宋希猛，張衛(wèi)紅，袁士龍

濟(jì)寧市兗州區(qū)人民醫(yī)院脊柱外科，濟(jì)寧 272100

頸椎后縱韌帶骨化癥（OPLL）是一種發(fā)生于頸椎后縱韌帶的異位骨化疾病，多見于亞洲人群［1］。目前手術(shù)是治療OPLL的首選方式，但其風(fēng)險(xiǎn)高、難度大，面臨著較高的并發(fā)癥（如脊髓損傷）風(fēng)險(xiǎn)［2-3］。因此，研究OPLL 發(fā)生機(jī)制及新型治療方式備受關(guān)注。微RNA（miRNA）是成骨細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要的細(xì)胞間信號傳導(dǎo)介體，本研究組前期采用高通量基因芯片技術(shù)檢測OPLL 患者和非OPLL 患者miRNA 的表達(dá)差異，對其中下調(diào)最明顯的50 個(gè)miRNA 逐個(gè)采用miRanda 軟件預(yù)測分析，其中miR-23a 在OPLL 中下調(diào)較為明顯，且有研究［4］表明，抑制其表達(dá)可通過促進(jìn)軟骨形成和血管生成來促進(jìn)骨愈合，提示其具有調(diào)控成骨分化的作用?？p隙連接蛋白43（Cx43）是Connexins蛋白家族成員，是哺乳動物機(jī)體中分布最廣、數(shù)量最豐富的連接蛋白，在細(xì)胞物質(zhì)交換、電信號傳達(dá)過程中具有重要作用［5］，體外實(shí)驗(yàn)證明，其高表達(dá)于OPLL 患者后縱韌帶組織，且通過介導(dǎo)多條信號通路影響成骨分化基因表達(dá)［6-7］。此外，有學(xué)者［8］認(rèn)為，Cx43可能存在與miR-23a的結(jié)合位點(diǎn)，其作為miR-23a 的靶基因發(fā)揮作用。大多數(shù)細(xì)胞中均存在絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），其被激活后可促進(jìn)相關(guān)成骨細(xì)胞特異性蛋白表達(dá)，從而鞏固骨分化信號［9-10］。本研究通過構(gòu)建過表達(dá)及低表達(dá)miR-23a 的頸椎后縱韌帶細(xì)胞，分析其對Cx43 的調(diào)控作用及頸椎后縱韌帶細(xì)胞骨向分化的影響，并探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

標(biāo)本來源于本院收治的50 例間斷型頸椎OPLL患者（OPLL 組）、50 例頸椎外傷非OPLL 患者（對照A 組）和50 例頸椎病非OPLL 患者（對照B 組）。所有患者經(jīng)頸椎X 線、CT 及MRI 檢查確診，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為18.5 ～ 24.9 kg/m2，心、肝、腎等主要器官功能正常，無糖尿病、高血壓或高脂血癥等慢性基礎(chǔ)性疾病。OPLL組中男30例、女20例，年齡為32 ～65（47.78±5.25）歲；對照A 組男28 例、女22 例，年齡為36 ～ 67（48.12±6.03）歲；對照B組男32例、女28例，年齡為35 ～ 66（48.52±6.14）歲。均采取頸椎前路減壓（經(jīng)椎間隙或椎體次全切除）植骨融合內(nèi)固定術(shù)治療，將術(shù)中切除的后縱韌帶組織留作標(biāo)本（OPLL組留取間斷非完全骨化的后縱韌帶組織）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批備案，受試者均對研究內(nèi)容知情且簽署同意書。

1.2 試劑和儀器

含綠色熒光蛋白的過表達(dá)質(zhì)粒（miR-23a agomir）、低表達(dá)質(zhì)粒（miR-23a antagomir）、陰性對照質(zhì)粒（agomir NC）購自武漢淼靈生物科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測試劑盒、熒光素酶活性試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒購自美國Sigma 公司；lipofectamineTM2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國英杰生命技術(shù)有限公司；Cx43 一抗、p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）一抗、磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）一抗、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）一抗、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）一抗購自美國Abcam 公司。Synergy-HD顯微鏡（Toshiba，日本）；Synergy H4 全功能酶標(biāo)儀（Bio Tek 公司，美國）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)［11］

