黃昱剛 譚伶娟 陳廣 郭菁

環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是以共價鍵形成的一種環(huán)狀結(jié)構的非編碼RNA分子,研究表明circRNA在肺癌中表達異常,并可能通過充當微小RNA(miRNA)的海綿分子而調(diào)節(jié)肺癌細胞生物學行為[1,2]。circ_0001368在腎細胞癌組織和細胞中表達下調(diào),既可阻礙腎癌細胞增殖,又可抑制其侵襲[3]。Circular RNA Interactome證明miR-616和circ_0001368具有結(jié)合位點。研究表明miR-616在非小細胞肺癌組織和細胞中表達增加[4]。但上游非編碼基因如何調(diào)控miR-616表達進而參與肺癌發(fā)生發(fā)展過程并不清晰。故開展本研究,以評價circ_0001368經(jīng)靶向調(diào)節(jié)表達miR-616調(diào)控肺癌細胞的可能性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2019年11月至2020年2月本院收治的47例肺癌患者的肺癌及癌旁組織標本,其中男28例,女19例;年齡53～66歲,平均年齡(58.32±3.26)歲。

1.2 材料與試劑 人肺癌細胞A549購自上海匹拓生物;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、CCK-8試劑(于上海碧云天生物購進);反轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR試劑(于大連寶生物工程購進)購自;LipofectamineTM3000 Transfection Reagent(于美國Invitrogen購進);雙熒光素酶報告基因載體及其活性檢測試劑盒(于美國Promega購進)購自美國;山羊抗兔IgG二抗、兔抗E-cadherin與N-cadherin抗體(于美國CST購進)。

1.3 方法

1.3.1 本研究細胞轉(zhuǎn)染及分組方式:A549細胞用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、雙抗)和37℃、5% CO2培養(yǎng)箱。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進行轉(zhuǎn)染:參照LipofectamineTM3000試劑盒將pcDNA、pcDNA-circ_0001368、anti-miR-NC、anti-miR-616、pcDNA-circ_0001368和miR-NC、pcDNA-circ_0001368和miR-616 mimics轉(zhuǎn)染細胞內(nèi),記為 pcDNA組、pcDNA-circ_0001368組、anti-miR-NC組、anti-miR-616組、pcDNA-circ_0001368+miR-NC組、pcDNA-circ_0001368+miR-616組。

1.3.2 基因的表達水平檢測:qRT-PCR檢測基因的表達水平。將Trizol試劑1 ml加入各組A549細胞、肺癌組織及癌旁組織中,提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,按照95℃ 2 min,95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,40循環(huán)的擴增條件進行PCR。miR-616、circ_0001368二者的相對表達量以2-ΔΔCt法計算。

1.3.3 細胞增殖檢測:細胞增殖以CCK-8實驗檢測。恰當選取各組A549細胞,取96孔板并接種其上,與10 μl CCK-8溶液反應2 h,450 nm波長處的光密度(OD)值以酶標儀讀取。

1.3.4 平板克隆形成實驗:對各組A549細胞進行接種及培養(yǎng),接種14 d后若發(fā)現(xiàn)克隆團,則行甲醇固定,固定時間為20 min。然后再以結(jié)晶紫染色液(1%)染色,染色時間為15 min,染色完畢后進行拍照,并統(tǒng)計細胞克隆形成數(shù)。

1.3.5 劃痕實驗:于6孔板(1×105個/孔)上接種各組A549細胞,接種完畢后將其置于CO2(體積分數(shù)5%)、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng),待細胞長滿后用移液槍(200 μl)槍頭與底板相垂直進行劃痕,劃下的細胞以預冷PBS洗滌,在培養(yǎng)箱內(nèi)進行24 h培養(yǎng),然后將6孔板取出,置于顯微鏡下認真觀察,應用ImageJ軟件對各組細胞遷移距離進行檢測。

1.3.6 細胞侵襲檢測:實驗細胞侵襲行Transwell檢測。將上室以Matrigel基質(zhì)膠稀釋液鋪滿,接種各組A549細胞,下室加600 μl培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)培養(yǎng)48 h,多聚甲醛固定,20 min用結(jié)晶紫行15 min染色,侵襲細胞數(shù)于顯微鏡下觀察。

1.3.7 靶向關系檢測:靶向關系以雙熒光素酶報告實驗評價。預測顯示circ_0001368與miR-616存在結(jié)合位點。將circ_0001368與miR-616結(jié)合序列與突變序列克隆至pmirGLO載體,成野生型(WT)-circ_0001368載體、突變型(MUT)-circ_0001368載體,再將其分別與miR-616 mimics或miR-NC對A549細胞共轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染24 h后,檢測A549細胞的相對熒光素酶活性,檢測試劑盒為雙熒光素酶活性檢測試劑盒。

