張利娜 王蕊嘉 謝雨琪 王天喜 吳學(xué)尉 李文涵 趙青青

摘要 ?以珠芽魔芋葉片作為外植體，通過培養(yǎng)溫度、活性炭以及培養(yǎng)光暗條件的改變等簡單易操作的方式，探索抑制組織褐變的最佳環(huán)境條件。結(jié)果表明，與光照相比，黑暗培養(yǎng)條件可以有效抑制魔芋葉片組織褐變，褐變率僅為 5.88%；溫度和活性炭處理對珠芽魔芋葉片褐變的抑制效果均不佳。

關(guān)鍵詞 ?珠芽魔芋；葉片；褐變

中圖分類號 ?S 632.3 ??文獻標識碼 ?A ??文章編號 ?0517-6611（2023）05-0037-04

doi： 10.3969/j.issn.0517-6611.2023.05.010

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Study on Browning Inhibition of Amorphophallus bulbifer Leaf Tissue Culture

ZHANG Li-na，WANG Rui-jia，XIE Yu-qi ?et al

（College of Agriculture， Yunnan University， Kunming， Yunnan 650504）

Abstract ?Amorphophallus bulbifer leaves were used as explants to explore the optimal environmental conditions for inhibiting tissue browning through simple and easy operation methods such as culture temperature， activated carbon and the change of light and dark conditions. The results showed that compared with light culture， dark culture conditions could effectively inhibit the browning of konjac leaves， and the browning rate was only 5.88%.The inhibitory effects of temperature and activated carbon treatment on the browning of konjac leaves were poor.

Key words ?Amorphophallus bulbifer;Leaves;Browning

珠芽魔芋是近年來已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的一類可食用魔芋，因葡甘聚糖含量高、抗病能力強、種植范圍廣等優(yōu)良特性，在食品、醫(yī)藥、工業(yè)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，有較高經(jīng)濟價值，可作為林下經(jīng)濟作物種植，發(fā)展立體農(nóng)業(yè)，帶動山區(qū)經(jīng)濟增長，具有良好的產(chǎn)業(yè)開發(fā)與市場前景［1-3］。珠芽魔芋生產(chǎn)中多采用葉面球莖或地下球莖切塊的方式進行繁殖［4］。但目前珠芽魔芋種球生長周期長，繁殖率較低，原種、原原種、種芋數(shù)量嚴重不足［5］，不能滿足市場與日俱增的種苗需求，利用組培快繁技術(shù)可以很好地解決這些問題。但魔芋組織培養(yǎng)嚴重的褐變現(xiàn)象，阻礙了魔芋組培苗的規(guī)?；l(fā)展。

組織褐變是組織培養(yǎng)中的一個普遍現(xiàn)象，主要是由于酚類化合物積累氧化形成有毒性的棕褐色物質(zhì)，抑制組織生長，在組培過程中該物質(zhì)還會在培養(yǎng)基中擴散，抑制其他外植體生長，直至死亡［6］。目前，大多通過在培養(yǎng)基中添加褐變抑制劑，改善培養(yǎng)條件來抑制褐變，提高組培成功率［7-8］。如在草莓莖尖培養(yǎng)時，黑暗預(yù)處理可減輕草莓莖尖褐變發(fā)生程度，提高莖尖萌發(fā)率，但單一黑暗處理并不能抑制褐變的發(fā)生［9］。低溫條件下，酶活性下降，可有效抑制酚類物質(zhì)的生物合成，進而減輕褐變。還可通過添加吸附劑的方式來吸附已產(chǎn)生的酚類物質(zhì)，抑制褐化。如在培養(yǎng)基中添加一定濃度具有吸附作用的活性炭或抑制酚類物質(zhì)產(chǎn)生的化學(xué)抑制劑等［10］。但導(dǎo)致褐變的原因多種多樣，化學(xué)抑制劑的添加一定程度上對愈傷組織的形成有負面影響。