酶消化法分離頸椎后縱韌帶細(xì)胞。分別取OPLL 組、對照A 組、對照B 組約1 cm×1 cm 后縱韌帶組織，無菌條件下沖洗干凈深層組織血液及軟組織碎屑，去除脂肪，將剩余組織剪碎，轉(zhuǎn)移至5 mL滅菌離心管中，加入胰酶1.5 mL及膠原酶3 mL，充分混勻，37℃消化2 h，至管中無明顯塊狀組織，低速離心（離心速度3 000 r/min，離心半徑10 cm）去除沉淀，高速離心（離心速度12 000 r/min，離心半徑8 cm）棄上清，DMEM 培養(yǎng)液將沉淀重懸，標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)，細(xì)胞融合度約80%時(shí)傳代培養(yǎng)。倒置光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.2 培養(yǎng)細(xì)胞的miR-23a、Cx43表達(dá)［12-13］

取對數(shù)期的培養(yǎng)細(xì)胞，PBS 溶液沖洗，Trizol 法提取總RNA，鑒定濃度、純度后反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，定量后按照試劑盒說明書要求設(shè)定反應(yīng)條件：93℃預(yù)變性6 min，95℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸25 s，重復(fù)40 個(gè)循環(huán)。miR-23a 上游引物：5’-G ACGTGCTCGGTGCACGCGTCCAC-3’；miR-23a下游引物：5’-TGCACGACGCTGCCACGCGCATGT-3’。Cx43上游引物：5’-GTGCACGCCACGTGCACGCACGCT-3’；Cx43 下游引物：5’-GTGACGTGCGTGCACGCTGCA AGC-3’。GAPDH上游引物：5’-GTGCACGCATGCAG TGCACCACAC-3’；GAPDH 下游引物：5’-CGCTTA CGCACGTGCTTAATGCAC-3’。以2-△△CT為目的基因相對表達(dá)強(qiáng)度，重復(fù)3 次取均值。

采用Western blotting 檢測Cx43 蛋白表達(dá)。預(yù)冷PBS 洗滌后細(xì)胞裂解液冰上裂解，提取、定量蛋白。取40 μg待測樣本，與等體積上樣緩沖液混合，恒壓下凝膠電泳30 min，濕膜法轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉室溫?fù)u床孵育2 h，加入Cx43 一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，TBTS 漂洗3 次，15 min/次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶8 000）室溫孵育1 h，TBTS 漂洗3 次，15 min/次。暗室中曝光顯影，去除膜上發(fā)光液，Gene Gnome 凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image J軟件分析，蛋白表達(dá)量以Cx43 蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值表示。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染［14］

取OPLL 組培養(yǎng)對數(shù)期細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化，接種于24 孔板，待細(xì)胞再次貼壁至80%時(shí)，更換無雙抗的完全培養(yǎng)基。根據(jù)lipofectamineTM2000 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染說明書分別轉(zhuǎn)染miR-23a agomir質(zhì)粒（miR-23a 過表達(dá)組）、miR-23a antagomir 質(zhì)粒（miR-23a 低表達(dá)組）、agomir NC 質(zhì)粒（轉(zhuǎn)染對照組），未經(jīng)處理的后縱韌帶細(xì)胞為空白組，每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔。37℃培養(yǎng)6 h，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率（%）=表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)量×100%。

