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        固氮菌Azotobacter salinestris 代謝物脂肪酸分析及其抗氧化活性研究

        2023-07-04 16:23:32付振艷排孜麗亞·帕爾哈提寧慧霞牛立濤熱合巴提·努爾夏提排合爾丁·穆太力甫阿布力米提·伊力
        安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2023年5期

        付振艷 排孜麗亞·帕爾哈提 寧慧霞 牛立濤 熱合巴提·努爾夏提 排合爾丁·穆太力甫 阿布力米提·伊力

        摘要 ?[目的]探究固氮菌Azotobacter salinestris(As101)代謝物脂肪酸組成及抗氧化活性。[方法]采用氣質(zhì)聯(lián)用法(GC/MS)進(jìn)行脂肪酸組成分析;根據(jù)2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽 (ABTS)自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基和羥基自由基清除能力測定抗氧化活性。[結(jié)果]固氮菌As101代謝物脂溶性成分中棕櫚酸甲酯(11.34%)、鄰苯二甲酸二丁酯(7.41%)、順9,10-甲基十九烷酸甲酯(18.71%)、硬脂酸甲酯(3.08%)、12-甲基十四烷酸甲酯(8.02%)為主要成分,其次為油酸甲酯(5.01%)、(Z)-十六烯酸甲酯(3.44%)、14-甲基十六烷酸甲酯(1.67%)等。其中,不飽和脂肪酸達(dá)43.78%;固氮菌As101代謝物脂肪酸對DPPH自由基、ABTS自由基及羥基自由基的清除能力分別為53.05%、27.83%、43.77%。[結(jié)論]As101代謝物脂肪酸種類豐富,具有良好的開發(fā)利用價(jià)值及廣闊的應(yīng)用前景。

        關(guān)鍵詞 ?固氮菌;代謝物;脂肪酸;GC/MS;抗氧化活性

        中圖分類號 ?Q 939.11+3 ??文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ?A ??文章編號 ?0517-6611(2023)05-0172-04

        doi: 10.3969/j.issn.0517-6611.2023.05.039

        開放科學(xué)(資源服務(wù))標(biāo)識碼(OSID):

        Fatty Acid Analysis and Antioxidant Activity of Metabolites of Azotobacter salinestris

        FU Zhen-yan1,Paziliya·Paerhati1,2,NING Hui-xia1 et al

        (1.State Key Laboratory Basis of Xinjiang Indigenous Medicinal Plants Resource Utilization/Xinjiang Technical Institute of Physics and Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Urumqi,Xinjiang 830011;2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100039)

        Abstract ?[Objective]The fatty acid composition and antioxidant activity of metabolites of Azotobacter salinestris (As101) were studied.[Method]The composition of fatty acids was analyzed by GC/MS;The antioxidant activity was determined according to the scavenging ability of 2,2-diazo-bis (3-ethyl-benzothiazole-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS),1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine (DPPH) and hydroxyl radical.[Result]Palmitic acid (11.34%),phthalic acid (7.41%),cis-9,10-methyloctadecanoic acid (18.71%),stearic acid (3.08%),12 methyltetradecanoic acid (8.02%) were the main components of the fat soluble metabolites of Azotobacter As101,followed by oleic acid (5.01%),(z) -hexadecenic acid (1.44%),14 methylhexadecanoic acid (1.67%).Among them,unsaturated fatty acids reached 43.78%;the scavenging abilities of fatty acids of metabolites of nitrogen fixing bacteria AS101 to DPPH radical,ABTS radical and hydroxyl radical were 53.05%,27.83% and 43.77% respectively.[Conclusion]As101 metabolites are rich in fatty acids,which have good development and utilization value and broad application prospects.

