張鶯芳，葉民，尚羽，吳明鳳

缺血性卒中可造成患者殘疾、死亡風(fēng)險和醫(yī)療費(fèi)用增加[1]。MMP是一類具有重塑細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）功能的蛋白酶家族，受MMP組織抑制劑（tissue inhibitors of matrix metalloproteinase，TIMP）的調(diào)控[2]。MMP和TIMP之間的平衡對ECM的穩(wěn)定性和正常功能起著關(guān)鍵作用。這種平衡的破壞可能導(dǎo)致基質(zhì)纖維化、基質(zhì)蛋白的過度積累或ECM退化[3-4]。目前，關(guān)于MMP與缺血性卒中關(guān)系的研究較多，有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)功能預(yù)后更差的缺血性卒中患者入院時MMP-2、MMP-9水平更高[5-6]。然而，關(guān)于TIMP在缺血性疾病方面的研究較少。TIMP家族由4個成員組成，其中TIMP-3是唯一一種對ECM中的蛋白多糖具有高親和力的TIMP，并具有最廣泛的底物，包括所有MMP和多種去整合素金屬蛋白酶[7-9]。本研究旨在分析重度腦梗死患者血清TIMP水平變化，并確定其作為預(yù)測患者早期死亡生物標(biāo)志物的潛力。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究為2019年2月—2022年1月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬明基醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科開展的一項前瞻性、觀察性研究。共納入了68例嚴(yán)重惡性大腦中動脈梗死（malignant middle cerebral artery infarction，MMCAI）患者。該研究通過明基醫(yī)院機(jī)構(gòu)審查委員會批準(zhǔn)（L2019-0288），每位患者的親屬均簽署了書面知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：①發(fā)病至入院時間＜24 h；②有腦梗死相關(guān)癥狀，符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南》和《各類腦血管疾病診斷要點(diǎn)》中的定義[10-11]；③頭顱CT和CTA證實梗死最長徑＞5 cm，或梗死體積＞2/3大腦中動脈供血區(qū)；④入院48 h內(nèi)臨床惡化（NIHSS評分的意識水平維度評分下降≥1分）、中線移位≥5 mm或腦疝；⑤神經(jīng)功能損傷體征持續(xù)存在。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＜18歲；②活動性炎癥、惡性疾病或妊娠；③頭顱CT提示大腦前動脈或大腦后動脈供血范圍內(nèi)同時發(fā)生腦梗死；④既往有腦出血、腦外傷改變或同側(cè)半球占位性病變；⑤參加其他研究和接受實驗性藥物治療的患者。

1.2 資料收集 患者入院后收集一般資料，包括年齡、性別、既往史、急性生理學(xué)與慢性健康狀況評分系統(tǒng)Ⅱ（acute physiology and chronic health evaluation scoring systemⅡ，APACHEⅡ）、GCS評分、體溫、血壓、實驗室檢查結(jié)果、腦梗死體積、中線偏移、阿替普酶靜脈溶栓、去骨瓣減壓術(shù)以及出血性轉(zhuǎn)化等指標(biāo)。

本研究中既往史包括糖尿病、高血壓、慢性腎功能衰竭、心力衰竭、接受溶栓治療或去骨瓣減壓術(shù)治療，實驗室檢查包括血清肌酐、血清鈉、膽紅素、血糖、乳酸、INR、纖維蛋白原、活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）、白細(xì)胞計數(shù)、血小板計數(shù)、血紅蛋白、動脈血氧分壓（arterial partial pressure of oxygen，PaO2）、吸入氧濃度（fraction of inspiration O2，F(xiàn)IO2）、PaO2/FIO2比值。出血轉(zhuǎn)化定義為血管再通后24 h內(nèi)復(fù)查頭顱影像學(xué)發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)出血。入院后進(jìn)行頭顱MRI DWI序列檢查，根據(jù)Pullicino公式（梗死區(qū)的最長徑×寬徑×梗死層面數(shù)×層厚×0.5）計算腦梗死體積[12]。根據(jù)入院時頭顱CT圖像，以雞冠至大腦鐮-小腦幕交匯處連線作為中線，以最遠(yuǎn)偏移處作為測量點(diǎn)，使用Ruler工具測量中線偏移距離。

