張為粼 孫樂樂 暴芳芳 于功奇 王真真 王 川 楊 青 劉 紅 張福仁

山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院(山東省皮膚病醫(yī)院),山東省皮膚病性病防治研究所,濟(jì)南,250022

鐮刀菌(Fusarium)主要是植物致病真菌,存在于土壤和植物中,也可致人類感染,屬于條件致病菌[1,2],分為局限性和播散性,局限性感染主要見于真菌性角膜炎[3];目前報(bào)道的可感染皮膚的鐮刀菌有茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)和尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)等[4],輪枝鐮刀菌感染的病例相對(duì)少見,且未見由基因缺陷導(dǎo)致感染的報(bào)道。本文報(bào)道1例患者,并對(duì)國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的12例局限性輪枝鐮刀菌感染病例[5-16]進(jìn)行文獻(xiàn)復(fù)習(xí)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患者,女,41 歲。面部皮膚斑塊 25 年,伴癢?；颊?5年前無明顯誘因于右側(cè)面頰部出現(xiàn)紅色斑塊逐漸擴(kuò)大至前額及左面頰,夏季減輕,冬季加重,伴瘙癢,于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院按真菌感染及結(jié)核感染治療無效。體格檢查: 系統(tǒng)檢查未見異常。皮膚科檢查: 皮損分布于左右面頸部,浸潤(rùn)性紅色斑塊,右側(cè)面頰可見一萎縮性瘢痕(圖1)。血常規(guī)、肝腎功能未見明顯異常。非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculosis mycobacteria, NTM)qPCR陰性。皮損組織病理示: (面部)表皮假上皮瘤樣增生,真皮中上層較多組織細(xì)胞、巨細(xì)胞、漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),少許中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞。過碘酸希夫(periodic acid-schiff staining,PAS)染色:見較多圓形孢子(圖2)?？顾崛旧?抗酸菌陰性。

圖1 1a、1b:左右面頸部浸潤(rùn)性紅色斑塊;1c:右側(cè)面頰可見一萎縮性瘢痕

圖2 2a:表皮假上皮瘤樣增生,真皮中上層較多組織細(xì)胞、巨細(xì)胞、漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),少許中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞(HE,×40);2b:PAS染色見較多圓形孢子(×400)

根據(jù)臨床表現(xiàn)和病理檢查考慮感染性肉芽腫,為進(jìn)一步診治,遂進(jìn)行菌種培養(yǎng)及測(cè)序,以及宿主的外顯子測(cè)序工作,以進(jìn)一步明確致病基因。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)和鑒定方法描述 將新鮮皮膚組織塊剪碎分別接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Sabouraud Dextrose Agar ,SDA)27℃和血瓊脂平板(Blood Agar, BA)35℃ 進(jìn)行真菌及細(xì)菌培養(yǎng)15天。光鏡下觀察初步判斷為真菌感染后,分別轉(zhuǎn)種至大平皿SDA27℃培養(yǎng)25天和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar,PDA)27℃培養(yǎng)20天,小培養(yǎng)2天后進(jìn)行棉藍(lán)染色。提取菌落DNA,應(yīng)用使用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1(internal transcribed spacer 1,ITS1)和ITS4引物進(jìn)行PCR和測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果在NCBI Genebank及Westerdijk Fungal Biodiversity Institute(https://wi.knaw.nl/page/Pairwise_alignment)中進(jìn)行比對(duì)。

1.2.2 全外顯子測(cè)序及Sanger測(cè)序 基因組DNA經(jīng)Bioruptor Pico超聲破碎儀隨機(jī)打斷成長(zhǎng)度為150～200 bp的片段進(jìn)行建庫,構(gòu)建濃度大于25 ng/μL的文庫。使用Illumina NovaSeq 6000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。利用FastQC進(jìn)行質(zhì)控。使用BWA v0.7.17軟件將測(cè)序結(jié)果與人類基因組參考序列(hg19版本)進(jìn)行比對(duì), GATK v4.0.12.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步過濾。然后使用ANNOVAR軟件對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行注釋,篩選在已知真菌感染相關(guān)的基因[17]上是否有罕見有害突變。

