袁濤　劉向銅　賈美玉　陳井影　余小霞　盧斌宇　張艷梅　雷冰

摘要 從江西東鄉(xiāng)野生稻自然保護(hù)區(qū)野生稻（Oryza sativa L.）植株中分離獲得1株固氮菌株Y3，通過16S rRNA和基因組系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定為Kosakonia sacchari。生理生化和促生試驗(yàn)表明，Y3對重金屬Cu²⁺、Ni²⁺、Co²⁺和Zn²⁺具有較好的耐受性，Cd²⁺的耐受濃度達(dá)到200 μg/mL，同時具有固氮和產(chǎn)鐵載體的功能?；蚪M注釋和比較基因組學(xué)分析顯示，Y3基因組大小為5.1 Mb，GC含量53.68％，具有5 140個編碼基因，其中包含74個tRNA基因、8個rRNA基因和4 985個功能蛋白基因；同源基因分析表明，6株Kosakonia sacchari菌株共有3 987個基因簇，其中Y3與其他5株菌株共享4 417個基因簇；比較基因組分析表明，Y3基因組中存在與植物促生作用有關(guān)的鐵載體合成酶和固氮酶相關(guān)基因，以及與Zn²⁺轉(zhuǎn)運(yùn)和Cu²⁺抗性相關(guān)的基因。本試驗(yàn)深入研究了Y3的促生和重金屬耐受性機(jī)制，為更有效地利用其在植物-微生物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染土壤方面提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 Kosakonia sacchari；重金屬耐受性；植物促生性；基因組注釋；比較基因組學(xué)分析

中圖分類號 S182? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）07-0026-08

Isolation， Biological Characteristics and Draft Genome Sequence Analysis of a Plant Growth-promoting Bacteria （PGPB） Y3， a Strain with Multiple Heavy Metal Resistant Property

YUAN Tao LIU Xiangtong JIA Meiyu ?CHEN Jingying YU Xiaoxia ?LU Binyu ?ZHANG Yanmei LEI Bing

（1Key Laboratory of Mine Environmental Monitoring and Improving around Poyang Lake of Ministry of Natural Resources， East China University of Technology， Nanchang Jiangxi 330013;

2College of Water Resources and Environmental Engineering， East China University of Technology， Nanchang Jiangxi 330013;

3School of Surveying and Geoinformation Engineering， East China University of Technology， Nanchang Jiangxi 330013）

Abstract A metal-tolerant strain Y3 was isolated from wild rice （Oryza sativa L.） plants in Dongxiang District of Jiangxi Province and identified as Kosakonia sacchari based on the 16S rRNA gene and genome sequence. Strain Y3 exhibited increased tolerance to heavy metals including Cu²⁺， Ni²⁺， Co²⁺ and Zn²⁺. The bacteria also showed high siderophore-producing and nitrogen-fixing capacity. Based on these important features， the whole genome was sequenced and annotated and a comparative genome analysis was conducted. The total size of the Y3 genome is 5.1 Mb， with a 53.68% GC content and 5 140 coding genes， which contained 4 985 predicted protein-coding genes， 74 tRNA， and 8 rRNA genes. In the Venn diagram， the six Kosakonia sacchari strains had 3 987 clusters and Y3 shared 4 417 clusters with the other five strains. Moreover， genome annotation using the PATRICK database identified several genes that encode nitrogenase and siderophore-producing enzymes involved in plant growth promotion， the presence of genes related to Zn²⁺transportation and Cu2⁺resistance may explain the heavy metals tolerance of strain Y3. The whole-genome analysis of this strain clarified the genetic basis underlying its phenotypic and biochemical characteristics， underpinning the beneficial interaction between Y3 and host plants， and providing a basis for more effective use of it in the phytoremediation of heavy metal-contaminated soil.

Keywords Kosakonia sacchari; heavy metal tolerance; plant growth promotion; genome annotation; comparative genome analysis

