

A～G.3.88×109～3.88×103 copies/μL的陽(yáng)性參考質(zhì)粒

圖3 EvaGreen qPCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 EvaGreen qPCR檢測(cè)方法的靈敏度將陽(yáng)性參考質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋,得到3.88×109～3.88×101copies/μL的陽(yáng)性參考質(zhì)粒,以此作為模板進(jìn)行靈敏度檢測(cè)。首先進(jìn)行普通PCR的檢測(cè),普通PCR檢測(cè)的檢測(cè)極限為3.88×103copies/μL(圖4)。在最優(yōu)退火溫度和最優(yōu)引物濃度條件下進(jìn)行EvaGreen qPCR檢測(cè),其檢測(cè)極限為3.88×101copies/μL(圖5)。

圖4 陽(yáng)性參考質(zhì)粒PCR靈敏度瓊脂糖凝膠電泳圖

A～I(xiàn).3.88×109～3.88×101 copies/μL的陽(yáng)性參考質(zhì)粒

2.5 EvaGreen qPCR檢測(cè)方法的重復(fù)性使用濃度為3.88×105,3.88×106,3.88×107copies/μL的陽(yáng)性參考質(zhì)粒作為模板,進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。每次每組包含3次技術(shù)性重復(fù)。組內(nèi)重復(fù)和組間重復(fù)s值小,且CV均小于2%,說(shuō)明組內(nèi)重復(fù)和組間重復(fù)Cp值數(shù)據(jù)離散程度小,重復(fù)性好,可信度高(表3)。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)Cp值分析(n=3)

2.6 EvaGreen qPCR檢測(cè)方法的特異性采用本研究建立的CanineCV EvaGreen qPCR檢測(cè)方法,使用CDV、CPV、CIV、FPV、FCV、CAV2、CCoV、CPIV、犬鉤端螺旋體C-51株和黃疸出血型鉤端螺旋體NADL株以及大腸桿菌菌株的核酸作為模板進(jìn)行檢測(cè),驗(yàn)證本方法的特異性。CanineCV具有清晰的擴(kuò)增曲線和明顯的單一熔解峰,而CDV、CPV、CIV、FPV、FCV、CAV2、CCoV、CPIV、犬鉤端螺旋體C-51株和黃疸出血型鉤端螺旋體NADL株以及大腸桿菌菌株與陰性對(duì)照均未出現(xiàn)清晰的擴(kuò)增曲線和明顯的熔解峰,未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增,說(shuō)明本研究建立的CanineCV EvaGreen qPCR檢測(cè)方法具有良好的特異性(圖6)。

A.擴(kuò)增曲線;B.熔解峰

2.7 EvaGreen qPCR檢測(cè)方法采用本研究建立的CanineCV EvaGreen qPCR檢測(cè)方法對(duì)采集的177份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè),檢出陽(yáng)性樣本共5份,其中也包括本研究前期使用犬腸道病原體多重PCR檢測(cè)出的2個(gè)CanineCV陽(yáng)性樣本。EvaGreen qPCR方法檢出CanineCV的陽(yáng)性率為2.82%(5/177),高于普通PCR檢測(cè)的CanineCV陽(yáng)性率1.13%(2/177)。僅通過(guò)EvaGreen qPCR方法檢出的CanineCV陽(yáng)性樣本中,3及4號(hào)來(lái)自東莞某犬收容所的腹瀉犬肛拭子樣本,5號(hào)來(lái)自東莞某動(dòng)物醫(yī)院的腹瀉犬肛拭子樣本(表4)。

表4 EvaGreen qPCR陽(yáng)性樣本Cp值(n=3)

3 討論

目前,CanineCV在世界多個(gè)國(guó)家均有報(bào)道[2,9-10,12,16-18]。在我國(guó)四川、重慶、黑龍江和廣西等地區(qū)犬中均有CanineCV的陸續(xù)報(bào)道[19-22],可見(jiàn)CanineCV已經(jīng)在我國(guó)廣泛流行。因此,建立一種快速、靈敏、高效、安全的檢測(cè)方法對(duì)CanineCV的感染進(jìn)行監(jiān)測(cè)具有現(xiàn)實(shí)意義。

目前,大多數(shù)研究人員使用SYBR Green染料來(lái)構(gòu)建CanineCV的qPCR檢測(cè)方法,SYBR Green染料可以顯示出很強(qiáng)的熒光信號(hào),但已有研究證實(shí)SYBR Green Ⅰ染料會(huì)抑制PCR反應(yīng),可定量的擴(kuò)增區(qū)域有限,且檢測(cè)的重復(fù)性低于其他染料[26]。EvaGreen染料是一種新型綠色熒光核酸染料,與SYBR Green染料相比,EvaGreen染料對(duì)PCR擴(kuò)增的抑制作用較小,不易引起非特異性擴(kuò)增,且穩(wěn)定性強(qiáng)[13]。

CanineCV的Rep基因與Cap基因相比,變異程度小、更加保守[3],理論上基于Rep基因所建立的qPCR方法比基于Cap基因建立的方法更高效實(shí)用。所以,本研究通過(guò)比對(duì)GenBank上所有CanineCV的Rep基因中的高保守區(qū),在此區(qū)域設(shè)計(jì)1對(duì)引物,建立檢測(cè)CanineCV的EvaGreen qPCR方法。

本方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)出較高擬合性的線性回歸。熔解曲線分析表明該方法可擴(kuò)增出特定產(chǎn)物,可作為檢測(cè)CanineCV的可靠工具。CanineCV更容易出現(xiàn)與其他病原體混合感染的情況[27],因此高特異性是其檢測(cè)的必須要素。結(jié)果表明,該方法對(duì)CDV、CPV、CIV、CPIV、CAV2、CCoV等犬常見(jiàn)病原的檢測(cè)均無(wú)交叉反應(yīng),特異性良好。與基于SYBR Green染料的CanineCV的qPCR檢測(cè)方法相比[19],EvaGreen具有更加優(yōu)異的特異性熔解曲線,說(shuō)明該方法特異性更高,避免了病毒含量低時(shí),檢測(cè)結(jié)果與引物二聚體以及其他病原體影響造成的假陽(yáng)性結(jié)果混淆。

應(yīng)用本研究構(gòu)建的EvaGreen qPCR方法,對(duì)114份犬血清及63份肛拭子樣品進(jìn)行了二次篩查,結(jié)果EvaGreen qPCR方法檢出CanineCV的陽(yáng)性率為2.82%(5/177),除了犬腸道病原體多重PCR方法檢測(cè)出的2份陽(yáng)性樣本外,另有3份分別來(lái)自東莞某犬收容所的2份腹瀉犬肛拭子樣本,及東莞某動(dòng)物醫(yī)院提供的1份腹瀉犬肛拭子樣本,且這3份樣本均混合感染了CPV。通過(guò)檢測(cè)可以看出本研究建立的EvaGreen qPCR方法檢出下限低于犬腸道病原體多重PCR方法,很好地解決了病毒粒子拷貝數(shù)低時(shí)檢出率低的問(wèn)題。

綜上,本研究成功建立了一種用于快速檢測(cè)CanineCV的EvaGreen qPCR方法,該方法使用安全且具有較好的特異性、敏感性和重復(fù)性,可作為CanineCV感染的檢測(cè)工具。