呂利軍 常艷艷 李闖兵 劉鵬 張凱 高秋明

骨不連是四肢骨折術(shù)后常見并發(fā)癥，治療棘手，目前仍是全世界骨科醫(yī)師臨床工作中所面臨的難點(diǎn)與挑戰(zhàn)。雖然骨不連的治療方法較多，但其發(fā)病率仍高達(dá) 5%～10%[1]，不但給患者及家屬帶來極大的痛苦，而且增加醫(yī)療開支。微小核糖核酸 (microRNA，miRNA)是非編碼的單鏈小分子 RNA，能夠靶向結(jié)合 mRNA 的 3’-非翻譯區(qū)，使靶基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄后沉默，進(jìn)而在細(xì)胞的分化、增值、凋亡等方面進(jìn)行調(diào)控[2]。microRNA 具有多靶性，即一個 microRNA 可以針對多個靶基因的表達(dá)發(fā)揮作用，并且一個靶基因能夠接受多個 microRNA 分子的調(diào)控[3]。microRNA 通過炎癥反應(yīng)、血管生成、誘導(dǎo)成骨及細(xì)胞自噬等過程，在骨不連的發(fā)生、發(fā)展過程中起調(diào)節(jié)作用。骨不連的發(fā)生過程受到多種 microRNA 調(diào)控特定靶基因的表達(dá)，至目前為止，未有對骨不連中 microRNA 對靶基因調(diào)控機(jī)制進(jìn)行具體分析總結(jié)，因此，筆者就骨不連中microRNA 對靶基因調(diào)控機(jī)制的相關(guān)性進(jìn)行綜述，為研究骨不連的分子機(jī)制提供理論依據(jù)，同時也為進(jìn)一步研究microRNA 對骨不連的調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

一、microRNA (miRNA)的生物學(xué)特征

microRNA (miRNA)是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的單鏈非編碼小分子 RNA，長度為 21～25 核苷酸構(gòu)成，microRNA 的前體位于高度保守的基因組非編碼區(qū)，這些區(qū)域已知在發(fā)育和分化中起關(guān)鍵作用[4]。miRNA 廣泛表達(dá)，同時具有組織特異性。microRNA 通過與信使 RNA (mRNA)的 3’-非翻譯區(qū) (3’-UTR)結(jié)合來減少翻譯或者增加轉(zhuǎn)錄本的降解，或通過與完全互補(bǔ)的相關(guān) mRNA 配對誘導(dǎo) mRNA 切割，過表達(dá)或者下調(diào)靶基因從而發(fā)揮基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用[5]。因此，microRNA 幾乎在所有細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，并且已證明它們的失調(diào)在骨不連的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。在這一系列過程中，上調(diào) microRNA 會導(dǎo)致骨不連的發(fā)生，而下調(diào) microRNA 會促進(jìn)骨不連成骨細(xì)胞的增加，二者通過調(diào)節(jié)靶向相同或者不同的分子而參與致病途徑，可能促進(jìn)骨不連或者骨愈合的發(fā)生和發(fā)展。

二、骨不連中的上調(diào)或者下調(diào) microRNA

microRNA 有助于調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖與分化，microRNA 在骨形成、再吸收、重塑和修復(fù)中具有重要作用，此外，已證實(shí) microRNA 參與骨折愈合和骨不連，炎癥反應(yīng)的不平衡、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的增殖和分化減少以及血管形成的功能降低和改變被認(rèn)為是骨折愈合受損的可能致病機(jī)制。因此，microRNA 的上調(diào)或者下調(diào)均會導(dǎo)致骨不連疾病的發(fā)展過程。

1. 骨不連中的上調(diào) microRNA：miR-31a-5 是老年骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs )中一種高表達(dá)的 microRNA，在骨不連中發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用，其在骨不連中顯著上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，來自老年大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出成骨減少和衰老表型增加，這與miR-31a-5p 的上調(diào)有關(guān)[6]。最近有研究證明 miR-31a-5p 的上調(diào)可以下調(diào)靶基因 SATB2、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 2 和骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體 2 的表達(dá) ，并表明抑制 miR-31a-5p 活性可促進(jìn) MSCs 在體外的成骨分化[7]。miR-31a-5p 隨著 BMSCs的衰老而顯著增加，并通過外泌體分泌到細(xì)胞外微環(huán)境中，然后，使用外泌體作為載體的功能，miR-31a-5p 通過RhoA 途徑正向調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化[8]。此外，將 miR-31a-5p應(yīng)用到骨髓中可減少與年齡相關(guān)的骨質(zhì)流失，這表明它可能是治療與年齡相關(guān)的骨不連的潛在生物療法。

