馮金華 何梓淵 劉紅英 李麗娜

摘要 ?采用乙醇-硫酸銨雙水相制備蝦殼中的蝦青素，探索蝦殼中蝦青素提取的條件。結(jié)果表明：采用乙醇溶液，料液比1 ∶15，每次提取3 h，提取2次，提取效果較好。采用乙醇-硫酸銨雙水相萃取蝦青素，蝦青素主要集中在上下兩相之間，最佳條件：20%硫酸銨∶蝦青素乙醇提取液（v/v）=2.5 ∶2.0，沉淀率為89.09%。經(jīng)薄層色譜法和高效液相色譜法檢測(cè)，雙水相萃取可使蝦青素提取液中的各類型蝦青素都沉淀。

關(guān)鍵詞 ?蝦青素；雙水相體系；分離

中圖分類號(hào) ?TS 254.9 ??文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A ??文章編號(hào) ?0517-6611（2023）05-0176-05

doi： 10.3969/j.issn.0517-6611.2023.05.040

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Extraction of Astaxanthin from Shrimp Shells by Ethanol /（NH4）2SO4 Aqueous Two-phase System

FENG Jin-hua， HE Zi-yuan， LIU Hong-ying et al

（Hebei Agriculture University， Qinhuangdao， Hebei 066003）

Abstract ?Astaxanthin in shrimp shell was prepared by ethanol/（NH4）2SO4 aqueous two-phase method. The extraction conditions of astaxanthin from shrimp shell were explored. It was determined that ethanol solution was used， the solid-liquid ratio was 1 ∶15， extracted for 3h and twice， and the extraction effect was better. Astaxanthin was extracted by ethanol/（NH4）2SO4 aqueous two-phase extraction. Astaxanthin was mainly concentrated between the upper and lower phases. The optimum condition was that 20% （NH4）2SO4 ∶ astaxanthin ethanol extract（v/v） = 2.5 ∶2.0， and the precipitation rate was 89.09%. By TLC and HPLC examination， all kinds of astaxanthin in astaxanthin extract can be precipitated by aqueous two-phase extraction. This environmentally friendly method has potential application prospects in the large-scale separation of astaxanthin.

Key words ?Astaxanthin;Aqueous two-phase system;Separation

蝦青素又稱變胞藻黃素，英文習(xí)慣命名為Astaxanthin，全反式蝦青素的中文系統(tǒng)命名為全反式3，3′-二羥基-4，4′-二酮基-β，β′胡蘿卜素，相對(duì)分子質(zhì)量為596.86，純蝦青素是暗紅紫色粉末，熔點(diǎn)224 ℃，不溶于水，能溶解于大多數(shù)有機(jī)溶劑［1］。蝦青素天然產(chǎn)物多數(shù)以酯的形式存在，有些是一元酯，有些是二元酯，存在于自然界中的大部分蝦青素及其酯為全反式異構(gòu)體［2］。

蝦青素具有獨(dú)特的著色功能，進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后可以不經(jīng)修飾或生化轉(zhuǎn)化而直接貯存、沉積在組織中［3］。蝦青素在保護(hù)細(xì)胞膜磷酸酯和其他脂類的超氧化方面表現(xiàn)突出。蝦青素在淬滅活性氧的活性及清除自由基方面能力比β-胡蘿卜素高10倍以上，比VE強(qiáng)百倍以上。同時(shí)，蝦青素具有抑制脂質(zhì)過氧化作用，具有顯著降低脂質(zhì)過氧化物累積的作用［4］。蝦青素還具有一定的抗癌特性。Tanaka等［5］在用硝基喹啉-1-氧化物誘發(fā)大鼠口腔癌的類似試驗(yàn)中，觀察到蝦青素能顯著降低口腔腫瘤的發(fā)生率。這些決定了蝦青素的應(yīng)用價(jià)值及商業(yè)價(jià)值。

雙水相萃取技術(shù)是一種操作簡(jiǎn)單、易于放大的分離方法，自20世紀(jì)60年代提出以來受到廣泛關(guān)注。該技術(shù)的原理是生物物質(zhì)在雙水相體系中的選擇性分配。當(dāng)生物物質(zhì)進(jìn)入雙水相體系后，在上相和下相間進(jìn)行選擇性分配，表現(xiàn)出一定的分配系數(shù)。不同的物質(zhì)在特定的體系中有著不同的分配系數(shù)［6］。近30年來，雙水相萃取已涉及酶、核酸、 生長(zhǎng)激素、病毒、色素、生物堿等有效成分的分離及提純。但是有關(guān)該技術(shù)應(yīng)用于蝦青素的提取和分離尚鮮見相關(guān)研究報(bào)道。