1.3.4 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)［15］

采用生物信息學(xué)軟件TargetScan、miRwalk 初步預(yù)測，構(gòu)建Cx43 野生質(zhì)粒（Cx43-WT）；再使用基因位點(diǎn)圖片技術(shù)構(gòu)建Cx43 突變質(zhì)粒（Cx43-MT）。取OPLL 組培養(yǎng)對數(shù)期細(xì)胞，接種于96 孔板，融合度至75%時(shí)開始轉(zhuǎn)染，按照lipofectamineTM3000 說明書，將Cx43-WT、MT 質(zhì)粒與內(nèi)參海腎熒光素酶質(zhì)粒pRLTK 進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，分為Cx43-WT+miR 內(nèi)參組、Cx43-WT+hsa-miR-23a 組、Cx43-MT+miR 內(nèi)參組、Cx43-MT+hsa-miR-23a 組，孵育48 h，經(jīng)熒光素酶活性試劑盒檢測熒光素酶活性，相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.3.5 堿性磷酸酶（ALP）染色［16］

取miR-23a 過表達(dá)組、miR-23a 低表達(dá)組、轉(zhuǎn)染對照組和空白組細(xì)胞，每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，加入礦化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)，顯微鏡下觀察到黃褐色的礦化結(jié)節(jié)后繼續(xù)培養(yǎng)21 d。PBS 沖洗，每孔加入50 μL 的Triton X-100，4℃孵育過夜。每孔加入100 μL ALP底物，37℃孵育1 h，每孔加入50 μL NaOH（0.2 mol/L）終止反應(yīng)，采用酶標(biāo)儀測定各組410 nm處光密度值。

1.3.6 Western blotting 檢測

取miR-23a 過表達(dá)組、miR-23a 低表達(dá)組、轉(zhuǎn)染對照組和空白組細(xì)胞，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，裂解、定量蛋白、電泳等步驟同1.3.2中Cx43蛋白表達(dá)檢測。加入p38 MAPK 一抗（1∶500）、p-p38 MAPK 一抗（1∶500）、ERK1/2一抗（1∶1 000）、p-ERK1/2一抗（1∶1 000），辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶8 000），分析蛋白表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，用LSD-t檢驗(yàn)行兩兩比較；以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)

培養(yǎng)14 d 后，有細(xì)胞從后縱韌帶組織塊周圍爬出，瘦小、細(xì)長，多為菱形（圖1a）；培養(yǎng)至21 d，細(xì)胞爬出量逐漸增加，排列較為整齊，多為多角形與梭形；折光狀態(tài)好（圖1b）；培養(yǎng)25 d，隨著細(xì)胞增加，逐漸鋪滿瓶底，細(xì)胞胞體增大，放射狀生長（圖1c）。OPLL 組、對照A 組、對照B 組細(xì)胞形態(tài)無明顯區(qū)別。

圖1 頸椎后縱韌帶細(xì)胞（×100）Fig. 1 Cervical posterior longitudinal ligament cells（×100）

2.2 miR-23a、Cx43 mRNA 及Cx43 蛋白表達(dá)情況

與對照A、B 組比較，OPLL 組miR-23a 表達(dá)降低，Cx43 mRNA 及蛋白表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，表1，圖2）；對照A、B組間miR-23a、Cx43 mRNA及Cx43蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1，圖2）。

表1 miR-23a、Cx43 mRNA 及Cx43蛋白表達(dá)Tab. 1 Expressions of miR-23a，Cx43 mRNA and Cx43 protein n=50，±s

表1 miR-23a、Cx43 mRNA 及Cx43蛋白表達(dá)Tab. 1 Expressions of miR-23a，Cx43 mRNA and Cx43 protein n=50，±s

注：*與對照A、B 組比較，P ＜ 0.05。Note：* P ＜ 0.05，compared with control A，B group.

組別GroupmiR-23aCx43 mRNACx43 蛋白Cx43 protein OPLL0.30±0.04*1.41±0.15*1.26±0.13*對照A Control A 0.62±0.070.57±0.060.63±0.07對照B Control B 0.61±0.090.58±0.070.65±0.08

表 2 各組p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2表達(dá)Tab. 2 Expressions of p-p38 MAPK/p38 MAPK and p-ERK1/2/ERK1/2 in each group n=50，±s

表 2 各組p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2表達(dá)Tab. 2 Expressions of p-p38 MAPK/p38 MAPK and p-ERK1/2/ERK1/2 in each group n=50，±s

注：*與空白組比較，P ＜ 0.05；△與轉(zhuǎn)染對照組比較，P ＜ 0.05。Note：* P ＜ 0.05，compared with blank group；△P ＜ 0.05，compared with transfection control group.