miR-381 在骨不連中高表達(dá)，抑制成骨細(xì)胞合成，導(dǎo)致骨折延遲愈合。miR-381 通過與 WNT5A 和 FZD3 的3’-UTR 結(jié)合，從而抑制它們的表達(dá)并進(jìn)一步影響 BMSC 成骨分化[9]。miR-381 表達(dá)上調(diào)并與 Wnt 信號通路相關(guān)。Wnt信號在 BMSC 成骨過程中受到抑制，同時 PPARγ 蛋白上調(diào)。miR-381 過表達(dá)通過靶向 Wnt5A 和 FZD3 (Wnt 信號傳導(dǎo)中的兩個重要因子)抑制成骨分化，從而抑制 β-catenin核易位。miR-381 過表達(dá)顯著降低了成骨標(biāo)志物 Runx2、ALP 和膠原蛋白 Ⅰ 的蛋白質(zhì)水平，同時增加了 PPARγ 的蛋白質(zhì)水平，PPARγ 是一種促進(jìn)脂肪生成和抑制成骨的轉(zhuǎn)錄因子[10]。mmu-miR-140-3p 和 mmu-miR-140-5p 在小鼠骨不連模型中處于高表達(dá)狀態(tài)，其上調(diào)可引起骨不連發(fā)生，具體發(fā)生機(jī)制是 mmu-miR-140-3p 和 mmu-miR-140-5p 負(fù)調(diào)節(jié)核因子-κB (NF-κB)的炎癥信號傳導(dǎo)，下調(diào)炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致愈合受損，通過下調(diào) SDF-1α 對 BMP-2 具有間接抑制作用，從而導(dǎo)致骨不連發(fā)生[11]。

2. 骨不連中的下調(diào) microRNA：據(jù)文獻(xiàn)報道，miR-92a下調(diào)能夠通過血管生成作用促進(jìn)骨不連再生[12]，miR-20a、miR-29b、miR-2861、miR-138、miR-26a、and miR-21 等均具有促進(jìn)成骨再生作用，miR-193a-3p 可能在骨不連中下調(diào)，使上調(diào)靶基因 MAPK10 的表達(dá)[13]。hsa-microRNA(miR)-1225-5p-CCNL2、hsa-miR-339-5p-PRCP 和 hsa-miR-193a-3p-絲裂原活化蛋白激酶 10 (MAPK10)是三對與基因表達(dá)水平降低相關(guān)的 microRNA。hsa-miR-193a-3p 被證明通過靶向 MAPK10 誘導(dǎo) BN。下調(diào)的差異表達(dá)基因主要與“ECM-受體相互作用”、“黏著斑”和“鈣信號通路”等途徑相關(guān)[14]。hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-339-5p 和hsa-miR-193-3p 及其各自的靶基因 CCNL2、PRCP 和MAPK10 作為對骨不連診斷的潛在生物標(biāo)志物，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化和遷移[15]。

三、microRNA 在骨不連中的機(jī)制

近年來多項研究發(fā)現(xiàn) microRNA 能夠調(diào)節(jié)特點(diǎn)靶基因的表達(dá)，從而對骨不連發(fā)展過程中的炎性反應(yīng)、細(xì)胞增殖、血管新生及成骨細(xì)胞分化、細(xì)胞自噬等過程產(chǎn)生影響，筆者就 microRNA 促進(jìn)靶基因調(diào)控介導(dǎo)骨不連的作用機(jī)制進(jìn)行詳細(xì)闡述見圖1。

圖1 骨不連主要 microRNA 生物學(xué)表型及靶基因調(diào)控分子 FGF-2示成纖維細(xì)胞生長因子 2；BMP-2 示骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2；TGF-β 示轉(zhuǎn)化生長因子-β；TGF-α 示腫瘤壞死因子-α；IL-1 示白細(xì)胞介素-1；VEGF 示血管內(nèi)皮生長因子；RUNX2 示 RUNT 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 2Fig.1 Biological phenotype of main microRNA in nonunion and target gene regulatory molecule FGF-2 shows fibroblast growth factor 2; BMP-2 shows bone morphogenetic protein-2; TGF-β indicates transforming growth factor-β; TGF-α shows tumor necrosis factor-α;IL-1 shows interleukin-1; VEGF shows vascular endothelial growth factor; RUNX2 shows RUNT-related transcription factor 2

