田廣磊,慈紅波,侯梅華,宋巍,朱兵,陳雄,戈小虎*

靜脈血栓栓塞癥(venous thromboembolism,VTE)包括肺栓塞及深靜脈血栓形成,是一種以肺動脈及深靜脈血管中異常血栓形成為特征的疾病[1]。其病情危重,若未得到及時、恰當?shù)闹委?患者可有生命危險[2],且VTE的后遺癥還會降低患者的生活質(zhì)量[3]。孕婦及剛分娩的女性處于高凝狀態(tài),此時VTE的發(fā)生風險增加,是發(fā)達國家孕產(chǎn)婦死亡的主要原因之一[4]。目前VTE的確切病因仍不清楚,盡管相關(guān)研究顯示創(chuàng)傷、骨折、妊娠及口服避孕藥是VTE的潛在危險因素,但大多數(shù)合并上述風險因素的個體最終不會發(fā)展成VTE,這提示遺傳易感性可能在其發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5-6]。為明確遺傳易感性的作用,對孕產(chǎn)婦血栓相關(guān)基因多態(tài)性及其與VTE風險的相關(guān)性進行分析,現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料及方法

1.1 一般資料

將2016年1月至2018年1月新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院收治的976例適齡孕產(chǎn)婦作為研究對象,根據(jù)研究對象是否確診為遺傳性易栓癥或/和VTE將其分為病例組(330例)及對照組(646例)。診斷標準參照《易栓癥診斷中國專家共識(2012年版)》[7]及《深靜脈血栓形成的診斷和治療指南》[8]制定。納入標準:① 適齡孕產(chǎn)婦;② 年齡20～35歲;③ 單胎妊娠;④ 自然分娩孕婦。排除標準:① 年齡<20歲或>35歲;② 合并嚴重心、肺功能不全;③ 合并肝、腎功能不全者;④ 合并惡性腫瘤、自身免疫系統(tǒng)疾病患者;⑤ 合并靜脈曲張、真性紅細胞增多癥等血液系統(tǒng)疾病;⑥ 原因不明的死胎史和/或復發(fā)性流產(chǎn);⑦ 長期口服避孕藥或激素替代治療;⑧ 合并近期手術(shù)史者;⑨ 合并嚴重精神-神經(jīng)系統(tǒng)疾病者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準,所有研究對象均了解本研究內(nèi)容,并簽署知情同意書。兩組年齡、孕周、孕產(chǎn)史等一般資料比較,病例組吸煙者比例高于對照組(均P<0.05),年齡、孕前BMI等其余情況比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),詳見表1。

表1 匹配前兩組一般資料比較[n(%)]

1.2 方法

1.2.1 傾向性評分匹配 根據(jù)未匹配前病例組和對照組的臨床資料,使用R語言Matching軟件包進行傾向性評分匹配。首先求得每個觀測的各協(xié)變量的綜合傾向性得分,按照傾向性得分是否接近進行1∶1匹配,以分組變量為因變量,其他影響結(jié)果的混雜因素為協(xié)變量構(gòu)建Logistic回歸模型,計算每個觀測的VTE風險得分,根據(jù)擬合回歸模型計算每個個體的傾向指數(shù)(范圍0～1),反映個體被分到試驗組的改良,設置卡鉗值(最優(yōu)卡鉗值為0.02,0.03或傾向性評分值經(jīng)Logistic轉(zhuǎn)換后標準差的20%),按照得分大小進行匹配,之后對匹配后兩組實驗室等指標進行對比分析。

1.2.2 血栓相關(guān)基因多態(tài)性比較 經(jīng)傾向性評分匹配后,比較兩組人群凝血酶原基因rs3136447、rs5896位點及AnxA5基因rs1050606位點基因型及等位基因,并采用Logistic回歸模型對不同基因型及等位基因與VTE的相關(guān)性進行分析,并比較不同基因型VTE患者相關(guān)指標的差異。

