丁彥敏,袁顥宸,王寧

山東中醫(yī)藥大學,山東 濟南 250355

中藥梔子是茜草科植物梔子的干燥成熟果實,其主要功效為瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒,外用涼血消腫,臨床用于熱病心煩、濕熱黃疸、淋證澀痛、血熱吐衄、目赤腫痛、火毒瘡瘍等,也可外用以治療扭挫傷痛[1]。梔子入選第一批藥食兩用中藥材目錄,逐漸被人們了解,并在日常生活中得到廣泛應用[2]。近年來,梔子導致腎損傷的報道逐漸增多[3-5],但是相關作用機制的報道比較少。本研究基于網(wǎng)絡藥理學研究方法,系統(tǒng)分析藥物與疾病和靶點之間的關系網(wǎng)絡,探討梔子導致腎損傷的作用機制,為藥食兩用中藥梔子的應用提供思路和借鑒。

1 資料與方法

1.1 梔子活性成分與靶點的篩選采用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,https://tcmspw.com/tcmsp.php)篩選梔子活性成分和潛在靶點,設定篩選活性成分的條件為口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且類藥性指數(shù)(drug-likeness,DL)≥0.18;在Uniprot蛋白質數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將梔子活性成分相關靶點信息校準為標準基因名。另外在中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(traditional Chinese medicine integrated database,TCMID,http://www.megabionet.org/tcmid/)檢索梔子化學成分,并在Swiss Target Prediction平臺(http://www.swisstargetprediction.ch/)預測基因靶點。把兩次所得靶點合并取交集作為梔子活性成分的靶點。

1.2 腎損傷靶點的篩選以“kidney injury”為關鍵詞,在NCBI臨床突變數(shù)據(jù)庫(ClinVar,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)、人類基因注釋數(shù)據(jù)庫(GeneCards,https://www.genecards.org/)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man,OMIM,https://omim.org/)和治療靶點數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database,TTD,http://db.idrblab.net/ttd/)檢索腎損傷的相關靶點。若GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得靶點過多,則設置score≥中位數(shù)進行篩選。將得到的疾病靶點匯總并去除重復值,獲得腎損傷疾病靶點。

1.3 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡的構建通過Venny軟件對藥物相關靶點與疾病靶點取交集,獲得梔子導致腎損傷的潛在靶點。在Cytoscape 3.8.0中構建“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡。以“節(jié)點”(node)代表屬性類型,即藥物、活性成分、靶點和疾病,“邊”(edge)代表交互關系。采用 Cytoscape的Network Analyzer工具分析所構建的網(wǎng)絡,結果中連接度(degree)越大,涉及的生物功能越多,重要性越高。

1.4 蛋白質互作網(wǎng)絡(protein-protein interaction networks,PPI)構建將梔子導致腎損傷的靶點提交至STRING 11.0平臺,物種選擇“Homo sapiens”,設定“highest confidence>0.9”并隱藏游離節(jié)點,獲取蛋白質互相作用圖,構建PPI網(wǎng)絡,根據(jù)結果對靶點蛋白進行分析。

1.5 富集分析通過Metascape平臺(http://metascape.org)對靶點進行富集分析,將藥物與疾病交集靶點導入Metascape平臺進行基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號通路富集分析。GO分析解釋關鍵靶點導致腎損傷的生物過程,KEGG富集分析研究其相關信號通路?；贙EGG結果,選取前10條通路,運用Cytoscape3.8.0構建“關鍵通路-潛在靶點-化學成分”網(wǎng)絡進一步篩選梔子導致腎損傷的關鍵靶基因及有效活性成分。

1.6 分子對接檢索ZINC數(shù)據(jù)庫(http://zinc.docking.org/)下載梔子活性成分的PDB格式文件,并選為配體。檢索RSCB PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)并下載靶點蛋白的3D結構,選為受體。利用AutoDock Vina軟件進行分子處理和對接,用PyMOL軟件進行圖像的可視化分析。一般認為,結合能≤-5.5 kcal·mol-1為結合活性好,結合構象穩(wěn)定。

2 結果

2.1 梔子靶點基因的獲取從TCMSP獲取梔子活性成分靶點基因,在Uniprot數(shù)據(jù)庫標準化后獲得靶點基因176個;從TCMID數(shù)據(jù)庫獲取梔子化學成分,并在Swiss Target Prediction預測后獲得靶點基因871個。匯總去重后共獲得化學成分119個,靶點基因920個。