所有患者入院后第1天、第4天、第8天采集靜脈血，離心后吸取上清液，－80 ℃保存直至測定。根據(jù)BioRad在Bio-Plex Pro人TIMP檢測試劑盒中提供的說明書，使用Bio-Plex Data Pro軟件確定和量化血清TIMP水平（TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4）。構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品和對照品，并制備標(biāo)準(zhǔn)稀釋系列。使用的樣品是從儲存的血液樣品中獲得的血清等分試樣。將捕獲抗體與珠共價耦聯(lián)，形成的復(fù)合物與含有目標(biāo)生物標(biāo)記物的樣品反應(yīng)。在洗滌去除未結(jié)合的蛋白后，加入生物素化檢測抗體以形成夾心復(fù)合物。添加鏈霉親和素-藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）綴合物形成最終檢測復(fù)合物。PE用作熒光指示劑。來自反應(yīng)的數(shù)據(jù)以熒光強(qiáng)度（money flow index，M FI）以及與每個樣品結(jié)合的分析物濃度（pg/mL）表示，該濃度與熒光指示劑信號的MFI成比例。

1.3 研究終點(diǎn)及分組 以30 d全因死亡為研究終點(diǎn)。比較存活組和死亡組臨床指標(biāo)的差異，分析患者30 d死亡的獨(dú)立危險因素。另外，根據(jù)死亡時間點(diǎn)對樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分層分析：對于入院第1天、第2～4天和第5～8天死亡的患者，取最后一次血清TIMP水平數(shù)據(jù)分別與存活組第1天、第4天和第8天的數(shù)據(jù)做比較。

1.4 統(tǒng)計方法 使用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的連續(xù)變量用表示，組間比較采用t檢驗；非正態(tài)分布的連續(xù)變量用M（P25～P75）表示，通過Wilcoxon-Mann-Whitney檢驗進(jìn)行比較。分類變量用例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用卡方檢驗。使用ROC曲線評估MMCAI患者第1天、第4天和第8天的血清TIMP-3水平對30 d死亡的預(yù)測能力。以單因素分析中P＜0.1的指標(biāo)為自變量，以30 d死亡為因變量，進(jìn)行多元logistic回歸分析，評估MMCAI患者死亡的獨(dú)立危險因素。繪制Kaplan-Meier生存曲線，并進(jìn)行Log rank檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 本研究納入68例符合入組標(biāo)準(zhǔn)的MMCAI患者，30 d內(nèi)全因死亡34例，分別有16例、6例、12例在入院第2～4天、第5～8天和第9～30天死亡。死亡組患者的平均年齡為（62.09±7.72）歲，21例為男性，29例伴有其他并發(fā)癥，16例接受溶栓術(shù)或去骨瓣減壓術(shù)治療，入院時APACHEⅡ評分平均為（22.85±5.93）分，GCS評分平均為（5.82±1.64）分。死亡組GCS評分和血小板計數(shù)低于存活組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其他基線資料與存活組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

2.2 血清TIMP水平分析 死亡組患者在入院第1天、第4天、第8天時的血清TIMP-3水平均高于存活組，且死亡組患者入院第1天血清TIMP-1水平高于存活組，兩組各時間點(diǎn)血清TIMP-2和TIMP-4水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

表2 患者入院第1天、第4天、第8天時血清TIMP水平變化

2.3 ROC曲線分析 ROC曲線分析結(jié)果顯示，患者入院第1天、第4天、第8天血清TIMP-3水平（截斷值分別為179.33 ng/mL、333.41 ng/mL、266.56 ng/mL）預(yù)測30 d死亡率的AUC分別為0.751（95%CI0.636～0.866，P＜0.001）、0.748（95%CI0.606～0.889，P＜0.001）和0.840（95%CI0.726～0.955，P＜0.001）（圖1，表3）。

圖1 入院第1天、第4天、第8天血清TIMP-3水平預(yù)測惡性大腦中動脈梗死患者30 d死亡的ROC曲線分析結(jié)果

表3 入院第1天、第4天、第8天血清TIMP-3水平預(yù)測MMCAI患者30 d死亡的ROC曲線分析結(jié)果

2.4 多元logistic回歸分析 校正血小板計數(shù)、GCS評分和乳酸水平后，入院第1天血清TIMP-3水平升高仍是影響MMCAI患者30 d死亡的獨(dú)立危險因素（表4）。生存分析顯示，入院第1天血清TIMP-3水平＞257.93 ng/mL的患者30 d死亡率更高（圖2）。