目前魔芋組織培養(yǎng)主要是以球莖、根狀莖、實生籽、葉柄、芽鞘、花序軸、葉片等作為外植體。2001 年，研究者使用白魔芋和花魔芋的根莖、塊莖及種子誘導(dǎo)愈傷，發(fā)現(xiàn)魔芋離體繁殖產(chǎn) 生的擬塊莖也可作為繁殖器官，直接用作種芋［11］。隨后組培研究逐漸深入，研究者以根狀莖和實生籽為試驗對象，優(yōu)化培養(yǎng)基配方，120 d即可生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的魔芋組培苗［12］，極大地縮短了魔芋種球繁殖周期。然而魔芋根狀莖、實生籽、花序軸需要生長 3 年以上的魔芋球莖才能產(chǎn)生，作為外植體材料獲取困難。相比于花魔芋，珠芽魔芋組培研究起步較晚，相關(guān)報道較少，外植體主要集中在芽鞘、葉柄和葉片［13-15］。

葉片是組織培養(yǎng)中最大量且易得的外植體材料。魔芋近緣物種紅掌的組培再生體系中，葉片因為其誘導(dǎo)率高，愈傷組織質(zhì)地緊密，后期生長快速等成為最合適的外植體材料［16］。魔芋中，研究者以魔芋塊莖、芽、葉柄、葉片作為外植體材料，愈傷誘導(dǎo)率均不高且存在嚴重褐變的情況［17］。另有研究者根據(jù)葉的生長時期不同，以葉芽、開始伸出鱗片葉片、完全伸出鱗片葉片、剛展開的葉片和成熟的葉片 5 個不同發(fā)育時期的葉片作為組培外植體［15］，結(jié)果表明，葉片具有較高的愈傷誘導(dǎo)率且能夠再生成苗，但組織褐變嚴重，有關(guān)珠芽魔芋葉片褐變抑制的相關(guān)研究尚未見報道，褐變?nèi)允侵萍s魔芋組培技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵難題。

筆者以珠芽魔芋葉片作為外植體，通過設(shè)置光照和黑暗的培養(yǎng)條件，不同溫度條件和培養(yǎng)基是否添加活性炭等培養(yǎng)方式，探究抑制珠芽魔芋葉片組培褐變的最佳培養(yǎng)方法，為珠芽魔芋葉片組織的高效誘導(dǎo)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2020 年從云南省臨滄市獲得珠芽魔芋葉面球莖，低溫解除休眠后種植于云南省昆明市云南大學(xué)溫室大棚內(nèi)，展葉后隨機采取不同株的葉片作為外植體材料開展組織培養(yǎng)試驗。

1.2 方法

1.2.1 ???外植體消毒。

將采集到的葉片浸泡在加有洗潔劑的自來水中浸泡5 min將表面刷洗干凈；葉片裝入網(wǎng)袋流水沖洗30 min，擦拭表面水分后放入已滅菌的超凈工作臺中；在超凈工作臺中，75%乙醇浸泡葉片30 s，無菌水清洗3次，每次2 min；使用2%次氯酸鈉浸泡葉片8 min，無菌水清洗5次，每次2 min；濾紙吸干葉片表面多余水分后，剪切成0.2～0.5 cm2大小用于后續(xù)試驗。

1.2.2 ???不同激素處理。

將經(jīng)過表面消毒后的魔芋葉片剪成0.2～0.5 cm2大小，接種在含有不同激素類型和濃度的培養(yǎng)基中。具體配方為NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L（A1），

NAA 05 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L（A2），

NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L（A3），

NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+TDZ 0.5 mg/L（A4），

NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+TDZ 1.0 mg/L（A5）。

14 d更換一次培養(yǎng)基，28 d后進行愈傷誘導(dǎo)和褐變統(tǒng)計。

1.2.3 ???不同培養(yǎng)環(huán)境。

葉片剪切成0.2～0.5 cm2大小作為外植體，接種在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA培養(yǎng)基中，每瓶接種10個外植體，設(shè)置光照培養(yǎng)（1 500 lx）或暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度22或25 ℃，是否添加0.5%活性炭組合的培養(yǎng)條件。14 d更換一次培養(yǎng)基，28 d后進行愈傷誘導(dǎo)和褐變統(tǒng)計。各處理條件見表1。