Kosakonia屬是2013年從腸桿菌屬（Enterobacter）中重新定義劃分出來的新屬[1]，目前包括9個種。大多數(shù)Kosakonia屬菌株能夠定殖在植物體內(nèi)，是與植物相互關(guān)系較為緊密的內(nèi)生菌，目前從甘蔗、水稻、紅薯、巴拉圭茶、玉米等作物中分離到Kosakonia radicincitans、Kosakonia sacchari、Kosakonia radicincitans等細(xì)菌[2-5]。一些Kosakonia屬菌株具有固氮、溶磷、產(chǎn)生植物激素和鐵載體、分泌ACC脫氨酶等功能，能夠促進(jìn)植物生長和增強(qiáng)植物抗逆性。已有報道，Kosakonia radicincitans能夠增加水稻、玉米、番茄等作物產(chǎn)量和土壤肥力，在德國作為一種微生物菌劑被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[6]。除在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用，Kosakonia屬的一些菌株在污染環(huán)境修復(fù)中也起到重要作用。Ilias等[7]從制革廢水中分離出的Kosakonia cowanii MKPF2表現(xiàn)出對多種重金屬的抗性（Ni²⁺，Zn²⁺，Cu²⁺，Pb²⁺，Cd²⁺，Hg²⁺）和Cr（VI）的還原能力，減輕了重金屬Cr對環(huán)境的生物毒性。

由于工業(yè)生產(chǎn)和礦山開采活動，大量重金屬進(jìn)入周邊環(huán)境中，造成了流域環(huán)境污染，一些重金屬甚至通過作物吸收進(jìn)入食物鏈，危害人體健康。目前，隨著微生物修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用，植物促生菌在環(huán)境治理中受到重視。采用耐重金屬促生菌與超富集植物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染土壤，可以促進(jìn)植物生長并減輕植物脅迫，加快植物對重金屬的吸收轉(zhuǎn)移速率，具有較好的生態(tài)修復(fù)應(yīng)用前景。研究報道，從蘇丹草（Sorghum sudanense）中分離到1株Cu耐受性細(xì)菌Enterobacter sp. K3-2，具有產(chǎn)生ACC脫氨酶、鐵載體合成酶和IAA的作用，接種到蘇丹草中能夠顯著提高蘇丹草對銅離子的吸收積累效率[8]。趙會會[9]從植物根際土壤中分離得到的耐鎘植物促生菌Enterobacter sp. Oj06和Enterobacter sp. Ps08，能增加土壤中鎘的有效態(tài)，并促進(jìn)黑麥草對鎘的吸收與積累。

本研究從江西東鄉(xiāng)野生稻保護(hù)區(qū)的野生稻植株中分離到1株植物促生菌Y3，經(jīng)鑒定為蔗糖小迫氏菌（Kosakonia sacchari），對多種重金屬具有較好的耐受性。基于這些重要特征，本研究對Y3進(jìn)行了基因組測序和比較基因組學(xué)分析，從生物化學(xué)和分子水平上解析促生和重金屬耐性機(jī)制，挖掘其在修復(fù)重金屬污染土壤上的潛力。

1 材料和方法

1.1 菌株的分離與鑒定

Y3是從江西東鄉(xiāng)野生稻植株中分離得到的1株植物促生固氮菌。分離方法如下：采集保護(hù)區(qū)野生稻植株及其根際土壤裝于塑料盆內(nèi)，立即帶回實(shí)驗(yàn)室；野生稻植株用自來水洗凈后，將莖、葉剪成長3 cm，寬1 cm放入滅菌的培養(yǎng)皿中；70%乙醇消毒5 min，2% NaClO消毒5 min，無菌水洗5次后，將表皮剝離取其中間的部分，然后用研缽磨碎（內(nèi)放石英砂和生理鹽水），取0.1 mL研磨液涂布于PCA固體培養(yǎng)基中；同時，最后一次洗滌的無菌水涂布于PCA平板以檢查植株是否消毒徹底；在30 ℃下培養(yǎng)3 d，待培養(yǎng)基中長出細(xì)菌后，用接種環(huán)挑取單菌落，四分劃線法進(jìn)行分離純化，即得到Y(jié)3菌株；將分離純化的菌株用15%甘油保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

采用平板劃線法將Y3接種于PCA培養(yǎng)基（胰蛋白胨5.0 g/L，酵母提取粉2.5 g/L，葡萄糖1.0 g/L，pH 7.0，瓊脂20.0 g/L）上，30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌株的菌落形態(tài)。菌株鑒定方法參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[10]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[11]。

1.2 DNA提取與16S rRNA基因擴(kuò)增

挑取-20 °C保存的甘油菌液，在PCA培養(yǎng)基上四分法劃線，30 °C靜置培養(yǎng)24 h。挑取單菌落轉(zhuǎn)接于液體培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后收集菌體，用于提取細(xì)菌DNA。使用細(xì)菌基因組提取試劑盒（天根，北京）提取Y3基因組DNA，采用通用引物27F/1492R擴(kuò)增16S rDNA序列，擴(kuò)增產(chǎn)物交由生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果使用SeqMan軟件校正后上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫。