表2 骨不連相關(guān)下調(diào) microRNATab.2 Nonunion-related down-regulation of microRNA

1. 炎性反應(yīng) microRNA 啟動炎性反應(yīng)并調(diào)控骨痂重塑：microRNA 通過炎性反應(yīng)來影響骨折愈合過程中骨不連的發(fā)生發(fā)展。一項研究表明對于糖尿病的大鼠橫型骨折模型發(fā)現(xiàn) miR-181a-1-3p 通過靶向降低 IL-1α 的表達(dá)，炎性反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致骨折愈合延遲和骨不連發(fā)生[16]。研究結(jié)果表明巨噬細(xì)胞的極化障礙導(dǎo)致骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中核轉(zhuǎn)錄因子-κB 活性升高，抑制成骨分化[17]。miR-31a-5p、miR-146a-5p、miR-146b-5p 和 miR-223-3p 參與了炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，miR-146a-5p 和 miR-146b-5p 通過靶向抑制 TNF 受體相關(guān)因子 6 和白細(xì)胞介素 (IL)-1 受體相關(guān)激酶來損害NF-κB 信號傳導(dǎo)，因此抑制 TNF-α 和 IL-1。20miR-223-3p靶向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子 3 以負(fù)調(diào)節(jié) IL-1 和 IL-6 的表達(dá)[18]。總之，miRNA 可能在骨不連的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，因為它們在調(diào)節(jié)炎癥方面發(fā)揮重要作用。miR-140-3p通過調(diào)節(jié)核受體共激活因子 1 (NCOA1)和核受體相互作用蛋白 1 (NRIP1)的表達(dá)來負(fù)調(diào)節(jié)核因子-κB (NF-κB)炎癥信號傳導(dǎo)。miR-451a 通過 14-3-3ζ 和 Rab5a 抑制 p38 絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK)的磷酸化來減輕炎癥[5]。促炎細(xì)胞因子，如 TNF-α 和 IL-1α 能夠激活 p38 MAPK。此外，p38 MAPK 的激活和信號傳導(dǎo)也導(dǎo)致這些炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[19]。p38 MAPK 和促炎細(xì)胞因子之間的相互作用對于控制成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中的生死信號級聯(lián)反應(yīng)很重要[20]?？傊琺iR-140-3p、miR-181a-5p 和miR-451a 可能通過調(diào)節(jié)炎癥在骨折愈合過程中發(fā)揮重要作用。然而，mRNA 水平不能代表炎性因子的蛋白水平，探索炎性分子的蛋白水平才能從炎癥反應(yīng)角度為骨不連的治療提供依據(jù)。

2. 血管再生 microRNA 為骨愈合營養(yǎng)供給提供通道：充分的血液供應(yīng)為骨折愈合提供氧氣、離子、能量并運(yùn)載炎性細(xì)胞及成骨相關(guān)因子，若骨折愈合過程中血管營養(yǎng)供給通道未建立，則會導(dǎo)致骨折延遲愈合甚至骨不連發(fā)生。VEGF 通過 PI3K / Akt、Notch 等信號通路促進(jìn)血管內(nèi)皮的增殖，從而調(diào)控血管內(nèi)皮的重建與再生。外泌體可以作為載體在不同細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)、mRNAs 和microRNAs，受體細(xì)胞的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)翻譯可以通過遞送物質(zhì)而改變[12]。Zhang 等[21]進(jìn)行大鼠骨不連模型實(shí)驗，證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的移植能夠促進(jìn)成骨和血管生成，對骨不連的治療發(fā)揮關(guān)鍵作用，這種促進(jìn)作用可能歸因于 BMP-2 / Smad1 / RUNX2 和 HIF-1α / VEGF信號通路的激活，其 RUNX2 是骨形成的關(guān)鍵因素。MicroRNA-210 (miR-210)是關(guān)鍵的缺氧相關(guān) miRNA，研究表明，這種 miRNA 通過靶向 Ephrin-A3、E2F3、NPTX1、RAD52、ACVR1B、MNT 和 CASP8AP2 等參與血管生成、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化、脫氧核糖核酸修復(fù)和細(xì)胞凋亡[22]。Lu 等[23]研究 microRNA-210 (miR-210)在氧 - 葡萄糖剝奪條件下對內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響，結(jié)果表明miR-210-3p 的上調(diào)增強(qiáng)了內(nèi)皮祖細(xì)胞在氧 - 葡萄糖剝奪條件下的血管生成能力，相反，下調(diào) miR-210-3p 抑制了這些過程。Takahara 等[16]對大鼠閉合性股骨骨折研究發(fā)現(xiàn)miR-210-3p 在骨折愈合后期表達(dá)下降，考慮與血管生成減少有關(guān)，從而引起骨折延遲愈合甚至骨不連出現(xiàn)。因此，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體、microRNA-210、miR-210-3p 均能夠促進(jìn)血管再生，從而促進(jìn)骨折愈合，為治療骨不連提供新的思路。

