田國永 李玲 呂志軍

口腔癌是口腔頜面部最高發(fā)的惡性腫瘤,其中口腔鱗狀細(xì)胞癌占90%以上,是口腔癌最主要的組織病理類型[1]。目前,雖然口腔鱗癌的治療技術(shù)取得了進(jìn)步,但由于診斷的推遲,生存率并不十分理想[2,3]。腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是口腔鱗癌最致命的,研究表明,多數(shù)發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者生存不超過1年[4]。因此,了解口腔鱗癌相關(guān)分子機(jī)制對(duì)開發(fā)特異性診斷方法和個(gè)體化治療策略至關(guān)重要。微小RNA(microRNA,miRNA)是一種小分子單鏈非編碼RNA,可通過與靶mRNA的3’UTR結(jié)合,對(duì)靶mRNA進(jìn)行負(fù)向調(diào)控,誘導(dǎo)其降解并干擾翻譯過程,在生物過程中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用[5,6]。越來越多的證據(jù)表明,miRNA表達(dá)失調(diào)可作為抑癌因子或促癌因子,參與腫瘤的發(fā)生,如miR-204-3p、miR-19a-3p、miR-145-5p、miR-200a-3p、miR-152等[7-11]。miR-150-5p被報(bào)道在口腔鱗癌中表達(dá)失調(diào),具有抑癌作用[12]。但其調(diào)控口腔鱗癌細(xì)胞惡性進(jìn)展的作用及機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 組織樣本收集 收集在我院進(jìn)行手術(shù)治療的170例口腔鱗癌患者的癌組織和癌旁正常組織樣本。術(shù)中切除組織樣本,用流水沖洗后,立即放入液氮,然后置于超低溫冰箱中保存。所有患者術(shù)前均為進(jìn)行放化療、免疫治療等輔助治療,并同意樣本采集。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 (1)人口腔上皮膠質(zhì)細(xì)胞系HOK和口腔鱗癌細(xì)胞株HN6、SCC-25和CAL-27均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。在含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素混合液的DEME培養(yǎng)基中,置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(2)miR-150-5p 模擬物/抑制物(mimics/inhibitors,分別記為miR-150-5p和anti-miR-150-5p)及它們的陰性對(duì)照(分別記為miR-con和anti-miR-con)、靶向IGF2BP2的siRNA序列(記為si-IGF2BP2)及其無意義siRNA(si-con),均由廣州銳博生物有限公司合成提供。分別使用Lipofectamine 3000試劑轉(zhuǎn)染CAL-27細(xì)胞。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR) 組織或細(xì)胞總RNA使用Trizol試劑提取,之后使用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),合成cDNA。然后,以cDNA為模板,使用ABI SYBR Green熒光定量試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中使用引物序列如下:miR-150-5p正向5’-GTATGATCTCCCAACCCTTGTACCAG-3’,反向5’- CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’;IGF2BP2正向5’-GGAACAAGTCAACACAGACACA-3’,反向5’-AACTGATGCCCGCTTAGCTT-3’;U6正向5’-CTCGCTTCGGCAGCACATA -3’,反向5’- CGAATTTGCGTGTCATCCT-3’;GAPDH正向5’- AAGGCTGTGGGCAAGGTCATC-3’,反向5’- GCGTCAAAGGTGGAGGAGTGG -3’。結(jié)果分別以U6和GAPDH為內(nèi)參對(duì)照,采用2-ΔΔct法計(jì)算miR-150-5p和IGF2BP2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 Western blot 使用RIPA裂解液裂解組織或細(xì)胞。蛋白裂解液在95℃沸水中變性后,取適量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳,將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。然后,使膜分別與抗IGF2BP2和抗GAPDH一抗稀釋液,4℃孵育過夜;洗膜,使膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫下孵育2 h。洗膜,將膜放入ECL發(fā)光液中顯色,使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.5 Cell Counting Kit-8(CCK8)實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染后,生長狀態(tài)良好的CAL-27細(xì)胞,經(jīng)常規(guī)消化、計(jì)數(shù),制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液接種至96孔板,每孔約3×103個(gè)細(xì)胞,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別在培養(yǎng)24 h、48 h和72 h,每孔加入10 μl的CCK8試劑,孵育4 h。酶標(biāo)儀下檢測每孔490 nm處的吸光度值。

