伊立超,郝嘉翼,鄒萬(wàn)成,李樂(lè)天,姜宇航,張 爽,婁安鋼,李 昌*,金寧一*

(1.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133000;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 長(zhǎng)春獸醫(yī)研究所,吉林 長(zhǎng)春 130122;3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院/動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130118)

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是尼多病毒目(Nidoviridae)、冠狀病毒科(Coronaviridae)的α冠狀病毒屬成員,能夠引起新生仔豬急性腹瀉、嘔吐、脫水甚至死亡。PEDV表面具有1個(gè)18～23 nm纖突的囊膜結(jié)構(gòu),纖突呈花瓣?duì)?由核心向四周呈放射狀分布,纖突末端呈球狀;病毒直徑為95～190 nm,是一種單股正鏈、不分節(jié)段RNA病毒。PEDV基因組大小約為28 kb,含有7個(gè)開(kāi)放閱讀框,分別編碼大小為150 ～ 220 kDa的病毒纖突糖蛋白(S)、20～30 kDa的基質(zhì)蛋白(M)、7 kDa的主要嵌膜蛋白(E)、58 kDa的核衣殼蛋白(N)與其他蛋白。病毒表面的纖突蛋白(spike,S)具有介導(dǎo)細(xì)胞附著和膜融合的作用[1]。某些哺乳動(dòng)物冠狀病毒的S蛋白能被相關(guān)的蛋白酶切割成S1和S2;S1具有受體結(jié)合位點(diǎn),S2具有融合活性。S1區(qū)內(nèi)318～510氨基酸殘基可與ACE2[2-4]的肽酶域緊密結(jié)合。該片段為受體結(jié)合區(qū)(receptor-binding domain,RBD),是決定病毒-受體相互作用的關(guān)鍵序列,也決定著病毒的宿主范圍和嗜性[5]。目前預(yù)防豬流行性腹瀉(PED)的疫苗常用甲醛氫氧化鋁滅活苗,但疫苗株與近期流行株同源性較低,能保護(hù)仔豬免受PEDV流行株感染的高效廉價(jià)的疫苗需求更加迫切[6]。為此,本課題組前期針對(duì)高發(fā)的GⅡ-a型流行株豬PEDV的纖突蛋白中的受體結(jié)合區(qū)(receptor-binding domain,RBD),應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建并表達(dá)了PEDV-RBD基因[7],研究擬通過(guò)仔豬試驗(yàn),分析其免疫原性,為PED亞單位疫苗研制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒與主要試劑SF9懸浮細(xì)胞系與PEDV(GenBank:OM814174.1)由本實(shí)驗(yàn)室保存;P3代重組桿狀病毒(PEDV-RBD和pFastBacTMDual空載體)、PEDV-RBD蛋白(哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)制備,質(zhì)量濃度為0.75 g/L)、PEDV-RBD多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存[7];ImjectTMAlum佐劑購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;雙倍分子佐劑由南通海泰生物科技有限公司林旭埜博士惠贈(zèng);CpG序列由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì),南京金斯瑞生物科技有限公司合成;HRP標(biāo)記的山羊抗豬IgG購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司;SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、豬外周血淋巴細(xì)胞分離液試劑盒購(gòu)自天津?yàn)笊锟萍加邢薰?APC-CD3+、FITC-CD4+、PE-CD8+抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 動(dòng)物3周齡斷乳仔豬購(gòu)自吉林省金泰美迪生物技術(shù)有限公司。

1.3 重組亞單位疫苗大量制備將P3代重組桿狀病毒按照10 MOI接種到細(xì)胞密度為2×106個(gè)/mL的SF9懸浮細(xì)胞中,48 h收獲細(xì)胞培養(yǎng)物,680 ×g離心10 min,收取上清。將1.2 L上清用超速離心機(jī)50 000 ×g離心2 h,棄上清,用6 mL PBS重懸沉淀。取20 μL用于鑒定和定量,其余分裝凍存于-80℃冰箱。

1.4 目的蛋白的定量將重懸的沉淀按照體積比4∶1于SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)充分混合后煮沸10 min與哺乳動(dòng)物表達(dá)的已知濃度PEDV-RBD蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時(shí)進(jìn)行SDS-PAGE電泳之后,將蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上,以1∶1 000 稀釋的PEDV-RBD多克隆抗體為一抗,1∶5 000 稀釋的山羊抗鼠IgG為二抗,進(jìn)行Western blot鑒定,重復(fù)3次。將Western blot結(jié)果進(jìn)行灰度值分析,根據(jù)上樣體積,按照公式:(標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度×上樣體積)/標(biāo)準(zhǔn)蛋白灰度值=(目的蛋白濃度×上樣體積)/目的蛋白灰度值,計(jì)算目的蛋白濃度[8]。