1.3 二代測序、序列組裝與注釋

將Y3基因組DNA交由上海派森諾生物科技股份有限公司（Shanghai Personal Biotechnology Co.， Ltd），利用Illumina Hiseq 2500平臺進(jìn)行全基因組測序。采用A5-MiSeq v20150522軟件[12]對去除接頭的有效測序數(shù)據(jù)（reads）進(jìn)行從頭拼裝，構(gòu)建contigs，進(jìn)一步對contigs進(jìn)行局部組裝和優(yōu)化，獲得基因組骨架（scaffolds）。

1.4 基因組注釋和比較基因組分析

使用NCBI原核基因組注釋管道（PGAAP）和PATRIC數(shù)據(jù)庫（https：//www.patricbrc.org/）對Y3基因組進(jìn)行注釋和比較基因組分析，通過OrthoVenn2數(shù)據(jù)庫（https：//orthovenn2.bioinfotoolkits.net/home）對Kosakonia sacchari的6株代表菌株進(jìn)行核心基因簇（core gene clusters）注釋和聚類分析。

1.5 基因組遺傳進(jìn)化分析

為明確Y3與Kosakonia屬菌株的遺傳進(jìn)化關(guān)系，使用TYGS（the Type （Strain） Genome Server）軟件對Y3進(jìn)行基于基因組系統(tǒng)發(fā)育分析[13]；并利用OthoroANI軟件計(jì)算Y3與GenBank中其他Kosakonia屬菌株之間的ANI值[14]。

1.6 抗生素抗性、重金屬耐受性和鐵載體測定

1.6.1 抗生素抗性。使用含有10 μg/mL青霉素，30 μg/mL卡那霉素，30 μg/mL四環(huán)素，30 μg/mL綠霉素，15 μg/mL紅霉素，10 μg/mL鏈霉素和10 μg/mL氨芐青霉素的藥敏圓片（杭州微生物試劑有限公司），通過圓盤擴(kuò)散法測試菌株Y3的抗生素敏感性。具體步驟為：用無菌涂布棒均勻涂抹菌液（OD600=1.0）至整個Luria-Bertani（LB）瓊脂平板，滅菌鑷子夾取各藥敏紙片于平板中央。將測試菌株Y3置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后記錄菌株周圍的透明圈直徑，判斷菌株抗生素敏感性。

1.6.2 重金屬耐受性。添加5.0 g/L CdCl₂·H₂O的儲備溶液于LB固體培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中CdCl₂·H₂O的濃度分別為100、150、200、250、300、350、400、450、450 mg/L Cd²⁺，點(diǎn)接種菌懸液（OD₆₀₀=1.0）于培養(yǎng)皿中央，30 ℃下培養(yǎng)3 d，觀察細(xì)菌的生長情況。允許細(xì)菌可見生長的最高Cd²⁺濃度被認(rèn)為是重金屬最低抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）。同時測試Y3對其他重金屬離子的耐受能力，即Cu²⁺（CuSO₄·5H₂O），Ni²⁺（NiCl₂·6H₂O），Co²⁺（CoCl₂·6H₂O）和Zn²⁺（ZnSO₄·7H₂O）重金屬，方法同上。

1.6.3 鐵載體測定。采用CAS檢測法測定Y3產(chǎn)鐵載體的能力[15]，具體方法如下：將MKB液體培養(yǎng)基（酪蛋白5.0 g，甘油15 mL，K₂HPO₄2.5 g，MgSO₄·7H₂O 2.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.2）按50 mL/瓶分裝于150 mL三角瓶中，115 ℃滅菌20 min備用；用接種環(huán)取一環(huán)新鮮菌苔于上述培養(yǎng)基內(nèi)，30 ℃搖床（120 r/min）培養(yǎng)48 h。于20 mL試管中加入3mL CAS檢測液。將上述搖床培養(yǎng)物離心15 min（5 000 r/min），取上清液3 mL加入CAS檢測液中，充分混勻。1 h后觀察顏色變化，設(shè)置空白培養(yǎng)液作對照。

1.7 菌株Y3的促生和重金屬耐性相關(guān)基因分析

通過直系同源蛋白簇（Clusters of Orthologous Groups of proteins，COG）功能分類、PATRIC數(shù)據(jù)庫注釋和KEGG代謝通路分析，獲得Y3基因組中與植物促生和重金屬抗性相關(guān)的基因，并分析相關(guān)代謝通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組組裝與基因預(yù)測