1.2.4 ???褐變評定指標。

培養(yǎng)28 d后對材料進行統(tǒng)計，材料邊緣因剪切引起的褐變不計入統(tǒng)計內(nèi)。由培養(yǎng)材料本身性質(zhì)和不良培養(yǎng)條件引起的褐變會在培養(yǎng)過程中向葉片中部擴散，統(tǒng)計時將褐變面積超過接種材料面積50%及以上的材料記為褐變。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 ???統(tǒng)計所得數(shù)據(jù)采用 IBM SPSS Statistics 25 軟件進行統(tǒng)計分析。

褐變率= 褐變外植體數(shù)量/無污染的接種外植體總數(shù)×100%

愈傷誘導(dǎo)率= 愈傷組織數(shù)量/無污染的接種外植體總數(shù)× 100%

2 結(jié)果與分析

2.1 激素處理對葉片褐變的影響

以接種在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葉片作為對照，其余葉片接種在含不同濃度 2，4-D 和 TDZ 的培養(yǎng)基中。由表2可知，葉片在愈傷誘導(dǎo)率和褐變率方面與對照有明顯差異，褐變率均高于對照。低濃度的 2，4-D 的愈傷誘導(dǎo)效果明顯優(yōu)于同濃度的 TDZ，但褐變率較高，接種于1.0 mg/L 的 2，4-D 或 TDZ 培養(yǎng)基中的材料褐變率均明顯升高，同時愈傷誘導(dǎo)也被抑制（圖1）。

2.2 黑暗處理對葉片褐變抑制效果

將接種在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA培養(yǎng)基和接種在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.5%活性炭培養(yǎng)基中的葉片培養(yǎng)在22或25 ℃無光照的黑暗條件下。結(jié)果表明，黑暗條件下，添加活性炭的培養(yǎng)材料在22、25 ℃條件下褐變均較不添加活性炭的材料嚴重，25 ℃時褐變率最高可達 7679%。不添加活性炭的外植體材料褐變率明顯較低，葉片褐變率最低為 588%，同時可保持較高的愈傷誘導(dǎo)率。2種培養(yǎng)溫度下外植體褐變率差異不顯著（表3、圖2）。

2.3 光照處理對葉片褐變抑制效果

將接種在 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA 培養(yǎng)基和接種在 MS+1.0 mg/L ?6-BA+0.5 mg/L NAA+0.5% 活性炭培養(yǎng)基中的葉片培養(yǎng)在22或25 ℃ 光照條件下。結(jié)果表明，光照條件下，不添加活性炭的外植體材料褐變率明顯較低，葉片褐變率最低為 12.67%，2種培養(yǎng)溫度下的外植體褐變率差異不顯著（表4、圖3）。

2.4 培養(yǎng)期葉片褐變情況

外植體隨著培養(yǎng)時間的增加，褐變從葉片邊緣逐漸向中部擴散，褐變的材料數(shù)量逐漸增多。培養(yǎng)7 d時材料無明顯變化，部分材料因機械損傷，葉片邊緣輕微褐變卷曲；培養(yǎng)14 d時有愈傷形成，褐變面積擴大，數(shù)量增多；培養(yǎng)21 d時，褐變擴散至材料中部，褐變數(shù)量增幅最大并出現(xiàn)少量的全葉片褐化，培養(yǎng)28 d，已褐變材料逐漸全葉片褐變，進而導(dǎo)致材料死亡。褐變后的材料幾乎不形成新的愈傷組織，因褐變擴散還會致使已形成愈傷的材料死亡，導(dǎo)致愈傷數(shù)量的減少（圖4）。