1.3.8 Western blot蛋白表達量檢測:蛋白表達量以Western blot檢測。各組A549細胞總蛋白以RIPA裂解液提取,以BCA檢測其濃度,分離轉(zhuǎn)膜(SDS-PAGE電泳),封閉2 h(5%脫脂牛奶),加E-cadherin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 000)一抗與內(nèi)參GAPDH抗體(1∶3 000)稀釋液,4℃孵育24 h,加二抗稀釋液(1∶5 000)37℃孵育1 h,滴加ECL后在暗室內(nèi)顯影,以ImageJ軟件評價N-cadherin、E-cadherin條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 circ_0001368、miR-616于肺癌組織中的表達情況 肺癌組織中circ_0001368的表達量較癌旁組織降低(P<0.05),miR-616的表達量較癌旁組織升高(P<0.05)。見表1。

表1 circ_0001368和miR-616在肺癌組織中的表達

2.2 上調(diào)circ_0001368表達對肺癌A549細胞增殖的影響 與pcDNA組比較,pcDNA-circ_0001368組細胞活力降低,細胞克隆形成數(shù)減少,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 上調(diào)circ_0001368表達對肺癌A549細胞增殖的影響達

2.3 上調(diào)circ_0001368表達對肺癌A549細胞遷移、侵襲的影響 與pcDNA組比較,pcDNA-circ_0001368組N-cadherin蛋白水平、侵襲細胞數(shù)以及劃痕愈合率減小(降低),E-cadherin蛋白水平升高(P<0.05)。見表3,圖1。

圖1 上調(diào)circ_0001368表達對肺癌A549細胞遷移、侵襲相關蛋白表達的影響

表3 上調(diào)circ_0001368表達對肺癌A549細胞遷移、侵襲的影響

2.4 circ_0001368靶向調(diào)控miR-616的表達 circ_0001368與miR-616存在結(jié)合位點。相較于miR-NC組,miR-616組降低WT-circ_0001368熒光素酶活性(P<0.05)。circ_0001368可負向調(diào)控miR-616表達(P<0.05)。見圖2,表4、5。

圖2 circ_0001368序列內(nèi)存在核苷酸序列與miR-616互補

表4 雙熒光素酶報告實驗

表5 circ_0001368對miR-616表達的調(diào)控

2.5 抑制miR-616表達對肺癌A549細胞增殖、遷移和侵襲的影響 相較于anti-miR-NC組,anti-miR-616組N-cadherin蛋白水平、劃痕愈合率、細胞活力及侵襲細胞數(shù)目與細胞克隆形成數(shù)目降低(或減少),E-cadherin蛋白水平升高(P<0.05)。見圖3,表6。

圖3 抑制miR-616表達對肺癌A549細胞遷移侵襲相關蛋白表達的影響

表6 抑制miR-616表達對肺癌A549細胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.6 miR-616過表達逆轉(zhuǎn)了上調(diào)circ_0001368表達對肺癌A549細胞增殖、遷移和侵襲的作用 與pcDNA-circ_0001368+miR-NC組比較,pcDNA-circ_0001368+miR-616組細胞活力、N-cadherin蛋白、細胞克隆形成數(shù)目和侵襲細胞數(shù)目升高(或增多),劃痕愈合率和水平升高,E-cadherin蛋白水平降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表7,圖4。

圖4 2組E-cadherin蛋白、N-cadherin蛋白及GAPDH水平比較

表7 2組肺癌A549細胞增殖、遷移和侵襲情況比較

3 討論

circRNA具有組織特異性、高度穩(wěn)定性等特點,其不易被核酸外切酶降解,主要分為外顯子circRNA、內(nèi)含子circRNA、外顯子-內(nèi)含子circRNA,研究表明circRNA在肺癌中表達上調(diào)或下調(diào),還可能作為肺癌治療的潛在靶點[5-8]。

circ_0001368在胃癌組織和細胞中低表達,敲低其表達可促進胃癌細胞的增殖和侵襲[9]。circ_0001368表達異常在垂體腺瘤發(fā)生、進展過程中具有重要作用[10]。本研究肺癌組織中circ_0001368的表達量低于癌旁組織,進一步研究發(fā)現(xiàn)circ_0001368過表達可降低肺癌細胞活力,細胞克隆形成數(shù)減少。N-cadherin與E-cadherin表達失調(diào)可促進肺癌細胞轉(zhuǎn)移,由于N-cadherin與E-cadherin屬于上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標志物,EMT轉(zhuǎn)化發(fā)生時可促進細胞轉(zhuǎn)移[11]。本研究結(jié)果顯示,circ_0001368過表達可抑制肺癌細胞劃痕愈合率和N-cadherin表達,侵襲細胞數(shù)減少,而E-cadherin表達上調(diào),提示circ_0001368過表達可抑制肺癌細胞遷移及侵襲。

miR-616在膠質(zhì)瘤[12]、乳腺癌[13]、前列腺癌[14]、卵巢癌[15]組織和細胞中表達增加。本研究肺癌組織中miR-616的表達量較癌旁組織顯著偏高,上調(diào)miR-616表達可降低circ_0001368過表達對肺癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移的抑制作用。提示circ_0001368可通過靶向調(diào)控miR-616的表達而抑制肺癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移從而發(fā)揮抑癌基因作用。

綜上所述, circ_0001368可通過調(diào)控miR-616抑制肺癌細胞增殖、侵襲、克隆、遷移,circ_0001368/miR-616分子軸在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用,并可能作為肺癌治療的潛在靶點。