目前，已有的萃取體系有高聚物-高聚物-去離子水、高聚物-鹽-去離子水、離子液體-鹽-去離子水、小分子有機(jī)溶劑-鹽-去離子水等。考慮到蝦青素易溶于有機(jī)溶劑不溶于水的性質(zhì)，筆者選擇小分子有機(jī)溶劑-鹽-水體系，采用乙醇-硫酸銨雙水相體系對(duì)蝦青素進(jìn)行分離研究，旨在為蝦青素雙水相制備的可行性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 ???原材料。冷凍南美白對(duì)蝦，購于河北省秦皇島市海港區(qū)市場(chǎng)。

1.1.2 ???主要儀器。721型可見光分光光度計(jì)，上海舜宇恒平科技有限公司；Sigma 3-30k實(shí)驗(yàn)室高速冷凍離心機(jī)，塞維斯科技（北京）有限公司；FA2104N型精密分析電子天平，上海菁海儀器有限公司；FM100型高速萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；HH-8型恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；H185OR型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；D2F-6050AB型電熱真空干燥箱，天津工興實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；LC-20A型島津高效液相色譜儀，Shimadzu島津公司。

1.1.3 ???主要試劑。蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品（S13036-250 mg >98.0%），上海源葉生物科技有限公司；硅膠板（規(guī)格50 mm×100 mm；厚度0.20～0.25 mm），青島海洋化工有限公司；甲醇（色譜純）、四氫呋喃（色譜純），天津康科德科技有限公司；無水乙醇（AR）、硫酸銨（AR），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 ???蝦殼中蝦青素的提取。將新鮮的蝦殼用5%稀鹽酸浸沒，攪拌，靜置1 h，至不再有氣泡產(chǎn)生，然后用清水洗至中性，60 ℃下烘干，-10 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

為檢測(cè)提取時(shí)間對(duì)蝦青素提取效果的影響，取干燥的蝦殼，粉碎，設(shè)置料液比為1 ∶ 8、1 ∶ 10、1 ∶ 15、1 ∶ 20，在室溫下，用乙醇分別浸提蝦殼，檢測(cè)提取1、2、3、4、5、9 h，用每組提取液在476 nm處的吸光度來判斷提取液中蝦青素的含量。每組設(shè)置3個(gè)平行。

為檢測(cè)提取次數(shù)對(duì)蝦青素提取的影響，分別檢測(cè)了料液比分別為1 ∶5、1 ∶8、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20，在分別提取1、2、3次（每次提取3 h）時(shí)，蝦青素提取液在476 nm的吸光度，并計(jì)算蝦青素的提取量。每組3個(gè)平行。

樣品液中蝦青素含量的計(jì)算根據(jù)Beer-Lamben定律［7］，計(jì)算公式：

m= A×V×106 A1%1 cm×100

式中，m為類胡蘿卜素含量，μg；

A為溶液吸光度；

V為溶液體積，mL。

其中，吸光系數(shù)A1%1 cm為在1 cm光程長(zhǎng)的比色杯中1 g/L濃度溶質(zhì)的理論吸收值。蝦青素標(biāo)準(zhǔn)樣品在乙醇中的吸光系數(shù)為2 365 L/（g·cm）。

1.2.2 ???乙醇-硫酸銨雙水相體系的配制。配制質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%（w/v）的硫酸銨溶液，取2.0 mL無水乙醇溶液，分別與不同體積的硫酸銨溶液混合，在25 ℃下靜置30 min，觀察并記錄成相情況。

1.2.3 ???乙醇-硫酸銨雙水相溶液萃取蝦殼中的蝦青素。利用“ 1.2.1 ”中的制備方法提取蝦殼中蝦青素，并適當(dāng)濃縮。然后向一定體積的蝦青素乙醇提取液中（A476 nm=1.694，7.163 μg/mL）加入一定體積的20%、30%的（NH4）2SO4溶液，配制成雙水相，檢測(cè)雙水相上相中蝦青素在476 nm處的吸光度。

