張飛 劉雙 王昕怡 李和陽 馬勇 湯坤賢

摘要 ?對(duì)福建省東山灣一處海帶養(yǎng)殖區(qū)海水中浮游細(xì)菌群落進(jìn)行考察，以了解在海帶生長不同階段海洋浮游細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)變化特征。結(jié)果表明，在未掛養(yǎng)海帶前，海水中的優(yōu)勢(shì)浮游細(xì)菌為亞硫酸桿菌屬細(xì)菌，在海帶生長的凹凸期、薄嫩期、厚成期、成熟期，海水中優(yōu)勢(shì)浮游細(xì)菌分別為假單胞菌屬、普里斯特氏菌屬、假交替單胞菌屬、假交替單胞菌屬細(xì)菌。該研究深化了對(duì)海洋細(xì)菌與海帶相互作用的認(rèn)識(shí)，為海帶生長過程中的科學(xué)管理提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 ?海帶養(yǎng)殖區(qū)；海洋浮游細(xì)菌；群落結(jié)構(gòu)；東山灣

中圖分類號(hào) ?S 917.1 ??文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A ??文章編號(hào) ?0517-6611（2023）05-0061-03

doi： 10.3969/j.issn.0517-6611.2023.05.015

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Changes of the Community Structure of Marine Planktonic Bacteria in the Kelp Culture Area of Dongshan Bay

ZHANG Fei1，2，3，LIU Shuang1，WANG Xin-yi et al

（1.Third Institute of Oceanography，MNR，Xiamen，F(xiàn)ujian 361005;2.Fujian Provincial Key Laboratory of Marine Ecological Conservation and Restoration，Xiamen，F(xiàn)ujian 361005;3.Key Laboratory of Marine Ecological Conservation and Restoration，Ministry of Natural Resources，Xiamen，F(xiàn)ujian 361005）

Abstract ?The planktonic bacterial community in seawater of a kelp culture area in Dongshan Bay，F(xiàn)ujian Province was investigated to understand the changes of bacteria structure characteristics at different life stages of kelp.It was found that the dominant planktonic bacteria on a genus level were strains of Sulfitobacter before kelp was hooked and raised. Strains in Pseudomonas，Priestia and Pseudoalteromonas were dominant at different life stages of Saccharina japonica.This study deepened the understanding of the interaction between marine bacteria and kelp，and provided a theoretical basis for the scientific management of kelp growth process.

Key words ?Kelp culture area;Marine planktonic bacteria;Community structure;Dongshan Bay

我國于1927年開始引進(jìn)種植海帶，距今已有近百年歷史。海帶可以為人們提供海藻多糖、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，不但具有很高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值，同時(shí)也是工業(yè)上提取碘、甘露醇和海藻酸鈉的重要原料［1-4］。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)海帶除了具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值外，在其生長過程中還可以移除大氣中的CO2、增加海水氧含量、減緩海水富營養(yǎng)化，因而具有重要的生態(tài)價(jià)值［5］。我國是世界上最大的海帶養(yǎng)殖國家，海帶種植面積和產(chǎn)量均居世界首位［6］。福建是我國海帶養(yǎng)殖第一大?。?］，位于該省南部的東山灣多年來一直是海帶養(yǎng)殖的重要區(qū)域。

海帶等藻類在生長過程中會(huì)向周圍環(huán)境中釋放大量有機(jī)物，包括糖類、多肽、氨基酸等，為周圍的海洋細(xì)菌提供了營養(yǎng)物質(zhì)［8-10］。同時(shí)一些海洋細(xì)菌會(huì)與海藻競(jìng)爭(zhēng)環(huán)境中的無機(jī)營養(yǎng)［11-12］，在其生長代謝過程中產(chǎn)生的維生素、激素對(duì)海藻產(chǎn)生影響［13-14］，甚至本身就是致病菌，使海帶等藻類致病或死亡［15-16］。該研究將考察處于東山灣的海帶養(yǎng)殖區(qū)中海洋浮游細(xì)菌在海帶不同生長階段的群落結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，進(jìn)一步了解海洋細(xì)菌與海帶的相互作用，為海帶生長過程中的科學(xué)管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣區(qū)域及方法

采樣區(qū)域位于福建省漳州市東山灣 一處多年海帶養(yǎng)殖區(qū)（117°32′7.33″E，23°47′58.23″N），分別于2021年10月23日、12月3日、2022年1月25日、4月6日、5月10日采集該區(qū)域表層海水（0 m）。取約30 mL海水存放于50 mL 無菌離心管中，保存于0～ 4 ℃直到進(jìn)一步分析。

1.2 樣品處理

1.2.1 ???海洋細(xì)菌分離。吸取 “1.1” 海水1 mL加至49 mL滅菌海水中，混勻后吸取50 μL于無菌2216E固體培養(yǎng)基（蛋白胨5.0 g/L，酵母膏1.0 g/L，海鹽 31 g/L，瓊脂16 g/L，pH為7.2～7.4）上均勻涂布，25 ℃培養(yǎng)2～3 d，直到培養(yǎng)基上出現(xiàn)若干直徑2～3 mm單菌落。隨機(jī)挑選50～100個(gè)上述單菌落做好標(biāo)記，分別于2216E固體培養(yǎng)基上劃線純化，對(duì)純化后的單菌落進(jìn)行保種。