革蘭氏染色表明，Y3是革蘭氏陰性細(xì)菌，細(xì)胞形狀呈桿狀（圖1）。組裝后的高質(zhì)量基因組包含34個序列框架（scaffolds），大小為5.1 Mb，共包含5 140個編碼序列，GC含量為53.68％?；蚪M中包含74個tRNA基因、8個rRNA基因以及4 985個功能蛋白和1 100個假設(shè)蛋白基因（表1）。Y3基因組序列已經(jīng)提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，序列登錄號為JABTEE000000000。

COG功能分類顯示，Y3基因組中包含大量的與能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化，氨基酸運(yùn)輸和代謝，碳水化合物轉(zhuǎn)移、代謝和轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞壁/膜/被膜生源起源和無機(jī)離子運(yùn)輸與代謝相關(guān)的基因（圖2），這些基因是細(xì)胞自身代謝和功能發(fā)揮的分子基礎(chǔ)。

利用OrthoVenn2軟件對6株Kosakonia sacchari菌株的氨基酸序列進(jìn)行比對和同源聚類分析，發(fā)現(xiàn)6株菌共有3 987個同源基因簇（核心基因組），占總基因簇?cái)?shù)目（4 768）的83.6%。其中，Y3菌株基因組中存在4 417個基因簇，特有基因簇為5個（圖3）。同源分析表明Y3與其他5株菌株具有較高的同源性，同時在進(jìn)化上也存在一定差異。

2.2 菌株Y3的生理生化與分子鑒定

Y3的生理生化檢測結(jié)果表明，蔗糖利用、甲基紅實(shí)驗(yàn)、接觸酶實(shí)驗(yàn)、脲酶實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽利用、乙酰甲基甲醇實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性；淀粉水解、硝酸鹽還原、明膠液化、酪素水解、酯酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性（表2）。

16S rRNA基因序列分析表明，Y3與Kosakonia sacchari SP1菌株的16S rRNA基因序列（登錄號：MW332261）相似性為99.8％?；诨蚪M的進(jìn)化樹表明，Y3與Kosakonia sacchari SP1和Kosakonia sacchari CGMCC 1.12102聚為同一簇（圖4），表明其與二者的親緣關(guān)系較近。Y3與GenBank數(shù)據(jù)庫中的5株Kosakonia sacchari菌株（圖4）計(jì)算得出的平均核苷酸同一性（average nucleotide identity，ANI）值在94.5％～98.8％?；?個菌株的基因組ANI值>94％，則被認(rèn)定在進(jìn)化上屬相同種，因此，可鑒定菌株Y3為Kosakonia sacchari。

抗生素測試結(jié)果表明，Y3對10 U青霉素，15 μg/mL紅霉素具有抗藥性，但對10 μg/mL鏈霉素，10 μg/mL氨芐青霉素，30 μg/mL卡那霉素，30 μg/ mL四環(huán)素和30 μg/mL氯霉素敏感（表3）。

2.3 菌株Y3的重金屬抗性及促生特性

重金屬抗性結(jié)果表明，Y3可以在最高濃度為200 μg/mL CdCl₂·H₂O，250 μg/mL CuSO₄·5H₂O，500 μg/mL ZnSO₄·7H₂O和300 μg/mL CoCl₂·6H₂O的LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基上生長，對Cd²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺和Co²⁺離子均具有較好的耐受性。

鐵載體檢測結(jié)果顯示，接種菌株Y3的液體培養(yǎng)基顏色由藍(lán)色變?yōu)榧t色，表明菌株能夠產(chǎn)生大量的鐵載體（圖5）?；蚪M注釋顯示Y3基因組中存在與Zn²⁺轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因ZunA、ZunB、ZntB、ZitB、ZupT和與Cu²⁺抗性相關(guān)的基因CopC、CopD，表明Y3能夠積極主動轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞內(nèi)外Zn²⁺，并對Cu²⁺具有一定的抗性。比較基因組分析發(fā)現(xiàn)Y3基因組中還存在與植物促生作用相關(guān)的鐵載體合成酶基因（entB、entE、entA）和固氮酶基因（nifA、nifB、nifH、nifQ、nifX、nifN、nifT、nifZ、nifE）（圖6）。利用CARD數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果顯示，Y3基因組中還包含多重抗生素抗性基因marA、marB和marR。