1.2.4 ???蝦青素的薄層色譜測(cè)定。50 mm×100 mm的硅膠板，展開劑為25%丙酮和75%正己烷，完成薄層分離后測(cè)Rf值。

1.2.5 ???蝦青素的高效液相色譜檢測(cè)。色譜柱為C18：250.0 mm×4.6 mm，采用甲醇（B）和四氫呋喃（A）梯度洗脫的方式（表1），流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)476 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫20 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇浸提時(shí)間對(duì)蝦青素提取的影響

在室溫下，通過對(duì)4組料液比進(jìn)行蝦殼中蝦青素提取的研究發(fā)現(xiàn)（圖1），4組在提取3 h之前，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取液中蝦青素均逐漸增大；提取時(shí)間在3 h左右，蝦青素在溶液中濃度達(dá)到較高值；3 h以后，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，蝦青素的濃度反而變得不穩(wěn)定，除料液比1 ∶ 8組外，基本未出現(xiàn)持續(xù)增加的情況，主要趨勢(shì)是在3～5 h蝦青素濃度變化不大，5～9 h，除料液比1 ∶ 8組基本呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但下降速度不快。這說明在室溫下，提取蝦青素的過程中，3 h左右易達(dá)到溶解平衡，提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，溶解的蝦青素可能發(fā)生分解，反而開始下降。因此，在提取蝦殼中蝦青素時(shí)，可以設(shè)定提取時(shí)間為3 h左右。

2.2 乙醇浸提料液比及提取次數(shù)對(duì)蝦青素提取的影響

稱取0.5 g蝦皮，選擇料液比1 ∶ 5、1 ∶ 8、1 ∶ 10、1 ∶ 15、1 ∶ 20進(jìn)行提取，每次提取3 h。從圖2可以看出，提取1次，所獲得提取液蝦青素的吸光度均在0.3以上，對(duì)蝦殼提取第2次時(shí)，蝦青素的吸光度明顯降低；1 ∶ 5料液比組第2次提取后，吸光度仍較高，1 ∶ 8和1 ∶ 10組提取液的吸光度基本在0.2左右；1 ∶ 15和1 ∶ 20提取液的吸光度較低；提取第3次，1 ∶ 5組提取液中蝦青素的吸光度仍較高。這說明采用1 ∶ 5料液比提取3次，蝦青素有較多的剩余量。

由表2可知，5個(gè)料液比下，以1 ∶ 15料液比組提取蝦青素量最多。因此在提取蝦青素時(shí)，采用1 ∶ 15料液比較合適。

2.3 乙醇-硫酸銨雙水相溶液的配制

先用10%、20%、30%（w/v） 的硫酸銨溶液和無水乙醇進(jìn)行混合試驗(yàn)，以配制25 ℃乙醇-硫酸銨雙水相體系，試驗(yàn)結(jié)果見表3～5。由表3可知，采用10%硫酸銨溶液進(jìn)行雙水相配制不易形成雙水相。

由表4可知，采用20%硫酸銨溶液進(jìn)行雙水相配制，無水乙醇 ∶ 20%硫酸銨（v/v）=1 ∶ 1、1 ∶ 1.25、1 ∶ 1.50，可以形成雙水相，且不會(huì)出現(xiàn)硫酸銨沉淀，且上相比下相體積大得多。

由表5可知，采用30%硫酸銨溶液進(jìn)行雙水相配制，較易形成雙水相，在無水乙醇 ∶ 30%硫酸銨（v/v）=1 ∶ 1.50、1 ∶ 1.75、1 ∶ 2、 1 ∶ 2.25、1 ∶ 2.50可 以形成較清晰的雙水相，且上下相比例逐漸減小。

綜上，選擇表4、5中成相體系進(jìn)行蝦青素的萃取試驗(yàn)。

2.4 乙醇-硫酸銨雙水相體系萃取蝦青素

采用表4、5中的雙水相萃取蝦青素，發(fā)現(xiàn)乙醇-硫酸銨雙水相體系可將蝦青素溶液分為3相，蝦青素主要以沉淀的形式集中于中間相，部分蝦青素存在于上相，下相澄清（圖3）。