3 結(jié)論

該試驗結(jié)果表明，珠芽魔芋葉片組培，外源激素的添加都會造成組織一定程度的褐變，不添加活性炭，22 ℃ 低溫黑暗培養(yǎng)條件下組織褐變率最低且最有利于愈傷的形成，在不添加活性炭、25 ℃ 培養(yǎng)條件下，光照和黑暗培養(yǎng)對組織褐化的抑制效果不存在明顯差異，組織褐變與愈傷形成之間存在明顯的負相關(guān)性。研究還發(fā)現(xiàn)，葉片培養(yǎng)14 d時，褐變率大幅提高，28 d時，全褐變材料死亡，無法繼續(xù)誘導(dǎo)產(chǎn)生新的愈傷組織，在珠芽魔芋莖段組培試驗中也得到相似結(jié)果。說明褐變率突增發(fā)生在材料接種后14 d，此時也是愈傷組織開始形成的時期，活性炭在組織培養(yǎng)前期能夠有效吸附酚類物質(zhì)，減輕材料褐變，但在材料生長后期，活性炭對愈傷組織的生長和增殖有強烈的抑制作用，須在褐變大量形成前及時將材料轉(zhuǎn)移至新的不含活性炭的培養(yǎng)基中，以獲得更多的愈傷組織。

4 討論

魔芋組培再生體系成功建立的關(guān)鍵因素在于成功誘導(dǎo)愈傷的前提下有效抑制褐變的發(fā)生。組織培養(yǎng)材料褐變可分為酶促褐變和非酶促褐變，除外植體本身性質(zhì)外，操作過程中的機械損傷和不適宜的環(huán)境條件也易造成褐變［18-19］。魔芋本身葉片革質(zhì)，細胞壁較厚，在外植體消毒過程中起一定的保護作用，但細胞內(nèi)酚類物質(zhì)含量較高，外植體接種過程，不可避免會造成材料損傷，因此魔芋褐變問題十分突出。

研究者通過添加化學(xué)抑制劑聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、維生素 C（VC）、天冬氨酸（ASP）等來抑制和吸附酚類物質(zhì)產(chǎn)生和擴散［20-22］。不同的化合物在抑制褐變的機制上不同，效果差異也很大。一些試驗中化學(xué)物質(zhì)的添加雖然減少了褐變，但同時也抑制了愈傷的形成［21，23］。另有研究表明，組培中常見的植物生長調(diào)節(jié)劑 2，4-D 可通過抑制多酚生物合成中的酶來減少酚類化合物的合成從而減輕組織褐變，但同樣對愈傷組織的形成有抑制作用［24］，這與該試驗結(jié)果相似，高濃度的 2，4-D 不僅降低材料的愈傷發(fā)生率，同時顯著增加了組織褐變，因此化學(xué)物質(zhì)的添加具有兩面性。

引起組織褐變的因素很多，如外植體生理狀態(tài)、取材部位、消毒方法、培養(yǎng)基成分等［25］，但總體而言，酶促褐變是植物組織培養(yǎng)中外植體褐變的主要原因，也是造成愈傷誘導(dǎo)率低的主要原因。一方面，由于外植體剪切造成植物損傷，誘使植物發(fā)生抗逆反應(yīng)，促使大量酚類物質(zhì)的產(chǎn)生，破壞組織代謝，抑制生長，最終導(dǎo)致外植體褐變和死亡；另一方面，外植體接種于透氣性、流動性差的固體培養(yǎng)基中，加速了有害物質(zhì)的積累，引起外植體死亡，進而降低愈傷誘導(dǎo)率。該試驗對愈傷誘導(dǎo)和褐變進行了相關(guān)關(guān)系分析，結(jié)果顯示其皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.765，說明愈傷誘導(dǎo)率和褐變率之間呈顯著負相關(guān)，因此要提高外植體出愈率，建立高效再生體系，抑制組織褐變必不可少。在其他褐變嚴重的植物研究中，如核桃，研究者通過對比不同培養(yǎng)基質(zhì)中材料的褐變程度，發(fā)現(xiàn)多酚氧化酶 PPO（poly-phenol oxidases）在褐變過程中起重要作用［26］，有研究者通過轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出與愈傷形成和組織褐變的相關(guān)基因［21］。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，魔芋遺傳研究逐步深入，花魔芋染色體級別的基因組測序完成［27］，為珠芽魔芋遺傳改良提供了寶貴的基因組數(shù)據(jù)，未來或可通過遺傳改良來解決組織褐變問題。

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