組別Groupp-p38 MAPK/p38 MAPK p-ERK1/2/ERK1/2空白Blank 0.41±0.040.38±0.05轉(zhuǎn)染對照Transfection control 0.40±0.050.36±0.04 miR-23a 過表達(dá)miR-23a overexpression 0.16±0.02*△0.11±0.02*△miR-23a 低表達(dá)miR-23a low expression 0.91±0.09*△0.98±0.07*△

圖2 Cx43蛋白表達(dá)Fig. 2 Expression of Cx43 protein

2.3 轉(zhuǎn)染效率

熒光顯微鏡下可明顯觀察到綠色熒光細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率為86%（圖3）。

圖3 miR-23a轉(zhuǎn)染（×100）Fig. 3 miR-23a transfection（×100）

2.4 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

Cx43-WT+miR 內(nèi)參組、Cx43-WT+hsa-miR-23a組、Cx43-MT+miR 內(nèi)參組、Cx43-MT+hsa-miR-23a 組相對熒光素酶活性分別為1.06±0.09、0.91±0.08、1.01±0.10、1.03±0.11，Cx43-WT+hsa-miR-23a 組相對熒光素酶活性低于Cx43-WT+miR內(nèi)參組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，圖4），提示miR-23a 可有效抑制野生型質(zhì)粒熒光素酶活性。Cx43-MT+miR 內(nèi)參組與Cx43-MT+hsa-miR-23a 組相對熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05，圖4），提示miRNA 無法抑制突變型質(zhì)粒熒光素酶活性。

圖4 熒光素酶活性Fig. 4 Luciferase activity

圖5 ALP 染色Fig.5 ALP staining

2.5 ALP染色

空白組、轉(zhuǎn)染對照組、miR-23a 過表達(dá)組、miR-23a 低表達(dá)組礦化面積百分比分別為1.29±0.17、1.31±0.28、0.93±0.08、2.15±0.32，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；與空白組、轉(zhuǎn)染對照組比較，miR-23a 過表達(dá)組礦化面積百分比降低，miR-23a 低表達(dá)組A 礦化面積百分比升高；空白組、轉(zhuǎn)染對照組礦化面積百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05，圖5）。

2.6 p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2表達(dá)

與空白組、轉(zhuǎn)染對照組比較，miR-23a 過表達(dá)組p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 表達(dá)降低，miR-23a 低表達(dá)組p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，表2，圖6）；空白組、轉(zhuǎn)染對照組比較，p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05，表2，圖6）。

圖6 各組p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2表達(dá)Fig. 6 Expressions of p-p38 MAPK/p38 MAPK and p-ERK1/2/ERK1/2 in each group

3 討 論

目前OPLL 病因及發(fā)生機(jī)制尚停留在推測及學(xué)說階段，主要包括椎間盤變性學(xué)說、機(jī)械應(yīng)力損傷學(xué)說、骨質(zhì)肥厚相關(guān)學(xué)說、糖代謝紊亂學(xué)說、遺傳學(xué)說、鈣代謝異常學(xué)說［17-18］。盡管研究已經(jīng)較為深入，但因多種細(xì)胞生命活動均參與OPLL發(fā)生過程，其發(fā)生機(jī)理尚無法通過某單方面因素被充分解釋［19］。因此，研究一些介導(dǎo)多個(gè)信號通路、顯著影響疾病進(jìn)程的關(guān)鍵性因素，對明確其發(fā)生機(jī)制、尋找新的靶向藥物意義重大。