3 討論與結(jié)論

近年來，土壤重金屬污染問題逐漸凸顯，對重金屬污染土壤的治理和修復(fù)是當(dāng)前十分迫切的任務(wù)。植物修復(fù)是重金屬污染土壤的一種環(huán)保型治理技術(shù)，在土壤生態(tài)修復(fù)領(lǐng)域被越來越廣泛地應(yīng)用與研究[16]。然而，重金屬對植物生長的脅迫和植物吸收重金屬效率低是導(dǎo)致植物修復(fù)效果差的主要原因。Glick等[17]提出，污染環(huán)境中微生物在促進(jìn)植物健康和生長方面發(fā)揮著重要作用，能夠顯著提高植物吸收重金屬的效率。植物促生菌與植物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染土壤，是提高修復(fù)效率的有效方法之一。植物促生菌通過提高植物適應(yīng)性（減輕有毒有害物質(zhì)脅迫）和供給養(yǎng)分物質(zhì)，促進(jìn)植物生長和植物根系從土壤中吸收重金屬，從而加速提取土壤中重金屬，提高修復(fù)效率[18]。植物-微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)具有修復(fù)費(fèi)用小、改善修復(fù)區(qū)土壤生態(tài)功能和大面積可持續(xù)治理的特點(diǎn)，適用于農(nóng)田、復(fù)墾礦區(qū)等環(huán)境重金屬污染土壤的修復(fù)[19-21]。因此，耐重金屬促生菌在植物修復(fù)重金屬污染土壤技術(shù)中具有良好的應(yīng)用前景。

Y3為從野生稻中分離得到的一株植物內(nèi)生細(xì)菌，具有固氮、產(chǎn)鐵載體等植物促生長特性和耐多種重金屬的能力，在植物-微生物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染土壤上具有潛在的應(yīng)用價值。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，Y3為Kosakonia屬中的蔗糖小迫氏菌（Kosakonia sacchari）。目前，已有5株Kosakonia sacchari菌株的基因組提交至NCBI數(shù)據(jù)庫中，通過基因組注釋和比較，發(fā)現(xiàn)Y3的基因組大?。?.13 M）和G+C含量（53.7%）與已提交的5株Kosakonia sacchari菌株較為接近（4.81～5.13M，53.7%～54.0%）。

Kosakonia sacchari是一類植物促生菌，可以提高土壤酶活性，促進(jìn)植物生長，在玉米和甘蔗種植中作為微生物菌劑被廣泛使用[22]。試驗(yàn)結(jié)果表明，Y3對Cd²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺和Co²⁺離子均具有較好的耐受性，對毒性較大的Cd²⁺的最大生長濃度達(dá)到了200 mg/L，在重金屬污染土壤中能夠競爭性生存于植物根際，并寄生于一些禾本科植物體內(nèi)。Y3能夠分泌大量的鐵載體，對部分金屬離子具有很強(qiáng)的絡(luò)合作用[23]；同時鐵載體還能夠活化土壤中的重金屬，增加植物根部有效態(tài)重金屬離子含量，進(jìn)而提高重金屬的生物有效性[24]。

植物細(xì)胞中Cd²⁺等重金屬的積累往往導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制植物的生長和代謝活性。比較基因組分析發(fā)現(xiàn)Y3基因組中存在與鐵載體合成相關(guān)的基因，胞內(nèi)生成鐵載體對重金屬的螯合作用可能對增加細(xì)胞重金屬耐受性起到一定作用。同時Y3基因組中還存在固氮酶合成基因，固氮酶能夠固定空氣中的氮?dú)鉃橹参锟衫玫陌?，減少植物在氮素缺乏環(huán)境中的養(yǎng)分脅迫影響，增加植物生長量，提高植物從土壤中提取重金屬的效率[25]。Y3基因組中一些涉及重金屬抗性或轉(zhuǎn)移的基因（ZunA、ZunB、ZntB、ZitB、ZupT和CopC、CopD）可能參與到細(xì)胞內(nèi)Cd²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Co²⁺等離子的主動外排和解毒，并且它們對維持細(xì)胞內(nèi)其他必需金屬元素（Mg²⁺、Mo²⁺、Mn²⁺）的平衡也起到重要作用。

植物促生菌具有改善植物生長發(fā)育狀況和緩解植物環(huán)境脅迫的作用，內(nèi)生菌定殖于植株體內(nèi)，與宿主植物聯(lián)系更加緊密，減少了重金屬對其自身代謝的干擾，在生物修復(fù)中具有更大的應(yīng)用價值。本研究對植物內(nèi)生菌Y3的基因組測序和比較基因組分析，為開展Y3與其宿主植物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染土壤提供了材料和依據(jù)。

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（責(zé)編：何 艷）