        Key words ?Azotobacter;Metabolite;Fatty acid;GC/MS;Antioxidant activity

        脂肪酸是生物體的代謝產(chǎn)物成分之一,是其不可缺少的能量和營養(yǎng)物質(zhì)。其中,飽和脂肪酸(SFA)對人體有提供能量、抑制腫瘤病毒生長等功能[1-3],不飽和脂肪酸中的單不飽和脂肪酸(MUFA)具有降血糖、調(diào)節(jié)血脂和保護(hù)心血管[4]等作用,多不飽和脂肪酸(PUFA)具有維護(hù)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、預(yù)防心腦血管疾病和對抗肥胖等生理功能[5-8]。固氮菌是一種有機(jī)營養(yǎng)型細(xì)菌。菌體桿狀、卵圓形或球形,能固定空氣中的氮。氮是植物生長不可缺少的物質(zhì),是合成蛋白質(zhì)的主要來源[9-10]。固氮菌擅長從空氣中固定氮,它們能把空氣中植物無法吸收的氮?dú)廪D(zhuǎn)化成氮肥,源源不斷地供給植物生長[11]。現(xiàn)代微生物學(xué)研究表明,細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)中普遍含有的脂肪酸成分與細(xì)菌的 DNA 具有高度同源性,不同種屬的細(xì)菌,其脂肪酸的組成和含量表現(xiàn)出不同程度的差異,并且這種差異比較穩(wěn)定,各種細(xì)菌具有其特征性的細(xì)胞脂肪酸指紋圖譜[12]。截至目前,國內(nèi)外對固氮類細(xì)菌代謝物脂肪酸成分研究的報(bào)道甚少,固氮類細(xì)菌代謝物脂肪酸缺乏系統(tǒng)研究。筆者運(yùn)用GC/MS技術(shù)對固氮菌Azotobacter salinestris(As101)代謝物的脂肪酸成分進(jìn)行系統(tǒng)性分析,并對其抗氧化活性進(jìn)行評價(jià),為挖掘固氮類細(xì)菌代謝物脂肪酸在醫(yī)藥及食品領(lǐng)域的潛在價(jià)值,以及為細(xì)菌指紋圖譜分析與鑒定提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 ???研究對象。新疆烏魯木齊市鹽湖景區(qū)(海拔1 009 m,地理坐標(biāo)88.138 445 2°E、43.380 997 4°N)。

        1.1.2 ???主要試劑。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司);2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)(北京索萊寶生物科技有限公司);石油醚、甲苯、氫氧化鉀、無水硫酸鈉、無水乙醇、甘露醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鈣、酵母提取物、氯化鐵、鉬酸鈉、葡萄糖、氯化鈉、碳酸鈣,均為國產(chǎn)分析純。

        1.1.3 ???培養(yǎng)基。Ashby培養(yǎng)基:葡萄糖10.0 g,磷酸二氫鉀0.2 g,硫酸鎂0.2 g,氯化鈉0.2 g,硫酸鈣0.2 g,碳酸鈣5.0 g,蒸餾水1 L,pH 7.0~7.2,115 ℃,滅菌30 min;固氮培養(yǎng)基:甘露醇20.0 g,磷酸二氫鉀0.2 g,磷酸氫二鉀0.8 g,硫酸鎂0.2 g,硫酸鈣0.1 g, 酵母提取物0.5 g,氯化鐵(微量),鉬酸鈉(微量),蒸餾水1 L,pH 7.0~7.2,121 ℃,滅菌20 min。

        1.1.4 ???儀器與設(shè)備。7890A-5975C 氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀(美國 Agilent 公司),恒溫振蕩培養(yǎng)箱(ZHWY-2102C),F(xiàn)-305 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士 BUCHI 公司),NICOLET 6700 紅外光譜儀(美國 Thermo 公司),HH2 數(shù)顯恒溫水浴鍋(鄭州華峰儀器有限公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 ???土壤固氮菌As101的活化及發(fā)酵代謝物制備。試驗(yàn)用土壤固氮菌(Azotobacter salinestris,As101)是新疆特有藥用資源利用省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存的菌株(Genbank登錄號:OK445517)。從-80 ℃冰箱保藏菌株的甘油管中挑取1環(huán)固氮菌As101菌液,劃線到Ashby固體培養(yǎng)基中,倒置37 ℃暗培養(yǎng),2~3 d長出單克隆,挑取單克隆接到液體固氮培養(yǎng)基進(jìn)行活化,溫度33 ℃,轉(zhuǎn)速160 min/r,培養(yǎng)時(shí)間48 h(對數(shù)生長期);再以5%接種量接種于液體固氮培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵,溫度33 ℃,轉(zhuǎn)速160 r/min,培養(yǎng)時(shí)間120 h,獲得固氮菌As101發(fā)酵代謝物。