1.6 EdU實(shí)驗(yàn) 將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞,以每孔4×103細(xì)胞接種于96孔板;培養(yǎng)24 h后,每孔加入100 μl的EdU溶液(50 μmol/L),繼續(xù)培養(yǎng)2 h,棄去培養(yǎng)液,PBS清洗細(xì)胞2次;每孔加入4%多聚甲醛固定液,室溫固定30 min,然后加入甘氨酸脫色;使用Apollo染色液,室溫下,避光染色30 min,然后加入0.5%TritonX-100滲透劑脫色10 min,PBS清洗細(xì)胞;每孔加入100 μl的DAPI反應(yīng)液,室溫孵育30 min,PBS清洗細(xì)胞;顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡。收集對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞,離心后,棄去培養(yǎng)液;使用1×Binding Buffer重懸細(xì)胞,室溫下放置15 min;離心,清洗細(xì)胞1次;4℃下,依次向細(xì)胞中加入5 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI溶液,避光孵育;流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.8 劃痕實(shí)驗(yàn) 首先在6孔板的背面劃線,然后將細(xì)胞懸液平鋪在6孔板內(nèi),過夜培養(yǎng);第2日用滅菌槍頭垂直于背后標(biāo)記線,進(jìn)行劃痕,然后用PBS沖洗細(xì)胞,以除去劃下來的細(xì)胞;加入無血清培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng),并于0 h和24 h進(jìn)行拍照。根據(jù)細(xì)胞遷移距離計(jì)算劃痕愈合率。

1.9 Transwell實(shí)驗(yàn) 用無血清的培養(yǎng)液,將轉(zhuǎn)染后的CAL-27細(xì)胞制成濃度為5×105/ml的細(xì)胞懸液。取200 μl細(xì)胞懸液加入Transwell上室內(nèi),另取600 μl含血清的培養(yǎng)液加入24孔板下室內(nèi),然后將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;取出Transwell上室,用濕棉簽輕輕擦拭掉上層未遷移的細(xì)胞,然后放入甲醇中固定,再用結(jié)晶紫染色;顯微鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)視野區(qū)的遷移細(xì)胞,拍照并計(jì)數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中提前在Transwell中鋪設(shè)Matrigel基質(zhì)膠,其它步驟同細(xì)胞遷移。

1.10 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn) 將含有miR-150-5p結(jié)合位點(diǎn)的IGF2BP2的3’UTR序列構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因載體,然后分別與miR-con、miR-150-5p、anti-miR-con和anti-miR-150-5p共轉(zhuǎn)染CAL-27細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h后,檢測細(xì)胞中熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 miR-150-5p和IGF2BP2在口腔鱗癌組織和細(xì)胞中的表達(dá) qRT-PCR結(jié)果顯示,與癌旁組織比較,口腔鱗癌組織中miR-150-5p相對(duì)表達(dá)水平明顯降低,而IGF2BP2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯升高;與HOK細(xì)胞比較,口腔鱗癌細(xì)胞株HN6、SCC-25和CAL-27中miR-150-5p相對(duì)表達(dá)水平明顯降低,而IGF2BP2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯升高。Western blot結(jié)果顯示,與癌旁組織比較,口腔鱗癌組織中IGF2BP2蛋白表達(dá)水平明顯升高;與HOK細(xì)胞比較,口腔鱗癌細(xì)胞株HN6、SCC-25和CAL-27中IGF2BP2 蛋白表達(dá)明顯升高。K-M生存分析顯示,癌組織中miR-150-5p高表達(dá)的患者的生存率明顯高于miR-150-5p低表達(dá)患者,而IGF2BP2高表達(dá)患者的生存率明顯低于IGF2BP2低表達(dá)患者。Pearson相關(guān)性分析顯示,癌組織中miR-150-5p表達(dá)與IGF2BP2 mRNA表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。此外,starbase數(shù)據(jù)庫分析顯示,miR-150-5p和IGF2BP2的差異表達(dá)均與口腔鱗癌患者預(yù)后相關(guān)。見圖1、2,表1、2。