1.5 仔豬免疫試驗(yàn)設(shè)置3組,每組5只3周齡仔豬。RT-PCR方法(引物序列F:5′-ACTCTTCT-AGCTGGTACTGTGGC-3′;R:5′-ATCCTGCAA-AGCTGGAATGGC-3′,目的條帶大約300 bp)篩選PEDV核酸陰性,間接ELISA方法篩選PEDV血清抗體陰性的仔豬。候選疫苗組仔豬頸部三角肌注射免疫原含量為500 μg,佐劑為ImjectTMAlum+雙倍分子佐劑+500 μg CpG,與免疫原1∶1體積比混合振蕩乳化10 min;pFastBacTMDual空載體上清和佐劑對(duì)照組為免疫對(duì)照組。首免后3周加強(qiáng)免疫,每周采血,分離血清保存待檢。

1.5.1仔豬體溫與體質(zhì)量監(jiān)測(cè) 每2 d測(cè)量仔豬體溫和體質(zhì)量,通過(guò)統(tǒng)計(jì)仔豬體溫和體質(zhì)量變化,分析亞單位疫苗及佐劑的安全性。

1.5.2特異性抗體檢測(cè) 利用間接ELISA方法檢測(cè)特異性抗體水平。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室建立的間接ELISA方法(數(shù)據(jù)待發(fā)表),血清稀釋度為1∶400,二抗稀釋度為1∶5 000,按照基本步驟檢測(cè)仔豬血清特異性抗體[9]。

1.5.3中和抗體檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[10]檢測(cè)中和抗體水平。將滅活的血清從1∶2稀釋至1∶1 024,每孔加200 TCID50PEDV,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱反應(yīng)1 h,每孔加入約1×104個(gè)Vero細(xì)胞,置于培養(yǎng)箱2～3 d,觀察細(xì)胞病變情況。

1.5.4流式細(xì)胞術(shù)分析 免疫后32 d,采集仔豬血液,利用豬外周血淋巴細(xì)胞分離液試劑盒分離仔豬淋巴細(xì)胞,用RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整淋巴細(xì)胞數(shù)量為1×106個(gè)/mL,用抗豬APC-CD3+、FITC-CD4+、PE-CD8+染色孵育后利用流式細(xì)胞術(shù)分析CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞水平。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析仔豬血清中特異性IgG水平、中和抗體水平,仔豬體溫和體質(zhì)量及CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞水平檢測(cè)所得數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 9.3.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,樣本間顯著性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 免疫原的定量將標(biāo)準(zhǔn)蛋白與制備的目的蛋白同時(shí)進(jìn)行Western blot鑒定(圖1),將顯影的條帶進(jìn)行灰度值分析,重復(fù)3次,按照公式計(jì)算目的蛋白的質(zhì)量濃度,經(jīng)計(jì)算目的蛋白的質(zhì)量濃度為1.02 g/L。

M.蛋白Marker;1.目的蛋白;2.空載體對(duì)照;3.標(biāo)準(zhǔn)蛋白

2.2 仔豬免疫試驗(yàn)

2.2.1陰性仔豬的篩選 選取15頭仔豬,按照順序進(jìn)行編號(hào),根據(jù)實(shí)驗(yàn)室建立的方法進(jìn)行RT-PCR和間接ELISA檢測(cè),選取的仔豬核酸與抗體均為陰性的仔豬進(jìn)行免疫試驗(yàn)。

2.2.2仔豬體溫與體質(zhì)量變化 仔豬每2 d測(cè)1次體溫和體質(zhì)量(圖2):圖2A可見(jiàn)仔豬體溫維持在38.5～39.5℃之間,沒(méi)有因?yàn)槊庖叨鴮?dǎo)致體溫的大幅度波動(dòng);圖2B可見(jiàn)各組仔豬體質(zhì)量均保持穩(wěn)定增長(zhǎng),首次免疫后體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢,可能與仔豬進(jìn)食及生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān),之后體質(zhì)量逐漸上升。以上結(jié)果表明,免疫的目的蛋白及添加的佐劑并不影響仔豬的正常生長(zhǎng),安全性較高。

A.仔豬體溫監(jiān)測(cè);B.仔豬體質(zhì)量監(jiān)測(cè)

2.2.3特異性抗體檢測(cè)結(jié)果 仔豬每周采血,分離血清后利用建立的間接ELISA方法進(jìn)行特異性抗體檢測(cè)(圖3)。疫苗組首免后抗體水平只有緩慢上升并很快降低,首免后21 d加強(qiáng)免疫后抗體水平迅速上升至較高水平,28和32 d的免疫組特異性抗體水平顯著高于對(duì)照組。32 d的特異性抗體效價(jià)為1∶12 800。以上結(jié)果表明,目的蛋白能夠誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生特異性抗體。

2.2.4中和抗體檢測(cè)結(jié)果 將仔豬血清56℃滅活30 min,稀釋倍數(shù)從1∶2到1∶2 048,選擇首免后32 d的血清,進(jìn)行中和抗體檢測(cè),PEDV-RBD蛋白組中和抗體效價(jià)中位值為1∶284,最高效價(jià)達(dá)1∶512(圖4)。