3. microRNA 在成骨或者軟骨細(xì)胞分化中的作用：成骨或者軟骨細(xì)胞分化、血管形成是骨折愈合的主要過程，骨細(xì)胞受損或者血管形成障礙均會引起骨折不愈合甚至發(fā)生骨不連。Luzi 等[24]證實(shí) miR-196a 調(diào)節(jié)人脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化，而不影響脂肪形成分化。Serpin 家族 B 成員 2 (SerpinB2)是絲氨酸蛋白酶抑制劑 (serpins)B 亞群的成員。SerpinB2 是胎盤組織來源的尿激酶纖溶酶原激活物 (uPA)抑制劑，也稱為纖溶酶原激活物抑制劑 2 型 (PAI-2 )，SerpinB2 是一種 TGFβ 反應(yīng)基因。一項研究表明敲除 SerpinB2 基因能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化潛能，這表明 SerpinB2 基因可能在成骨過程中起重要作用[25]。SerpinB2 基因沉默通過 Wnt /β-catenin 信號通路促進(jìn) hBMSCs 的成骨分化，體內(nèi)沉默SerpinB2 基因有效促進(jìn)骨折愈合，提示 SerpinB2 可能是骨折愈合的新靶點(diǎn)。Runx2 是 BMSCs 成骨分化的主要轉(zhuǎn)錄因子，可抑制脂肪細(xì)胞分化。Runx2 主要受 Wnt / β-catenin信號通路的調(diào)節(jié)，也稱為經(jīng)典 Wnt 通路，是 Wnt 信號通路的三大分支之一，β-連環(huán)蛋白是 Wnt / β-連環(huán)蛋白通路的重要組成部分，是尋找治療藥物的中心目標(biāo)[26]。Wei等[27]對萎縮性骨不連模型通過生物信息學(xué)分析、miRNA和 mRNA 的 qRT-PCR、蛋白質(zhì)印跡以及熒光素酶檢測證實(shí)上調(diào) hsa-miR-149、hsa-miR-221、has-miR-628-3p 和hsa-miR-654-5p 可以下調(diào)靶基因堿性磷酸酶 (ALPL )、血小板衍生生長因子亞基 A (PDGFA)和 BMP2 的表達(dá)，從而抑制成骨細(xì)胞的合成。BMPs 是屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族的多功能生長和分化因子，TGF-β 通過影響骨形成成骨細(xì)胞和骨吸收破骨細(xì)胞的分化和活性而在骨重塑中發(fā)揮作用。

4. microRNA 在細(xì)胞增殖與自噬中的作用：細(xì)胞增殖是骨重建的基石，而細(xì)胞自噬是骨愈合的重要伴侶，自噬是將受損的細(xì)胞器與錯誤折疊的蛋白質(zhì)在利用的過程，增殖與自噬二者是有機(jī)統(tǒng)一的，均促進(jìn)骨折愈合。軟骨細(xì)胞特異性 miR-140 miRNA 是小鼠正常軟骨內(nèi)骨生長所必需的，miR-140 缺乏會導(dǎo)致侏儒癥和顱面畸形，miR140-5p的靶基因是 Wnt11，Wnt11 的 3’-非翻譯區(qū)中預(yù)測的miR140-5p 結(jié)合位點(diǎn)的破壞表明會增加 Wnt11 mRNA 的表達(dá)并使骨骺發(fā)育的速度加快[28]。硫酸鈣骨移植物其多孔結(jié)構(gòu)有助于細(xì)胞增殖，機(jī)制是多孔結(jié)構(gòu)為液體的流動提供空間，產(chǎn)生流體剪切力而促進(jìn)骨愈合。據(jù)報道[29-30]，流體剪切力通過 miR-140-5p / EGFA / ERK5 通路以及 NFATc1 /ERK5 通路促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。骨折后局部形成血腫，局部組織缺氧，炎癥反應(yīng)激活自噬系統(tǒng)，從而促進(jìn)骨折愈合。雷帕霉素激活自噬系統(tǒng)后，成骨分化因子表達(dá)會升高，比如 RUNX2、骨鈣素、骨橋蛋白，茜素紅染色及堿性磷酸酶染色結(jié)果顯示成骨分化水平升高，新生骨的體積增加[31]。相反，3-甲基腺嘌呤 (3-methyladenine，3-MA )是自噬抑制劑，導(dǎo)致上述表達(dá)因子降低，從而抑制成骨細(xì)胞的分化[32]。目前，對于自噬與增殖為靶點(diǎn)治療骨不連的方式較少，有必要進(jìn)一步研究增殖與自噬對骨愈合及骨不連的具體調(diào)控機(jī)制及臨床應(yīng)用。