1.3 觀察指標

所有患者均于納入研究的次日抽取空腹靜脈血,離心取上層血漿用于實驗室相關(guān)指標檢測,下層紅細胞及白細胞置于-80℃環(huán)境保存,用于提取基因組DNA及后續(xù)研究,采用Sequenom Massarray檢測技術(shù)進行基因分型。

抽取研究對象3 mL空腹靜脈血,置于3.2%的檸檬酸鈉抗凝管中,離心處理15 min(3 000 r/min),取上層血漿置于Eppendorf管中,置于-80℃環(huán)境中保存待檢,檢測前用37℃水浴解凍。采用發(fā)色底物法檢測抗凝血酶Ⅲ(antithrombin,AT-Ⅲ)及蛋白C(protein C,PC)活性,采用凝固法檢測蛋白S(protein S,PS)活性?；罨鞍證抵抗(activated protein C resistance,APC-R)用APCR敏感率量化,即APCR-SR=(APTT+APC)/(APTT-APC),采用全自動血凝儀(CA-7000型,日本Sysmex公司)測定常規(guī)活化部分凝血酶時間(APTT)即(APTT-APC),APTT+APC為添加活化蛋白C(APC)的APTT測定,其中APC濃度為3 mg/L。采用循環(huán)酶法檢測同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)水平,儀器為全自動生化分析儀(AU5821型,美國貝克曼庫爾特公司)。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 病例匹配情況

采用最臨近匹配法,匹配比例1∶1,卡鉗值設為0.02,以病例組為基準組進行匹配,兩組共162對匹配成功,在兩組間的協(xié)變量經(jīng)匹配后均達到平衡,經(jīng)傾向性評分匹配后協(xié)變量的均衡性得到了明顯提高(P>0.05)。詳見表2。

表2 匹配后兩組一般資料比較[n(%)]

2.2 兩組實驗室指標比較

病例組患者的AT-Ⅲ、PC、PS及APCR-SR活性低于對照組,Hcy水平高于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),詳見表3。

表3 兩組實驗室指標比較

2.3 兩組血栓相關(guān)基因位點基因型及等位基因比較

兩組人群rs3136447及rs5896位點基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而兩組患者rs3136447、rs5896等位基因頻率及rs1050606位點基因型頻率、等位基因頻率比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),詳見下頁表4。

2.4 血栓相關(guān)基因多態(tài)性及等位基因與VTE的相關(guān)性分析

Logistic回歸分析示FII基因rs3136447及rs5896位點基因型與VTE無明顯相關(guān)性(均P>0.05),而rs3136447等位基因為T(OR=0.496,P=0.004)及rs5896等位基因為C(OR=0.314,P<0.001)則是VTE的獨立保護因素;AnxA5基因rs1050606位點GG基因型(OR=2.803,P=0.024)及rs1050606位點G突變(OR=1.573,P=0.012)是VTE的獨立危險因素,詳見下頁表5。

表5 血栓相關(guān)基因多態(tài)性及等位基因與VTE的相關(guān)性分析

3 討論

VTE是因靜脈血異常凝結(jié),導致靜脈回流障礙所引起的疾病,表現(xiàn)為患肢疼痛、腫脹及呼吸困難等,是產(chǎn)后嚴重并發(fā)癥之一[9]。臨床及遺傳因素都有導致VTE的可能,大量研究表明,癌癥、口服避孕藥、高BMI等臨床因素會顯著增加VTE發(fā)生風險[10-11],但超過60%的VTE風險歸咎于遺傳因素[12]。