表2 miR-150-5p和IGF2BP2在各細(xì)胞株中的表達(dá)

圖1 miR-150-5p和IGF2BP2表達(dá)與口腔鱗癌患者生存率關(guān)系以及miR-150-5p和IGF2BP2 mRNA相關(guān)性分析;A miR-150-5p表達(dá)與口腔鱗癌患者生存率關(guān)系;B IGF2BP2表達(dá)與口腔鱗癌患者生存率關(guān)系;C 口腔鱗癌患者癌組織中miR-150-5p和IGF2BP2 mRNA相關(guān)性分析;D starbase數(shù)據(jù)庫分析miR-150-5p表達(dá)與患者生存率關(guān)系;Estarbase數(shù)據(jù)庫分析IGF2BP2表達(dá)與患者生存率關(guān)系

圖2 Western blot檢測各細(xì)胞株中IGF2BP2蛋白表達(dá)

2.2 過表達(dá)miR-150-5p或沉默IGF2BP2抑制口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27增殖,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 CCK8和EdU實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖,結(jié)果顯示,與NC和miR-con組比較,miR-150-5p組細(xì)胞存活率和EdU陽性率均明顯降低;與NC和si-NC組比較,si-IGF2BP2組細(xì)胞存活率和EdU陽性率均明顯降低。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率,結(jié)果顯示,與NC和miR-con組比較,miR-150-5p組細(xì)胞凋亡率明顯升高;與NC和si-NC組比較,si-IGF2BP2組細(xì)胞凋亡率明顯升高。見圖3,表3。

表3 過表達(dá)miR-150-5p和沉默IGF2BP2對(duì)CAL-27細(xì)胞增殖和凋亡的影響

圖3 過表達(dá)miR-150-5p和沉默IGF2BP2對(duì)CAL-27細(xì)胞增殖和凋亡的影響;A Western blot檢測IGF2BP2蛋白表達(dá);B EdU染色檢測細(xì)胞增殖;C 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

2.3 過表達(dá)miR-150-5p或沉默IGF2BP2抑制口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27遷移和侵襲 劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲,結(jié)果顯示,與miR-con組比較,miR-150-5p組細(xì)胞的劃痕愈合率降低,細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與si-con組比較,si-IGF2BP2組細(xì)胞的劃痕愈合率降低,細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4,表4。

表4 過表達(dá)miR-150-5p和沉默IGF2BP2抑制CAL-27細(xì)胞的遷移和侵襲

圖4 細(xì)胞遷移和侵襲檢測;A 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力;B Transwell 法檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力

2.4 miR-150-5p靶向IGF2BP2 分析在線數(shù)據(jù)庫TargetScan,發(fā)現(xiàn)miR-150-5p與IGF2BP2的3’UTR具有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí),miR-150-5p能夠與IGF2BP2的3’UTR靶向結(jié)合。見圖5,表5。

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5 miR-150-5p靶向IGF2BP2;A miR-150-5p與IGF2BP2靶向結(jié)合序列;B Western blot檢測IGF2BP2蛋白表達(dá)

2.5 過表達(dá)IGF2BP2逆轉(zhuǎn)miR-150-5p對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 在過表達(dá)miR-150-5p的CAL-27細(xì)胞中同時(shí)轉(zhuǎn)染IGF2BP2過表達(dá)質(zhì)粒,進(jìn)行功能拯救實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,與miR-150-5p+pcDNA組比較,miR-150-5p+pcDNA-IGF2BP2組細(xì)胞中IGF2BP2蛋白表達(dá)升高,細(xì)胞增殖活性和EdU陽性率升高,凋亡率降低,劃痕愈合率升高,遷移和侵襲數(shù)目增多,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖6,表6。