2.2 疾病靶點及潛在靶點的獲取在GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得腎損傷潛在靶點為8 233個,根據(jù)經驗以score≥中位數(shù)為篩選條件,第1次篩選設置score≥3.39,獲得4 120個靶點;第2次篩選設置score≥6.955,獲得2 060個靶點;第3次篩選設置score≥11.555,獲得1 030個靶點作為腎損傷的潛在靶點。在ClinVar、TTD、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索“kidney injury”,分別得到168個、3個、74個靶點,匯總并去重后,共獲得 1 234 個疾病靶點。通過Venny將藥物與疾病靶點取交集,共得到244個梔子導致腎損傷的潛在靶點,見圖1。

2.3 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡的構建運用Cytoscape 3.8.0構建“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡,見圖2。綠色圓形表示梔子活性成分,藍色菱形表示靶點基因,黃色六邊形表示疾病,紫色三角形表示藥物。該網(wǎng)絡節(jié)點大小代表相應的Degree值,Degree值越大則節(jié)點面積越大。化合物Degree值前四位是槲皮素(quercetin)、urushio iii、5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮(5,7,3′,4′,5′-pentamethoxyflavone)和綠原素(chlorogenin),這可能是梔子導致腎損傷的主要活性成分。靶點基因Degree值排名前5位是PTGS2、AKR1B1、ADORA2A、MMP2、KDR。

圖2 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡

2.4 PPI網(wǎng)絡的構建在STRING平臺構建PPI網(wǎng)絡,見圖3。PPI網(wǎng)絡中包含244個節(jié)點和1 240條邊,并將出現(xiàn)頻率前10位的靶點繪制條形圖,見圖4。蛋白互作頻次較高的有AKT1、APP、HRAS、EGFR、CTNNB1等,說明梔子活性成分與腎損傷有較高結合活性,可以認為是梔子導致腎損傷的關鍵靶點。

圖3 潛在靶點PPI網(wǎng)絡

圖4 關鍵靶點蛋白互作頻次圖

2.5 富集分析在Metascape平臺上對244個交集靶點進行GO和KEGG分析。GO分析共得到3 607個條目,其中分子功能(molecular function,MF)285個,細胞組分(cellular component,CC)185個,生物學過程(biological process,BP)3 137個,以P<0.01為篩選條件,共得到497個條目,分別從MF、CC、BP中選擇排名前10位的條目做GO富集分析三合一柱狀圖,見圖5。涉及的主要GO進程有對有毒物質的反應(response to toxic substance)、積極調控細胞遷移(positive regulation of cell migration)、細胞對有機氮化合物的反應(cellular response to organonitrogen compound)、對細胞外刺激的反應(response to extracellular stimulus)、對無機物的反應(response to inorganic substance)、膜筏(membrane raft)、蛋白酶結合(protease binding)和磷酸酶結合(phosphatase binding)等。

圖5 GO富集分析圖

KEGG分析得到379條信號通路,以P<0.01為篩選條件,則得到276條信號通路。取排名前20位的信號通路繪制KEGG氣泡圖,見圖6。每張圖左側為排名靠前的通路名稱,橫軸代表該通路基因所占總體輸入基因的比率,氣泡大小表示富集到靶標的數(shù)量,氣泡顏色由紅到綠表明P值由大到小,紅色氣泡越大說明該條信號通路的重要性越高。KEGG結果包括癌癥通路(pathways in cancer)、癌癥中的蛋白聚糖(proteoglycans in cancer)、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、cAMP信號通路(cAMP signaling pathway)和癌癥中的轉錄失調(transcriptional misregulation in cancer)等。

注:Ratio為某通路基因所占總體輸入基因的比率。圖6 KEGG氣泡圖

運用Cytoscape 3.8.0構建“關鍵通路-潛在靶點-化學成分”網(wǎng)絡以進一步揭示信號通路與候選靶標及活性成分之間的關系,見圖7。從網(wǎng)絡中可知,活性成分Degree值前3位為槲皮素(quercetin)、urushio iii和5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮(5,7,3′,4′,5′-pentamethoxyflavone),可能是梔子導致腎損傷的主要活性物質,與“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡中一致。根據(jù)Degree值篩選得到的關鍵靶基因為PTGS2、AKR1B1、ADORA2A、MMP2、EGFR、KDR等。