圖2 根據(jù)入院第1天血清TIMP-3水平分層分析患者累積死亡風(fēng)險

表4 MMCAI患者30 d死亡影響因素的多元logistic回歸分析

3 討論

缺血性卒中是我國主要的心腦血管疾病死亡原因之一，只有12%～39%的幸存者可實現(xiàn)長期功能獨(dú)立，其較高的發(fā)病率增加了人群疾病負(fù)擔(dān)[1]。早期預(yù)防和治療是改善缺血性卒中患者臨床結(jié)局和減少患者家庭及社會醫(yī)療負(fù)擔(dān)的必要條件。卒中的首要病理變化為腦血管病，表現(xiàn)為血管受損、ECM降解和MMP破壞胞間連接，進(jìn)而破壞血腦屏障。MMP的釋放及其對卒中的致病作用是由TIMP調(diào)節(jié)的[3，13-15]。其中TIMP-3被證實與動脈粥樣硬化、腦動脈瘤、高血壓、缺血后神經(jīng)元損傷等密切相關(guān)[13-15]，但其與MMCAI的預(yù)后關(guān)系尚未得到明確證實。本研究通過對MMCAI患者血清TIMP-3水平進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，首次證實了在MMCAI發(fā)病后第1周，MMCAI死亡患者血清TIMP-3水平普遍高于存活患者，尤其是入院第1天的血清TIMP-3水平可良好地預(yù)測患者30 d內(nèi)死亡風(fēng)險，有望成為短期預(yù)后的生物標(biāo)志物。

TIMP在調(diào)節(jié)血管ECM重組中發(fā)揮重要的作用[3-4]。ECM結(jié)構(gòu)依靠TIMP和MMP的動態(tài)平衡來維持，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和生長因子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄或在轉(zhuǎn)錄水平干擾RNA來重組ECM[16]。分泌型MMP和TIMP之間的動態(tài)平衡受到低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-1（lipoprotein receptor-associated protein-1，LRP-1）分子親和力的調(diào)節(jié)[17]。因此，LRP-1對MMP和TIMP的親和力是ECM動態(tài)結(jié)構(gòu)的重要調(diào)節(jié)因子。有研究證實，在所有TIMP蛋白中，TIMP-3對LRP-1的親和力最強(qiáng)[17]。TIMP-3通過增強(qiáng)靶MMP與LRP-1的結(jié)合來促進(jìn)LRP-1介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，表明LRP-1-TIMP/MMP通路可能參與了TIMP-3觸發(fā)的腦組織損傷機(jī)制[18]。此外，腦缺血會導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，包括小膠質(zhì)細(xì)胞激活、膠質(zhì)增生和細(xì)胞死亡?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞和反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，如TNF-α和IL-6，這些因子與腦白質(zhì)損傷有關(guān)[19]。同時炎性細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的外滲由MMP的細(xì)胞外活性誘導(dǎo)，而MMP的細(xì)胞外活動部分受內(nèi)源性TIMP-3調(diào)節(jié)。

TIMP-3是MMP-9最有效的內(nèi)源性抑制劑之一，參與動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展[7]。流行病學(xué)證據(jù)表明，TIMP-3升高與主要心血管危險因素以及更高的死亡和心血管事件風(fēng)險相關(guān)[8]。TIMP-3被認(rèn)為是冠心病和心肌梗死的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物[7]。據(jù)報道，血清TIMP-3水平升高與缺血性卒中的發(fā)病率呈正相關(guān)[9]。既往也有研究表明，缺血性卒中第1天較高的血清TIMP-1水平與較差的神經(jīng)功能預(yù)后和較低的生存率有關(guān)[20]。在本研究中，重度MMCAI患者30 d死亡組入院第1天時血清TIMP-1和TIMP-3水平高于存活組，但是在入院第4天和第8天時只有血清TIMP-3水平仍然高于存活者，而且根據(jù)ROC分析結(jié)果，MMCAI患者第1天、第4天和第8天的血清TIMP-3水平都可用于預(yù)測患者30 d死亡風(fēng)險。MMCAI患者入院第1天血清TIMP-3水平升高是影響30 d死亡的獨(dú)立危險因子。

本研究還存在一定的局限性。第一，本研究未檢測有關(guān)MMP數(shù)據(jù)；第二，本研究僅測定MMCAI患者第1天、第4天和第8天的血清TIMP-3水平，其他時期的血清TIMP-3水平可能也值得關(guān)注；第三，本研究為單中心研究，僅納入了病情嚴(yán)重的大腦中動脈供血區(qū)梗死患者，因此結(jié)論不能外推至一般的缺血性卒中患者。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MMCAI死亡患者在發(fā)病第1周的血清TIMP-3水平普遍高于存活患者，且入院第1天時血清TIMP-3水平可以作為30 d內(nèi)死亡的生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果有助于促進(jìn)血清TIMP-3水平在死亡預(yù)測和MMP調(diào)節(jié)中的作用研究，以降低MMCAI患者的死亡風(fēng)險。

【點(diǎn)睛】本研究證實MMCAI患者入院后早期血清TIMP-3水平變化與近期死亡具有相關(guān)性，TIMP-3水平可輔助性用于患者臨床早期治療和預(yù)防。