既往動物研究發(fā)現(xiàn)［20］，敲除小鼠Cx43 基因，其發(fā)育階段膜內(nèi)化骨與軟骨內(nèi)化骨被明顯阻滯。亦有研究［21-22］證實(shí)，成骨細(xì)胞因缺乏Cx43 而礦化功能減弱，并對合成代謝信號的反應(yīng)造成影響。本研究結(jié)果顯示，與對照A、B 組比較，OPLL 組Cx43 表達(dá)升高。以上結(jié)論提示，在頸椎后縱韌帶細(xì)胞骨化過程中，Cx43 可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用，但關(guān)于其上游調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。miRNA 在控制骨骼分化中起著至關(guān)重要的作用，其中miR-23a 備受關(guān)注，其主要通過靶向（直接和間接）轉(zhuǎn)錄因子參與成骨細(xì)胞形成［23-24］。已有研究［25］表明，miR-23a 可通過介導(dǎo)Cx43 抑制雌激素缺乏引起的心臟間隙連接損傷，但在OPLL 中是否存在調(diào)控關(guān)系仍有待研究。本研究比較了對照A 組、對照B 組、OPLL 組后縱韌帶組織中miR-23a 表達(dá)情況，并通過轉(zhuǎn)染觀察Cx43 表達(dá)變化及頸椎后縱韌帶細(xì)胞骨向分化情況，結(jié)果顯示，與對照A、B 組比較，OPLL 組miR-23a 表達(dá)降低，且過表達(dá)miR-23a 后Cx43 mRNA 表達(dá)降低，低表達(dá)miR-23a 后Cx43 mRNA 表達(dá)升高，且經(jīng)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-23a 與Cx43 存在靶向關(guān)系；與空白組、轉(zhuǎn)染對照組比較，miR-23a過表達(dá)組礦化面積百分比降低，miR-23a 低表達(dá)組礦化面積百分比升高，提示過表達(dá)miR-23a 可抑制頸椎后縱韌帶細(xì)胞骨向分化，反之則具有促進(jìn)作用，且可能通過靶向調(diào)控Cx43 參與OPLL發(fā)生。

MAPK 通路包括p38 MAPK、ERK 介導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)，是調(diào)控細(xì)胞生長因子、促有絲分裂物質(zhì)分泌的重要蛋白激酶，可在多種刺激因子作用下被激活［26-28］。Liu 等［29］采用細(xì)胞松弛素D 干預(yù)小鼠MC3T3-E1 成骨細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，其改善細(xì)胞成骨性的機(jī)制之一是促進(jìn)p38 MAPK 信號通路。Yang 等［30］認(rèn)為，葛根素可通過介導(dǎo)ERK1/2 和p38-MAPK 信號通路刺激成骨分化和骨形成。以上結(jié)果均提示MAPK 信號通路在骨向分化中的重要作用。此外，Chen 等［31］發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)外骨化后縱韌帶組織中ERK1/2，p38 MAPK 途徑均被激活，且這些信號的激活取決于Cx43，降低Cx43 表達(dá)將導(dǎo)致機(jī)械作用減弱和信號傳導(dǎo)減少。由此可見，受機(jī)械應(yīng)力上調(diào)的Cx43 似乎部分通過激活ERK1/2 和p38 MAPK 信號來促進(jìn)韌帶成纖維細(xì)胞的成骨分化。本研究結(jié)果顯示，與空白組、轉(zhuǎn)染對照組比較，miR-23a 過表達(dá)組p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 表達(dá)均降低，miR-23a 低表達(dá)組p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 表達(dá)均升高，提示miR-23a可能通過調(diào)控Cx43 進(jìn)而調(diào)控MAPK 通路影響頸椎后縱韌帶細(xì)胞骨向分化。

綜上所述，OPLL 病理?xiàng)l件下，頸椎后縱韌帶細(xì)胞中miR-23a 異常低表達(dá)，通過靶向上調(diào)Cx43 激活MAPK 信號通路，促進(jìn)成骨分化，參與OPLL 發(fā)生及發(fā)展。