圖7 “關鍵通路-潛在靶點-化學成分”網(wǎng)絡圖

2.6 分子對接分析檢索文獻發(fā)現(xiàn),槲皮素(quercetin)與5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮沒有導致腎損傷的直接證據(jù),urushio iii則暫未有臨床或實驗研究證明其有導致腎損傷的作用。而梔子苷是梔子的主要成分,《中華人民共和國藥典》將其作為梔子質量評價的目標成分[1],且有文獻報道梔子苷具有腎毒性[6-8],故本研究將梔子苷(geniposide)選擇為配體,根據(jù)Degree值選擇“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡排名前5位、PPI網(wǎng)絡排名前10位以及“關鍵通路-潛在靶點-化學成分”網(wǎng)絡排名前6位的靶點作為受體進行分子對接,結果見表1,選取對接結合能較小的4個結果展示,見圖8。梔子苷與靶點蛋白APP在DG9、DG10、DG15氨基酸位點結合生成氫鍵;梔子苷與MMP2在ASP622氨基酸位點結合生成氫鍵;梔子苷與AKR1B1在ARG3、LYS11氨基酸位點結合生成氫鍵;梔子苷與AKT1在ARG215、ARG320氨基酸位點結合生成氫鍵。結果表明,梔子苷與靶點蛋白APP、MMP2、AKR1B1、AKT1之間有良好的結合活性。

表1 梔子活性成分與靶點蛋白對接結果

3 討論

梔子作為藥食兩用中藥材,具有保肝利膽、抗炎、降血脂、促進胰腺分泌、保護神經、抗氧化、抗血栓等作用[9],但是目前有研究報道,梔子有腎毒性,明確其毒理機制具有重要意義。網(wǎng)絡藥理學可以作為橋梁來聯(lián)系中藥與現(xiàn)代藥理學,從系統(tǒng)上揭示中藥對機體網(wǎng)絡的調控作用,更加全面地認識中藥的作用機制。因此,本研究運用網(wǎng)絡藥理學探討梔子導致腎損傷的毒理機制,以期為梔子的臨床和食品應用安全提供參考。

基于網(wǎng)絡藥理學方法及既往研究發(fā)現(xiàn),梔子苷(geniposide)、槲皮素(quercetin)、5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮(5,7,3′,4′,5′-pentamethoxyflavone)和urushio iii可能是梔子導致腎損傷的主要活性成分。馮筱懿等[6-7]研究發(fā)現(xiàn),在梔子苷相同劑量(100 mg·kg-1)的條件下,短期(3 d)給藥對大鼠腎功能影響較小,長期(90 d)給藥則會對部分大鼠腎臟造成損傷,但是短期(3 d)給予大鼠大劑量(300 mg·kg-1)的梔子苷則會明顯導致大鼠腎臟損傷,這說明梔子苷小劑量長期應用或者短期內大劑量應用均會導致腎損傷。程生輝等[8]經實驗研究發(fā)現(xiàn),用不同劑量的梔子苷喂養(yǎng)大鼠后,大鼠出現(xiàn)了不同程度的腎損傷,并且梔子苷應用的劑量越大,大鼠腎損傷越嚴重,說明梔子苷具有腎毒性。槲皮素具有抗氧化和清除氧自由基、抗炎等作用[10],但能否導致腎損傷尚需要進一步的研究。而對5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮的已有研究中也尚未發(fā)現(xiàn)其導致腎損傷的直接證據(jù)[11]。對于urushio iii,目前暫無關于其毒理作用的臨床或實驗研究,可能是梔子導致腎損傷的又一發(fā)現(xiàn),值得進一步探索。