        1.2.2 ???As101代謝物脂肪酸樣品制備。經(jīng) “1.2.1” 中獲得的固氮菌As101發(fā)酵代謝物,7 000 r/min離心10 min去除菌體,將上清液濃縮為原體積的1/3,以石油醚為提取溶劑,按1 ∶ 1比例與濃縮上清液混勻攪拌2 h,分液漏斗靜置1 h,重復(fù)3次。收集3次的上層液,濃縮,40 ℃烘干24 h,稱重,獲得固氮菌 As101代謝物脂肪酸樣品。

        1.2.3 ???脂肪酸甲酯化。精確稱取經(jīng) “1.2.2” 中制備的固氮菌 As101代謝物脂肪酸樣品100 mg,溶解在石油醚和甲苯比例為1 ∶1的混合物(2 mL)中,加入2 mL 0.4 mol/L KOH-CH3OH溶液,攪拌混勻,在室溫下靜置20 min,加入蒸餾水,使其靜置分層。澄清后取上清液,用無水硫酸鈉干燥,用微孔濾膜過濾后供GC-MS分析[13]。

        1.2.4 ???GC-MS分析。甲酯化后的脂肪酸在配備有質(zhì)譜檢測器 (5975C配備安捷倫三軸檢測器)的安捷倫7890 A 氣相色譜儀上進(jìn)行分析。操作條件如下:色譜柱(30 m×0.25 μm×0.25 μm),初始溫度為50 ℃;以10 ℃/min加熱至220 ℃,以5 ℃/min加熱至250 ℃,最后以10 ℃/min加熱至300 ℃,并保持10 min。載氣為氦氣,流速為1 mL/min,進(jìn)樣口溫度為300 ℃,取樣體積為0.2 μL,分流比為50 ∶1。電離方式為 EI;電離能量為 70 eV;離子源發(fā)生器溫度為230 ℃;質(zhì)量掃描范圍為 40~500 m/z,全離子掃描。通過比較NIST庫(NIST 08)獲得質(zhì)譜和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜[13]。

        1.2.5 ???抗氧化活性試驗(yàn)。

        1.2.5.1 ???DPPH自由基清除試驗(yàn)。將100 μL各濃度的脂肪酸(0.17~5.76 mg/mL)和100 μL新配置的DPPH (0.2 mol/L) 加到96孔板上。然后立即混合,37 ℃避光反應(yīng) 30 min,在波長 517 nm下測吸光度,并用以下公式計(jì)算抑制率。3次重復(fù)[13]。

        DPPH自由基清除率=[1- Ai-Aj A0 ]×100%

        式中,Ai為100 μL DPPH自由基溶液+100 μL樣品的吸光度;A0為100 μL DPPH自由基溶液+100 μL石油醚的吸光度;Aj為100 μL樣品+100 μL石油醚的吸光度。

        1.2.5.2 ???ABTS自由基清除試驗(yàn)。將50 μL不同濃度脂肪酸(0.417 5~6.680 0 mg/mL)和150 μL ABTS自由基(吸光度在0.70±0.02)混合,在室溫條件下反應(yīng)10 min后,在730 nm處測定吸光度,并用上述公式計(jì)算抑制率。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次[13]。