表6 同時(shí)過表達(dá)miR-150-5p和IGF2BP2對(duì)CAL-27細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

圖6 同時(shí)過表達(dá)miR-150-5p和IGF2BP2對(duì)CAL-27細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響;A EdU染色檢測細(xì)胞增殖;B Western blot檢測IGF2BP2蛋白表達(dá);C 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡;D 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移;E Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲

3 討論

miRNA作為一種短鏈非編碼RNA,廣泛參與生命活動(dòng)的調(diào)節(jié),尤其是癌癥[13]。目前的研究顯示,miR-150-5p在多種癌癥中表達(dá)失調(diào),調(diào)控癌癥進(jìn)展,如Chen等[14]報(bào)道,miR-150-5p在體內(nèi)外均能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和血管生成;Dai等[15]發(fā)現(xiàn),miR-150-5p過表達(dá)可有效抑制非細(xì)胞細(xì)胞肺癌球形腫瘤的形成和異種移植瘤的復(fù)發(fā);Yang等[16]研究表明,miR-150-5p可抑制黑色素瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移和糖酵解,調(diào)控癌癥發(fā)生。本研究結(jié)果證實(shí),miR-150-5p在口腔鱗癌組織和細(xì)胞中表達(dá)降低,與患者較差的總生存率有關(guān);此外,體外過表達(dá)miR-150-5p明顯抑制口腔鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這一結(jié)果與Li等[12]研究結(jié)果一致。說明miR-150-5p在口腔鱗癌中發(fā)揮抑癌作用。

目前,miRNA與靶mRNA的3’UTR互補(bǔ)結(jié)合,導(dǎo)致mRNA降解或翻譯受阻,是其調(diào)控癌細(xì)胞生物學(xué)行為的經(jīng)典方式。因此,本研究進(jìn)一步利用在線數(shù)據(jù)庫TargetScan分析miR-150-5p的靶基因,發(fā)現(xiàn)miR-150-5p與胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白2(insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 2,IGF2BP2)的3’UTR區(qū)具有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn),雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-150-5p能夠與IGF2BP2靶向結(jié)合。IGF2BP2是一種腫瘤相關(guān)抗原蛋白,其表達(dá)在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn),與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[17,18]。如IGF2BP2在肝細(xì)胞癌中高表達(dá),被證實(shí)可促進(jìn)癌細(xì)胞的體內(nèi)外增殖[19];IGF2BP2在胰腺癌中上調(diào)預(yù)示患者總生存期縮短,其過表達(dá)可通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞生長[20]?？谇击[癌相關(guān)研究表明,IGF2BP2高表達(dá)與口腔鱗癌患者較差的總生存率相關(guān),在IGF2BP2高表達(dá)的組織樣本中,細(xì)胞凋亡、腫瘤和免疫相關(guān)通路顯著富集,且其蛋白表達(dá)水平與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和癌癥分期顯著相關(guān)[21-23];提示IGF2BP2可能是口腔鱗癌的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示,在口腔鱗癌細(xì)胞中敲低IGF2BP2有效抑制了癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,使細(xì)胞凋亡增加;其作用與過表達(dá)miR-150-5p一致。此外,功能拯救實(shí)驗(yàn)證實(shí),過表達(dá)IGF2BP2能夠減弱miR-150-5p對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞惡性行為的抑制作用,提示miR-150-5p可通過靶向抑制IGF2BP2發(fā)揮其抑癌作用。

綜上所述,本研究證實(shí)口腔鱗癌組織和細(xì)胞中miR-150-5p高表達(dá),IGF2BP2低表達(dá);過表達(dá)miR-150-5p可能通過靶向抑制IGF2BP2基因表達(dá),抑制口腔鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果揭示了miR-150-5p/IGF2BP2軸在口腔鱗癌中的調(diào)控機(jī)制,為其作為口腔鱗癌的治療靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)參考。