2.2.5仔豬外周血淋巴細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果 仔豬21 d加強(qiáng)免疫后,32 d采集仔豬血液10 mL,分離淋巴細(xì)胞后染色,經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞因子CD3+CD4+、CD3+CD8+雙陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞所占比例(圖5)。結(jié)果顯示,PEDV-RBD蛋白組細(xì)胞因子CD3+CD4+雙陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞所占比例略高于空載體對(duì)照組,顯著性高于佐劑對(duì)照組;表明目的蛋白可誘導(dǎo)仔豬CD3+CD4+雙陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞。

A.特異性抗體時(shí)間監(jiān)測(cè);B.特異性抗體效價(jià)

**.P<0.001

*.P<0.05;ns.差異不顯著

3 討論

PEDV是導(dǎo)致仔豬腹瀉和死亡的主要病原體,患病仔豬死亡率可達(dá)100%,對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[11]。國(guó)內(nèi)上市的針對(duì)PEDV的疫苗主要是PEDV和TGEV二價(jià)滅活疫苗[12]。瑞普生物公司進(jìn)行了PED和豬傳染性胃腸炎二聯(lián)活疫苗的中試研究,通過(guò)傳代和克隆技術(shù)純化致弱病毒,一次免疫即可有效預(yù)防PED和豬傳染性胃腸炎2種豬腹瀉病毒病,具有較高的免疫原性[13]。滅活疫苗安全性好,易于生產(chǎn),但滅活過(guò)程中容易發(fā)生突變[14];活疫苗免疫原性高,單次免疫即可誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫應(yīng)答,但弱毒有返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)使其使用受限[15]。亞單位疫苗則被視為最安全的疫苗類型,無(wú)任何傳染性,但有包含保護(hù)性免疫反應(yīng)的基本抗原[16],雖其免疫原性較低,但通過(guò)佐劑或免疫增強(qiáng)劑的融合使用可以增強(qiáng)疫苗的免疫原性[17]。

鋁鹽佐劑是目前應(yīng)用最廣的一種免疫佐劑,主要有氫氧化鋁和磷酸鋁2種,其中氫氧化鋁的使用更廣泛。目前認(rèn)為,鋁佐劑的疫苗佐劑效應(yīng)機(jī)制主要有“儲(chǔ)存庫(kù)效應(yīng)”和“免疫刺激效應(yīng)”2種。“儲(chǔ)存庫(kù)效應(yīng)”即鋁鹽佐劑吸附抗原在接種區(qū)域貯存,緩慢釋放,延長(zhǎng)抗原作用時(shí)間,增強(qiáng)體液免疫;“免疫刺激效應(yīng)”即鋁鹽佐劑在注射部位吸引大量炎性細(xì)胞[18]。添加的鋁鹽佐劑可以提高疫苗免疫原性,并使抗原緩慢釋放,延長(zhǎng)抗體保護(hù)持續(xù)期。CpG基序是未甲基化的寡聚脫氧核苷酸,前期研究發(fā)現(xiàn)CpG基序在體外細(xì)胞水平上能夠促進(jìn)豬免疫細(xì)胞的分裂和生殖[19]。大量學(xué)者對(duì)CpG促進(jìn)豬用疫苗的免疫效力進(jìn)行了研究,證實(shí)CpG序列在豬用疫苗上具有廣泛的應(yīng)用前景[20-21]。

本課題組在前期利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備了PEDV-RBD重組蛋白[7],本研究對(duì)抗原進(jìn)行定量的基礎(chǔ)上,配合鋁鹽佐劑和CpG序列開(kāi)展了仔豬免疫原性評(píng)價(jià)研究。試驗(yàn)結(jié)果表明,與空載體和佐劑對(duì)照組相比,PEDV-RBD蛋白組特異性抗體和中和抗體水平表現(xiàn)顯著性升高,表明重組蛋白有效激發(fā)了仔豬的體液免疫。CD4+T細(xì)胞可分化為多個(gè)亞群,通過(guò)分泌細(xì)胞因子、趨化因子以及募集靶細(xì)胞等在細(xì)胞免疫中發(fā)揮重要作用,可以幫助清除胞內(nèi)病原體,調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),產(chǎn)生記憶細(xì)胞等[22]。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示,PEDV-RBD蛋白組仔豬的CD3+CD4+雙陽(yáng)性細(xì)胞因子略高于空載體對(duì)照組和佐劑對(duì)照組,表明重組蛋白能夠誘導(dǎo)一定的細(xì)胞免疫水平。

綜上所述,本研究成功制備了PEDV-RBD重組蛋白,并免疫了仔豬,證明其有良好的免疫原性。這為進(jìn)一步利用桿狀病毒載體制備亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ),也為利用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行其他冠狀病毒蛋白的免疫研究提供了借鑒和參考。