四、microRNA 作為骨不連分子診斷與治療靶點(diǎn)的潛在價值

目前臨床上對于骨不連的診斷主要靠影像學(xué)檢查，其中 X 線與 CT 檢查是最常用的檢查方法，但仍存在許多局限性，比如對于感染性骨不連的診斷因細(xì)菌低毒力以及陽性率較低，急需一種敏感性與特異性強(qiáng)的方法去診斷。臨床上檢測 microRNA 的方法有 qRT-PCR、microRNA 芯片技術(shù)、蛋白質(zhì)印跡以及熒光素酶檢測。據(jù)文獻(xiàn)報道，miRNA-331-3p 和成纖維細(xì)胞生長因子 23 (FGF23)指標(biāo)能夠用于診斷感染骨不連，miRNA-331-3p 生物標(biāo)志物被證明通過靶向 FGF23 來調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞礦化，該指標(biāo)作為感染性骨不連和其它炎癥性骨病的潛在診斷生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[13]。MicroRNA-26a (miR-26a)在骨代謝中起關(guān)鍵作用，Sun 等[33]使用 Wb、qRT-PCR 技術(shù)檢測骨不連發(fā)病情況，發(fā)現(xiàn) miR-26a 升高是骨不連預(yù)后不良的可靠指標(biāo)。對于骨不連的治療目前臨床上主要包括骨移植、外泌體介導(dǎo)的干細(xì)胞治療、低強(qiáng)度脈沖超聲波療法、Ilizarov 技術(shù)以及 Masquelet 技術(shù)等，但隨著 microRNA 在骨不連中的作用被發(fā)現(xiàn)，microRNA 的靶向治療也在實(shí)驗中證明具有可行性與有效性，為臨床治療骨不連提供了思路。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體 miR-144-5p 在骨再生中的重要作用，可以作為治療骨不連的潛在靶點(diǎn)[34]。Wu 等[35]發(fā)現(xiàn) miR-1260a 在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體 Fe3O4 中高表達(dá)，并且外泌體miR-1260a 通過抑制 HDAC7 和 COL4A2 的表達(dá)來增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化和血管生成。microRNA 靶點(diǎn)的治療目前仍處于基礎(chǔ)實(shí)驗階段，比如中藥淫羊苷通過調(diào)控 microRNA，促進(jìn)成骨細(xì)胞表達(dá)，抑制破骨細(xì)胞，用于治療骨不連[36]，microRNA 用于臨床治療骨不連的相關(guān)報道仍然較少，需要進(jìn)一步研究。

五、總結(jié)與展望

microRNA 在骨不連中通過調(diào)控相關(guān)靶基因和信號通路，參與骨不連細(xì)胞的增殖、自噬、成骨、血管再生以及炎性反應(yīng)，并且作為骨不連臨床輔助診斷和預(yù)后預(yù)測的潛在生物學(xué)標(biāo)志，具有骨不連臨床靶點(diǎn)治療的潛力，有著重要的臨床價值和應(yīng)用前景。雖然 microRNA 在骨不連中的價值逐漸被人們所發(fā)現(xiàn)和重視，但臨床中仍有許多問題和挑戰(zhàn)有待進(jìn)一步去解決，比如在眾多與骨不連相關(guān)的 microRNA 以及靶基因中，如何判斷那個 microRNA在骨愈合的哪個階段具有代表性，單個的 microRNA 可以調(diào)控多個靶基因或者單個靶基因被 microRNA 所調(diào)控，還需要繼續(xù)探索與實(shí)驗，這都是急需解決的問題。因此，microRNA 在骨不連中的分子機(jī)制仍需繼續(xù)探索，需要投入大量的實(shí)驗技術(shù)去突破，在診斷、預(yù)后、靶向治療方面需要更多、更細(xì)、更深入的研究。