在基因層面,PTGS2、AKR1B1、MMP2、EGFR、KDR等被認為是梔子導致腎損傷的關鍵靶點。PTGS2基因表達環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2),COX-2是在炎癥細胞因子和應激條件下誘導表達的一種酶,在腎缺血再灌注損傷發(fā)生后表達先增加到最大再減少,在其表達數(shù)小時后可以使腎損傷最嚴重,這說明COX-2對腎損傷的發(fā)展起到了促進作用[12]。譚峰[13]研究發(fā)現(xiàn),通過藥物抑制COX-2可以起到緩解腎損傷的作用,這說明COX-2可能有促進腎損傷進一步發(fā)展的作用。對AKR1B1的研究發(fā)現(xiàn),AKR1B1在腎臟中高表達,將葡萄糖轉化為山梨糖醇,但這個過程不活躍,只有在血糖水平相對較高的情況下才被激活,進而導致山梨糖醇的水平升高,因為山梨糖醇很難擴散到細胞外,導致高滲透壓,雖然AKR1B1可以提供對高滲環(huán)境的保護,但高滲透不斷地累積會破壞腎細胞的滲透調節(jié),最終導致腎臟損傷[14-15]。研究發(fā)現(xiàn),血清MMP2可能是導致糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)患者腎損害的原因之一[16]。研究發(fā)現(xiàn),MMP2在腎組織中有表達,并且在腎癌細胞中的表達相對較高,說明MMP2參與了腎損傷的發(fā)展[17]。此外MMP2有降解細胞外基質的作用,杜文孝等[18]認為MMP2通過降解細胞外基質來參與腎臟缺血再灌注損傷的發(fā)展;而鄭學雙等[19]研究發(fā)現(xiàn)腎臟缺血再灌注可通過激活p38MAPK誘導MMP2蛋白表達來降解細胞外基質,進而促進腎缺血再灌注的發(fā)展。MMP2降解細胞外基質的機制也可以加快腎癌細胞的侵襲轉移[17]。慢性腎病期間脂質運載蛋白2(lipocalin 2,Lcn2)的表達可誘導EGFR定位到腎小管細胞表面,從而使受體持續(xù)激活,導致腎損傷[20]。阻斷EGFR與TGF-α結合來阻止足細胞的損傷可能會延緩DN發(fā)展,這表明EGFR也有促進DN發(fā)展的作用[21]。EGFR可以作為治療腎臟疾病的潛在靶點,EGFR配體EGF主要通過調節(jié)細胞增殖參與急性腎損傷[22]。KDR即為血管內皮生長因子受體-2(vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2),廣泛存在于人的主要內臟系統(tǒng)中,是III型受體酪氨酸激酶基因。周琪等[23]研究發(fā)現(xiàn),雷帕霉素可能通過抑制KDR分泌來改善腎損傷大鼠的情況,說明KDR會使腎損傷進一步加重。

GO結果表明梔子是通過調控蛋白酶結合、磷酸酶結合和對細胞外刺激的反應來導致腎損傷的。蛋白酶中的基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)對腎有損傷作用,MMPs通過降解細胞外基質各種成分、促炎效應、破壞腎小管周圍毛細血管等機制影響腎臟缺血再灌注的進一步發(fā)展。磷酸酶中血清堿性磷酸酶可造成腎損傷,顏春魯?shù)萚24]認為在鎘導致的腎損傷中,鎘能和血清堿性磷酸酶緊密結合,從而使血清堿性磷酸酶含量增加,進而對腎臟造成不同程度的損傷。在對細胞外刺激的反應研究中,黃小抗等[25]研究發(fā)現(xiàn),通過高糖環(huán)境的刺激,小鼠的腎組織會發(fā)生炎癥,并且系膜細胞和基質也會有所增加。

通路富集分析結果顯示,梔子導致腎損傷可能主要通過AGEs-RAGE信號通路、cAMP信號通路、NF-κB信號通路等實現(xiàn)。AGEs-RAGE信號通路對DN發(fā)生發(fā)展有促進作用[26]。汪容等[27]研究發(fā)現(xiàn),DN的發(fā)生是通過AGEs-RAGE介導氧化應激通路活化實現(xiàn)的。黃倩等[28]在實驗中發(fā)現(xiàn),DN小鼠腎皮質中cAMP含量升高,表明cAMP信號通路參與了DN狀態(tài)下腎纖維化。連曉英等[29]研究發(fā)現(xiàn),cAMP可以刺激多囊腎病細胞的增殖以及生長,進一步加重腎損傷。在沒有受到刺激時,NF-κB和IκB結合存在于細胞質中,在受到刺激后 NF-κB 與IκB結合物被降解,NF-κB進入細胞核誘導多種炎癥因子表達。萬笑笑[30]在研究中發(fā)現(xiàn),NF-κB 引起的炎癥反應可以加重腎損傷。NF-κB被激活后誘導表達的炎癥因子也可以促進DN的發(fā)生發(fā)展[31-32]。朱曉婷等[33]研究發(fā)現(xiàn),NF-κB信號通路介導的炎癥反應可促進腎纖維化的發(fā)展。

本研究表明,梔子導致腎損傷的主要成分可能是梔子苷,與調控蛋白酶結合、磷酸酶結合以及對細胞外刺激的反應密切相關,涉及AGEs-RAGE信號通路、cAMP信號通路、NF-κB信號通路。為進一步開發(fā)利用藥食兩用中藥材梔子,尚需相應的體內外實驗來驗證本研究的結果。