        1.2.5.3 ???羥基自由基(OH+)清除試驗(yàn)。分別取不同濃度脂肪酸(0.417 5~6.680 0 mg/mL)于試管中,各管加入800 μL硫酸亞鐵(避光)6 mmol/L和800 μL水楊酸6 mmol/L,搖勻后各管加入0.1 % H2O2 50 μL混勻,37 ℃水浴30 min,以石油醚為空白對照,510 nm處測定各反應(yīng)吸光度并按上述公式計(jì)算清除率[13]。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 脂肪酸含量 ???固氮菌As101代謝物脂溶性成分提取量為3.6 mg/L。固氮菌As101代謝物脂肪酸甲脂總離子GC/MS流如圖1所示,GC-MS結(jié)果經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(NIST08)檢索,與標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行比對分析,細(xì)菌As101代謝物脂溶性成分的脂肪酸組成按峰面積歸一化計(jì)算各峰面積的質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果見表1。由表1可知,固氮菌As101代謝物脂溶性成分中順9,10-甲基十九烷酸甲酯(18.71%)、棕櫚酸甲酯(11.34%)、12-甲基十四烷酸甲酯(8.02%)、鄰苯二甲酸二丁酯(7.41%)、油酸甲酯(5.01%)是主要成分。其中,不飽和脂肪酸達(dá)43.78%。

        2.2 ?抗氧化活性 ???固氮菌As101代謝物脂肪酸提取物的抗氧化活性通過檢測ABTS、DPPH自由基和羥基自由基清除能力進(jìn)行評價(jià)。如圖2所示,在檢測濃度范圍內(nèi),陽性對照VC和固氮菌As101代謝物脂溶性成分清除ABTS自由基能力均隨濃度的增大而增強(qiáng),表現(xiàn)出良好的劑量依賴關(guān)系。在檢測濃度范圍內(nèi),陽性對照VC的ABTS自由基清除率在70%以上,強(qiáng)于固氮菌As101代謝物脂溶性成分。對于固氮菌As101代謝物脂肪酸提取物,當(dāng)濃度達(dá)到4.174 mg/mL時(shí),ABTS清除率達(dá)到27.83%,表現(xiàn)出很強(qiáng)的清除ABTS自由基的活性。

        從圖3可見,固氮菌As101代謝物脂溶性成分和VC溶液對DPPH自由基的清除能力均與質(zhì)量濃度呈正相關(guān),且VC的清除能力高于固氮菌As101代謝物脂溶性成分。當(dāng)固氮菌As101代謝物脂溶性成分濃度大于0.72 mg/mL時(shí),清除率增長快速,當(dāng)濃度達(dá)到5.76 mg/mL時(shí),DPPH自由基清除率達(dá)到53.05%,表現(xiàn)出較好的清除活性。

        羥基自由基去除能力是衡量天然化合物抗氧化活性的重要指標(biāo)。如圖4所示,固氮菌As101代謝物脂溶性成分和VC溶液對羥基自由基的清除活性均與質(zhì)量濃度呈正相關(guān),且VC的清除活性高于固氮菌As101代謝物脂溶性成分。固氮菌As101代謝物脂溶性成分呈現(xiàn)較好的羥基自由基清除能力;當(dāng)濃度為4 mg/mL時(shí),細(xì)菌As101代謝物脂溶性成分的還原能力為43.77%。