由表6可知，3個(gè)20%硫酸銨與無水乙醇形成的雙水相對(duì)蝦青素的沉淀率均較高，最高為乙醇 ∶ 20%硫酸銨（v/v）=2 ∶ 2.50體系，蝦青素沉淀率為89.09%。由表7可知，30%硫酸銨與無水乙醇形成的雙水相對(duì)蝦青素的沉淀率相對(duì)較低，上相中的殘留率較高。

2.5 雙水相體系制備蝦青素的檢測(cè)

采用蝦青素乙醇提取液 ∶ 20%硫酸銨（v/v）=2 ∶ 2.50體系提取液中的蝦青素，并對(duì)制備的蝦青素進(jìn)行高效液相色譜分析和薄層色譜分析。

2.5.1 ???高效液相色譜分析結(jié)果。

蝦殼中蝦青素的高效液相色譜圖如圖4所示。其中出峰時(shí)間4.5 min處是游離蝦青素，出峰時(shí)間14.0～20.0 min處是蝦青素一酯，出峰時(shí)間29.5～45.0 min處是蝦青素二酯。由此可知，蝦殼中含有多種蝦青素一酯和多種蝦青素二酯，并且游離蝦青素、蝦青素一酯、蝦青素二酯的含量均很高。

雙水相萃取蝦青素的高效液相色譜圖（圖5）與圖4基本相同，說明該雙水相體系可以將蝦殼中各種類型蝦青素萃取出來，可以起到很好地制備蝦青素的目的。

2.5.2 ???薄層色譜分析結(jié)果。

從圖6可以看出，雙水相萃取蝦青素與蝦殼中蝦青素提取液相比，游離蝦青素條帶沒有太大差別。蝦青素一酯和蝦青素二酯在雙水相萃取圖中更加清晰，推測(cè)可能是由于雙水相萃取不僅能夠?qū)⑽r青素沉淀出來，提高了蝦青素的濃度，同時(shí)還去除了一部分雜質(zhì)，如去除了部分與蝦青素結(jié)合的蛋白質(zhì)，使雙水相制備的蝦青素純度更高，蝦青素一酯和二酯的顯色更加清晰。

3 討論

蝦青素的制備一般采用有機(jī)溶劑萃取-旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮［8］、超臨界流體萃取［9］、堿提酸沉法［10］、 水沉法［11］等，這些方法不利于蝦青素的進(jìn)一步分離，有些需要加熱則不利于蝦青素穩(wěn)定，有些需要比較昂貴的儀器，有些可能造成環(huán)境污染。

一般雙水相主要基于物質(zhì)在上下兩相中的分配不同，來實(shí)現(xiàn)不同物質(zhì)間的分離。但研究發(fā)現(xiàn)，在采用雙水相體系進(jìn)行物質(zhì)分離時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)中間相。向不經(jīng)預(yù)處理的有機(jī)酸發(fā)酵液中加入可溶性無機(jī)鹽或有機(jī)鹽和萃取劑進(jìn)行萃取操作，兩相之間會(huì)形成一個(gè)富含菌體和蛋白的固相層［12］。修志龍等［13］研究表明，向越桔果實(shí)殘?jiān)屑尤霟o機(jī)鹽溶液和?親水性低分子有機(jī)物，分層后，花青素被萃取到上相，殘?jiān)?配在下相或兩相之間。Li等［14］研究表明，采用乙醇/Na2CO3雙水相體系從培養(yǎng)的冬蟲夏草中分離冬蟲夏草菌絲體多糖時(shí)，99.1%的細(xì)胞碎片集中于上下兩相之間。

該研究發(fā)現(xiàn)，蝦青素在乙醇/硫酸銨雙水相體系中，可形成固相層集中于兩相之間。通過適當(dāng)?shù)碾p水相體系可以使88.0%以上的蝦青素沉淀下來，同時(shí)可以去除一些可以溶于上相和下相中的雜質(zhì)成分，如一些蛋白質(zhì)、糖類、其他色素等，在使蝦青素形成沉淀的同時(shí)，還能提高蝦青素的品質(zhì)，而且節(jié)省了蝦青素脫溶劑的步驟。該方法不需要大量的酸堿，乙醇和硫酸銨都可以回收使用，所以對(duì)環(huán)境危害性較小，而且該工藝還比較容易擴(kuò)大生產(chǎn)。因此，該研究可以成為一種制備蝦青素的新方法。

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