凝血酶原(因子II)是一種維生素K依賴性糖蛋白,由FII基因編碼,激活后轉(zhuǎn)化為凝血酶(因子IIa),參與凝血過程[13-14]。VTE是蛋白質(zhì)分化或功能缺陷的結(jié)果,包括PC和PS,并已確定約8個人類基因的突變是致病原因[15],FII基因3′非翻譯區(qū)的突變G20210A是公認的易栓癥危險因素[16-17]。本研究結(jié)果顯示,孕產(chǎn)婦VTE的發(fā)生可能與FII基因rs3136447、5896及AnxA5基因rs1050606位點基因多態(tài)性相關(guān)。

rs5896編碼氨基酸位于凝血酶原K1區(qū)內(nèi),而K1區(qū)參與凝血酶(原)與其底物及輔因子間的相互作用,在機體凝血過程中扮演了重要角色[18]。既往研究證實,rs5896位點編碼的165位氨基酸與其他維生素K依賴的凝血酶原相比較,具有高度保守性,據(jù)此推測165位的氨基酸殘基與凝血酶原功能之間關(guān)系密切[19]。而rs5896位點上C>T的基因突變可使該位點的蘇氨酸被甲硫氨酸取代,無法與180位的谷氨酸形成正常氫鍵,引起蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)及功能改變,從而導致蛋白編碼異常,出現(xiàn)VTE[20]。rs3136447參與纖維蛋白凝血酶的合成過程,通過活化PC調(diào)節(jié)機體凝血過程,本研究結(jié)果顯示rs3136447位點C>T的基因突變與VTE的發(fā)生密切相關(guān),這可能與rs3136447位點基因多態(tài)性改變,導致凝血酶原活性及其下游因子凝血因子V的水平改變,從而出現(xiàn)PC拮抗,使凝血酶原復合物及凝血酶水平升高,最終導致機體處于高凝狀態(tài),從而發(fā)生血栓[21]。

血液凝固需凝血因子的配合,而凝血因子則需要磷脂輔助,方可形成相應的復合物,磷脂酰絲氨酸是至關(guān)重要的磷脂輔助因子,而AnxA5則是具有高度磷脂親和力的蛋白,當組織受到創(chuàng)傷性損傷時大量釋放,與磷脂形成二維的晶體結(jié)構(gòu),發(fā)揮抗凝血作用[13-14]。當ANXA5基因產(chǎn)生變化時,其結(jié)構(gòu)功能變化,無法與活化的血小板膜表面的磷脂酰絲氨酸結(jié)合形成三聚體,導致二維晶體結(jié)構(gòu)無法聚合,使其屏障層消失,無法將其他促凝因子隔開,使纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白過程激活,從而出現(xiàn)血栓[15]。

本研究結(jié)果顯示AnxA5基因rs1050606位點攜帶G基因是VTE的獨立危險因素。啟動子是調(diào)節(jié)AnxA5基因表達調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié),當rs1050606位點的胸腺嘧啶核苷酸(T)被鳥嘌呤核苷酸(G)所替代,可使ANXA5的轉(zhuǎn)錄活性降低,從而影響磷脂酰絲氨酸的表達,使其抗凝集屏蔽作用混亂,導致血栓形成,進而誘發(fā)VTE。而AnxA5基因rs1050606位點GG型基因則更易發(fā)生VTE。

綜上,本研究結(jié)果顯示孕產(chǎn)婦VTE的發(fā)生與孕婦體內(nèi)血栓相關(guān)基因多態(tài)性相關(guān),對于存在上述基因多態(tài)性的妊娠女性,應結(jié)合患者家族及個人史、既往臨床前因、相關(guān)病理及對現(xiàn)有危險因素等進行綜合評估,以分析此次妊娠期間出現(xiàn)血栓的風險,適度增加產(chǎn)檢次數(shù)及必要的檢查項目,盡早干預,逆轉(zhuǎn)危險因素,降低血栓發(fā)生風險[15]。隨著基因?qū)W研究的不斷深入,可對影響血栓發(fā)生的基因作為靶點進行干預,為臨床干預提供新的治療思路。本研究并未對其基因突變的影響因素進行探究,故應行大樣本、多中心的試驗進一步探究地域、人群及飲食習慣等個體差異對基因多態(tài)性的影響,并對基因多態(tài)性的編碼及其下游影響因子進行分析,以便為臨床干預提供理論依據(jù)。