        3 討論與結(jié)論

        該研究對新疆烏魯木齊市鹽湖景區(qū)土樣中分離到的固氮菌代謝物脂溶性成分進(jìn)行分析并進(jìn)行了抗氧化活性研究。分析結(jié)果表明,在液體固氮培養(yǎng)基上,固氮菌As101在pH 7、溫度33 ℃、轉(zhuǎn)速160 r/min、發(fā)酵120 h條件下的代謝物脂溶性成分組分來看,不飽和脂肪酸順9,10-甲基十九烷酸甲酯含量最高,其次依次為棕櫚酸甲酯、12-甲基十四烷酸甲酯、鄰苯二甲酸二丁酯。這與陳拾旸等[14]報(bào)道的雙歧桿菌代謝產(chǎn)物脂肪酸構(gòu)成,甘永琦等[15]報(bào)道的乳酶生菌種脂肪酸組分以及紀(jì)曉玲等[16]報(bào)道的1株四合木鏈格孢發(fā)酵產(chǎn)物的脂肪酸組分有很大的區(qū)別。大多數(shù)微生物代謝物中棕櫚酸的含量相對高。陳拾旸等[14]的報(bào)道中飽和脂肪酸棕櫚酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、二十四烷酸(C24:0)為5株雙歧桿菌代謝產(chǎn)物及細(xì)胞中的主要脂肪酸;紀(jì)曉玲等[16]的報(bào)道中四合木鏈格孢發(fā)酵產(chǎn)物的脂肪酸組分中不飽和脂肪酸占總脂肪酸的63.04%,其中油酸和亞麻酸的含量較高。出現(xiàn)這種差異的原因可能有2個(gè)方面: ①各報(bào)道中采用的菌株不同,不同種菌株之間脂肪酸存在差異;②細(xì)胞組成與生長階段、培養(yǎng)基成分、溫度等因素有關(guān),作為細(xì)胞膜重要組成成分的脂類也會受到影響[17]。前者研究中使用的是雙歧桿菌BS、MRS和馬鈴薯葡萄糖(PDA)3種培養(yǎng)基,而該試驗(yàn)中使用的是固氮培養(yǎng)基;另外,前者報(bào)道中的氣質(zhì)聯(lián)用色譜分析條件也不同。細(xì)菌代謝物脂肪酸的組成受到很多因素的影響,因此在分析脂肪酸時(shí),需要對培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件、氣相前處理?xiàng)l件等因素進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,否則會影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。該研究含量最高的不飽和脂肪酸順9,10-甲基十九烷酸甲酯相關(guān)報(bào)道甚少,有待更進(jìn)一步研究。

        健康的食品供應(yīng)和有效的藥物生產(chǎn)對人體免疫系統(tǒng)有直接影響。鑒于全球日益嚴(yán)峻的環(huán)境和健康挑戰(zhàn),找到不同的解決辦法來改善食品供應(yīng)和藥品有效性,特別是找到具有高抗氧化活性的脂肪酸對藥品生產(chǎn)和食品供應(yīng)具有重要影響。鑒于此,筆者進(jìn)行了固氮菌As101代謝物脂溶性成分抗氧化活性研究。脂肪酸成分抗氧化活性研究中,董強(qiáng)等[18]報(bào)道的鷹嘴豆脂肪酸中不飽和脂肪酸含量達(dá)87.79%~90.56%,脂肪酸DPPH自由基去除能力70%;趙海軍等[19]報(bào)道,牡丹籽油脂肪酸成分中不飽和脂肪酸含量達(dá)80.55%~92.12%,脂肪酸DPPH自由基去除能力60.82%~95.68%??梢钥闯?,不飽和脂肪酸含量越高,脂肪酸抗氧化活性就越高。雖然VC溶液對羥基自由基的清除活性均與質(zhì)量濃度呈正相關(guān),清除活性高于固氮菌As101代謝物脂溶性成分,但隨濃度的升高,其變化趨勢增加平緩,而固氮菌As101代謝物脂溶性成分清除自由基能力隨濃度增加表現(xiàn)出“強(qiáng)拐點(diǎn)”,呈強(qiáng)線性特征,如固氮菌As101代謝物脂溶性成分清除DPPH自由基的能力可為今后挖掘高效抗氧化物質(zhì)提供參考。

        參考文獻(xiàn)

        [1] ?陳銀基,鞠興榮,周光宏.飽和脂肪酸分類與生理功能[J].中國油脂,2008,33(3):35-39.