1.2.2 ???海洋細(xì)菌基因組DNA提取及16S rRNA序列擴(kuò)增。 挑取上述單菌落進(jìn)行2216E液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，后吸取0.5 mL 菌液利用基因組DNA提取試劑盒（TIAN amp Bacteria DNA Kit，DP302）提取細(xì)菌基因組DNA。16S rRNA序列擴(kuò)增采用27F和1492R引物，具體參考郭亞平［17］的方法。

1.2.3 ???16S rRNA序列測(cè)序及比對(duì)。PCR擴(kuò)增后的16S rRNA序列送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序，將拼接后的測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫已有序列進(jìn)行比對(duì)分析，根據(jù)與其親緣關(guān)系最近的參考菌株確定該菌株的分類信息。

1.3 數(shù)據(jù)處理 ???試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2019進(jìn)行整理和分析。

2 結(jié)果與分析

基于屬水平的不同時(shí)間點(diǎn)東山灣海帶養(yǎng)殖區(qū)海洋浮游細(xì)菌構(gòu)成及相對(duì)豐度見表1。2021年10月，該海帶養(yǎng)殖區(qū)還未掛養(yǎng)海帶，因此可作為對(duì)照組。

2021年10月份的海水樣品中，亞硫酸桿菌屬（Sulfitobacter）細(xì)菌占主導(dǎo)地位，在已分離的52株海洋細(xì)菌中，其相對(duì)豐度可達(dá)88.46%，處于第二位的是鹽堿芽孢桿菌屬（Alkalihalobacillus）細(xì)菌，但是相對(duì)豐度僅有5.77%。2021年12月（凹凸期）的樣品中，分離到的84株細(xì)菌全部屬于假單胞菌屬（Pseudomonas）。在2022年1月份，海帶大致處于生長階段的薄嫩期，此時(shí)環(huán)境中的浮游細(xì)菌以普里斯特氏菌屬（Priestia）和芽孢桿菌屬（Bacillus）為主，二者占比分別為53.62%和42.03%，鹽堿芽孢桿菌屬和地芽孢桿菌屬（Geobacillus）細(xì)菌占少數(shù)。2022年4月份（厚成期）樣品中，假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）菌株占絕對(duì)多數(shù)，其比例可達(dá)93.33%，亞硫酸桿菌屬和弧菌屬（Vibrio）細(xì)菌分別占比5.00%和1.67%。在海帶處于成熟期的2022年5月份樣品中，細(xì)菌多樣性明顯高于其他時(shí)間點(diǎn)的多樣性；在已篩選到的50株海洋細(xì)菌中，假交替單胞菌屬細(xì)菌占比為42.00%，其次為寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）細(xì)菌，其占比為20.00%；嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）和尼爾氏菌屬（Niallia）細(xì)菌占比分別為8.00%和6.00%，亞硫酸桿菌屬、奧利氏菌屬（Olleya）、弧菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）、微桿菌屬（Microbacterium）占比均為4.00%，交替單胞菌屬（Alteromonas）和中溫黃桿菌屬（Mesoflavibacter）細(xì)菌占比均為2.00%。

3 討論

根據(jù)不同生長發(fā)育階段，海帶孢子體大體可以分為幼齡期、凹凸期、薄嫩期、厚成期、成熟期和衰老期［18］。該研究的采樣時(shí)間除2021年10月作為無海帶掛養(yǎng)的對(duì)照組外，2021年12月、2022年1月、4月、5月大致分別對(duì)應(yīng)于海帶生長的凹凸期、薄嫩期、厚成期和成熟期。在海帶的不同生長階段，不僅形態(tài)特征差異較大，與周圍環(huán)境的相互作用也各不相同。研究在海帶不同生長階段養(yǎng)殖區(qū)海水中浮游細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)特征，具有重要的代表性。

該研究采用經(jīng)典的野外采樣、分離培養(yǎng)、純菌株篩選、分析鑒定的方法，雖然可以在一定程度上反映出在海帶不同生長階段周圍海水中浮游細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)特征，包括細(xì)菌群落中的優(yōu)勢(shì)菌群，但是由于培養(yǎng)條件的選擇性（包括培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)溫度等），篩選用于測(cè)序菌落的隨機(jī)性，不可避免地導(dǎo)致最終結(jié)果可能無法完全反映出培養(yǎng)現(xiàn)場(chǎng)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征。比如在該研究2021年12月的樣品中，已測(cè)序的所有84株細(xì)菌在屬水平上全部屬于假單胞菌屬，更體現(xiàn)出此方法的局限性。雖然采用此方法可以獲得用于進(jìn)一步研究的菌株資源，但是需要結(jié)合諸如宏基因組分析的方法，才能更全面了解培養(yǎng)現(xiàn)場(chǎng)的細(xì)菌群落，尤其是針對(duì)一些難培養(yǎng)細(xì)菌及在細(xì)菌群落中占比較小細(xì)菌的信息。