利用Sanger測(cè)序?qū)θ怙@子測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。利用網(wǎng)頁工具primer-blast(www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)進(jìn)行引物設(shè)計(jì),合成引物(華大基因科技有限公司,北京)。使用9700型PCR擴(kuò)增儀(美國(guó) ABI 公司)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)對(duì)相應(yīng)基因相應(yīng)的外顯子進(jìn)行擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),并通過醋酸鈉乙醇沉淀法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。進(jìn)行測(cè)序PCR反應(yīng),并利用3500XL基因分析儀(美國(guó)ABI公司)對(duì)純化后的測(cè)序PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 檢查結(jié)果 光鏡下見透明分隔菌絲,未見孢子(圖3a)。SDA培養(yǎng)見白色棉絮狀菌落(圖3b)。轉(zhuǎn)種大平皿SDA及PDA培養(yǎng)均見白色棉絮狀菌落(圖3c、3d)。小培養(yǎng)2天棉藍(lán)染色見透明分隔、銳角分支菌絲,未見孢子(圖3e)。

圖3 3a:光鏡下見透明分隔菌絲,未見孢子(×40);3b:組織塊SDA培養(yǎng),見白色棉絮狀菌落;3c:組織塊菌落轉(zhuǎn)種大平皿SDA培養(yǎng),見白色棉絮狀菌落;3d:組織塊菌落轉(zhuǎn)種大平皿PDA培養(yǎng),見白色棉絮狀菌落;3e:小培養(yǎng)2天棉藍(lán)染色見透明分隔菌絲,未見孢子(×400)

培養(yǎng)分離真菌ITS區(qū)PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果比對(duì)發(fā)現(xiàn)與輪枝鐮刀菌(Fusariumverticillioides)ITS區(qū)序列(AY188916.1)完全吻合(圖4a)。全外顯子測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者在CARD9基因上攜帶罕見純合致病移碼突變(c.820_821insG,p.D274Gfs*61),已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,同時(shí)Sanger測(cè)序證實(shí)該位點(diǎn)真實(shí)存在(圖4b)。

圖4 4a:BLAST比對(duì),培養(yǎng)分離真菌ITS區(qū)與輪枝鐮刀菌(Fusarium verticillioides)ITS區(qū)序列(AY188916.1)序列完全吻合;4b:全外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)患者攜帶CARD9基因純合移碼突變(c.820_821insG,p.D274Gfs*61)

2.2 診斷 皮膚輪枝鐮刀菌感染。

2.3 治療及隨訪 伊曲康唑0.2 g/d口服,每日2次,連續(xù)治療3個(gè)月后,皮疹大部分消退。

3 討論

輪枝鐮刀菌屬于子囊菌門下的鐮刀菌屬,有一被廣泛使用的異名串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)[18],現(xiàn)已被建議廢棄[19]。鐮刀菌屬在培養(yǎng)過程中容易發(fā)生變異,是真菌中最難分類鑒定的屬之一,大多數(shù)對(duì)于鐮刀菌屬的感染的鑒定沒有精確到種的水平[4]。通常所說的串珠鐮刀菌是重要的植物致病菌,主要感染玉米等農(nóng)作物,1977年在美國(guó)首次報(bào)道從一名健康男性手上的膿皰中分離出來[20]。通過培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)特征表現(xiàn)多樣,目前的研究表明,在這個(gè)類群中至少存在50個(gè)以上的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)種,因此,采用真菌培養(yǎng)的方法通常不能明確區(qū)分出所謂的“串珠鐮刀菌”[19]。分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)于菌種鑒定的準(zhǔn)確性較高,本例患者通過對(duì)培養(yǎng)分離真菌進(jìn)行ITS區(qū)PCR產(chǎn)物測(cè)序,最終確定致病菌為輪枝鐮刀菌。