        [2] LEVI L,WANG Z W,DOUD M K,et al.Saturated fatty acids regulate retinoic acid signalling and suppress tumorigenesis by targeting fatty acid-binding protein 5[J].Nature communications,2015,6:1-10.

        [3] ZHANG R N,PAN Q,ZHANG Z,et al.Saturated fatty acid inhibits viral replication in chronic hepatitis B virus infection with nonalcoholic Fatty liver disease by toll-like receptor 4-mediated innate immune response[J].Hepatitis monthly,2015,15(5):1-9.

        [4] 王煒,張偉敏.單不飽和脂肪酸的功能特性[J].中國食物與營養(yǎng),2005,11(4):44-46.

        [5] 劉跟生,徐貴發(fā).單不飽和脂肪酸對心血管的保護(hù)作用[J].衛(wèi)生研究,2006,35(3):357-359.

        [6] LUCHTMAN D W,SONG C.Cognitive enhancement by omega-3 fatty acids from child-hood to old age:Findings from animal and clinical studies[J].Neuropharmacology,2013,64:550-565.

        [7] JANSSEN C I,KILIAAN A J.Long-chain polyunsaturated fatty acids (LCPUFA) from genesis to senescence:The influence of LCPUFA on neural development,aging,and neurodegeneration[J].Progress in lipid research,2014,53:1-17.

        [8] 王萍,張銀波,江木蘭.多不飽和脂肪酸的研究進(jìn)展[J].中國油脂,2008,33(12):42-46.

        [9] SUMBUL A,ANSARI R A,RIZVI R,et al.Azotobacter:A potential bio-fertilizer for soil and plant health management[J].Saudi journal of biological sciences,2020,27(12):3634-3640.

        [10] ?FURINA E K,NIKOLAEVA D A,BONARTSEVA G A,et al.Reduction of nitrates by Azotobacter indicum and Azotobacter chroococcum cultures[J].Applied biochemistry & microbiology,2002,38(6):558-561.

        [11] CHAKRABORTY S K,BHATTACHARYYA A,CHOWDHURY A.Degradation of oxyfluorfen by Azotobacter chroococcum(Beijerink)[J].Bulletin of environmental contamination & toxicology,2002,69(2):203-209.

        [12] KUMAR P,BRAR S K,PANDOVE G,et al.Bioformulation of Azotobacter spp.and Streptomyces badius on the productivity,economics and energetics of wheat (Triticum aestivum L.)[J].Energy,2021,232:1-5.

        [13] NUERXIATI R,WUBULIKASIMU A,MUKHAMEDOV N,et al.Biological activity of fatty acids from lipids of Orchis chusua[J].Chemistry of natural compounds,2021,57(2):230-233.

        [14] 陳拾旸,劉風(fēng)英,陳會民,等.5株雙歧桿菌代謝產(chǎn)物及細(xì)胞中脂肪酸構(gòu)成的氣相色譜—質(zhì)譜分析[J].食品與機(jī)械,2021,37(4):19-25.

        [15] 甘永琦,朱斌.乳酶生菌種脂肪酸組分的GC-MS檢測分析[J].藥物分析雜志,2017,37(12):2145-2153.

        [16] 紀(jì)曉玲,白明生,石新衛(wèi).一株四合木鏈格孢發(fā)酵產(chǎn)物的脂肪酸組分GC-MS分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(26):15838-15839.

        [17] 朱育菁,蘇明星,黃素芳,等.培養(yǎng)條件對青枯雷爾氏菌脂肪酸組成的影響[J].微生物學(xué)通報(bào),2009,36(8):1158-1165.

        [18] 董強(qiáng),胡爾西丹·伊麻木,高艷華,等.不同品種鷹嘴豆油脂肪酸成分及生物活性研究[J].食品工業(yè),2018,39(11):176-179.

        [19] 趙海軍,魏芳,傅茂潤,等.加工工藝對牡丹籽油脂肪酸成分、理化性質(zhì)及抗氧化能力的影響[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào),2019,10(24):8377-8381.

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