2021年10月份的樣品中，亞硫酸桿菌屬細(xì)菌占可培養(yǎng)細(xì)菌的88.46%，處于明顯的主導(dǎo)地位?？赡艿脑?yàn)榇藭r(shí)海區(qū)尚未有海帶苗掛養(yǎng)，且該海區(qū)經(jīng)過近半年沒有大型海藻等生產(chǎn)者對(duì)有機(jī)碳的輸入，因此溶解有機(jī)碳和顆粒有機(jī)碳均處于較低水平。亞硫酸桿菌屬細(xì)菌是一類嚴(yán)格的有機(jī)化能營養(yǎng)菌，在有機(jī)碳源存在的情況下，它們可以利用硫代硫酸鹽和亞硫酸的氧化為其生命活動(dòng)提供能量［19］，因此在有機(jī)物較缺乏的環(huán)境中具有生長優(yōu)勢(shì)。2021年12月，此時(shí)海帶大致處于凹凸期，發(fā)現(xiàn)此樣品中浮游細(xì)菌在屬水平上全部屬于假單胞菌屬。在第一次測(cè)序約50株細(xì)菌后，又隨機(jī)挑選了30多株，共84株細(xì)菌測(cè)序后，仍發(fā)現(xiàn)所獲得的菌株全部屬于假單胞菌屬。假單胞菌屬是一個(gè)很大的屬，截至目前（2022年7月15日）共有505種細(xì)菌［20］，同時(shí)有很多種分離自海洋環(huán)境；來源于海洋環(huán)境的該屬細(xì)菌很多可以產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，包括抑菌物質(zhì)等［21］，這可能是在這一樣品中出現(xiàn)大量假單胞菌屬細(xì)菌的原因之一。2022年1月的樣品中存在較多的普里斯特氏菌屬和芽孢桿菌屬細(xì)菌，還包括鹽堿芽孢桿菌屬和地芽孢桿菌屬細(xì)菌，它們都屬于芽孢桿菌科（Bacillaceae）。多數(shù)芽孢桿菌會(huì)形成內(nèi)生孢子，抗逆性較強(qiáng)，可分泌多種蛋白酶對(duì)外界蛋白質(zhì)消化利用［22］，這可能是此樣品中海洋浮游細(xì)菌多為芽孢桿菌的原因之一。2022年4月的樣品中假交替單胞菌屬細(xì)菌占絕大多數(shù)。已有研究表明某些來源于海洋環(huán)境的這一屬細(xì)菌可以合成生物活性分子，這些活性分子具有抗菌、溶菌、裂解及殺滅藻類的活性，進(jìn)而在競(jìng)爭(zhēng)營養(yǎng)物質(zhì)和形成菌落方面發(fā)揮優(yōu)勢(shì)［23］。2022年5月，海帶大致處于成熟期，海帶藻體生物量已累積到最大且不再明顯增多；此時(shí)海帶葉片產(chǎn)生孢子囊群并伴隨著游孢子的放散，大量的顆粒和溶解有機(jī)碳進(jìn)入水體，進(jìn)而為不同種類的海洋細(xì)菌提供了碳源和能源，這可能是此時(shí)間點(diǎn)海洋浮游細(xì)菌多樣性最高的原因之一；作為此樣品中相對(duì)豐度第二的寡養(yǎng)單胞菌屬，它們具有較特殊的生存策略，某些該類細(xì)菌與植物關(guān)系密切，甚至可以通過改變植物葉片表面的性質(zhì)來提高自身的附著能力，因此可能在與其他浮游細(xì)菌的競(jìng)爭(zhēng)中獲得優(yōu)勢(shì)。

海帶在生長過程中會(huì)產(chǎn)生大量的顆粒及溶解有機(jī)碳［24］，在生長不同階段的海帶產(chǎn)生不同種類和數(shù)量的有機(jī)碳是影響浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的關(guān)鍵因素。當(dāng)然，伴隨著海帶生長不同階段的溫度、溶解氧等其他環(huán)境因素也是造成海帶生長環(huán)境中浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的重要原因。

4 結(jié)論

通過對(duì)福建省東山灣一處海帶養(yǎng)殖區(qū)中海洋浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在海帶養(yǎng)殖期間的分析，發(fā)現(xiàn)在未掛養(yǎng)海帶前，海水中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為亞硫酸桿菌屬細(xì)菌。在海帶生長的凹凸期、薄嫩期、厚成期、成熟期，海水中優(yōu)勢(shì)浮游細(xì)菌分別為假單胞菌屬、普里斯特氏菌屬、假交替單胞菌屬、假交替單胞菌屬細(xì)菌，但在成熟期海水中浮游細(xì)菌的多樣性更高。伴隨著海帶生長的不同階段，養(yǎng)殖區(qū)中的優(yōu)勢(shì)浮游細(xì)菌群落也發(fā)生更替。

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