既往報(bào)道為串珠鐮刀菌局限性皮膚感染的包括本例在內(nèi)共有13例患者[5-16],皮損可呈現(xiàn)紅斑、潰瘍、結(jié)節(jié)等多種表現(xiàn)。根據(jù)年齡、皮損部位、流行病學(xué)、免疫狀態(tài)、皮損形態(tài),可大致分為兩類人群(表1):一類為老年人,病程可長(zhǎng)達(dá)10年以上,皮損發(fā)生于四肢尤其是遠(yuǎn)端暴露部位如足部、手部,下肢較上肢多見,多從事體力勞動(dòng),發(fā)病前多可追溯到外傷史及土壤和農(nóng)作物接觸史,多無明顯免疫功能缺陷;一類為兒童青少年,病程通常不足1年,皮損發(fā)生于面部,流行病學(xué)及外傷史常不明確,存在結(jié)核分枝桿菌、念珠菌感染,提示可能存在免疫缺陷。本例患者16歲發(fā)病,病程長(zhǎng)達(dá)25年,應(yīng)考慮到免疫缺陷的可能。

表1 局限性皮膚串珠鐮刀菌感染13例分析匯總

在近年來的研究中, 腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)和干擾素-γ(interferon-gamma,IFN-γ)等炎癥因子基因的突變、抗原識(shí)別受體基因的缺失、T細(xì)胞功能缺陷等,這些基因缺陷會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的免疫反應(yīng)降低,從而增加宿主感染深部真菌的風(fēng)險(xiǎn)。白介素17(interleukin ,IL-17)在深部真菌感染中起著重要的作用,其通過刺激粒細(xì)胞增生和黏附,幫助機(jī)體抵御病原體侵襲[21]。本例患者通過全外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)了CARD9基因純合移碼突變(c.820_821insG,p.D274Gfs*61)。胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase recruitment domain-containing protein9, CARD9) 是來自CARD蛋白家族的細(xì)胞內(nèi)銜接蛋白, 主要由髓系細(xì)胞表達(dá)[22],CARD9的缺陷會(huì)導(dǎo)致輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17,Th17)免疫缺陷,進(jìn)而導(dǎo)致中性粒細(xì)胞對(duì)真菌的殺傷缺陷[23]。

不同的CARD9突變存在明顯的地理分布和表型差異,一項(xiàng)對(duì)60例具有24種不同CARD9突變和不同真菌感染的患者的研究表明,p.D274Gfs*61(c.820_821insG)突變較為常見,占所有患者的8.1%,占亞洲病例的17.2%[24],相較于其他突變,p.D274Gfs*61(c.820_821insG)突變更容易引起局限性皮膚真菌感染[23]。目前所有病例均來自國(guó)內(nèi)[25],主要引起暗色真菌導(dǎo)致的暗色絲孢霉病和著色芽生菌病[26-28],其他感染包括阿薩希毛孢子菌(Trichosporonasahii)[23,25]、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)[29]、孢子絲菌復(fù)合體(Sporothrixschenckiicomplex)[30]、白色念珠菌(Candidaalbicans)[31],本文為首例局限性輪枝鐮刀菌皮膚感染伴有CARD9基因缺陷的病例。綜上,病程較長(zhǎng)的慢性真菌感染,要考慮宿主遺傳缺陷的問題。

本病治療呈慢性過程,既往報(bào)道的治療時(shí)長(zhǎng)7～135天不等,基本可獲得痊愈。研究表明鐮刀菌對(duì)不同藥物的敏感性存在種間差異[32],體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果與臨床轉(zhuǎn)歸不完全一致,局限性鐮刀菌感染常用唑類藥物[33]。盡管伊曲康唑的MIC相對(duì)較高,但是口服伊曲康唑配合外用藥物是針對(duì)本病臨床上最常見且效果較好的治療方案[34]。本例患者采取伊曲康唑口服治療,取得好轉(zhuǎn)。

綜上,我們首次報(bào)道了鐮刀菌屬真菌感染伴CARD9缺陷的病例, 豐富了CARD9缺陷疾病的表型譜。對(duì)局限性皮膚輪枝鐮刀菌感染的包括外傷史和免疫狀態(tài)在內(nèi)的發(fā)病特點(diǎn)和易感人群進(jìn)行了總結(jié),也體現(xiàn)了真菌ITS區(qū)測(cè)序?qū)τ谛螒B(tài)學(xué)檢查不典型的病例的確診及及時(shí)治療所具有的重要價(jià)值。