周 閏，楊 亞，駱夏輝，劉躍榮，彭丁文，劉 偉，申超峰，徐 嚴(yán)

（郴州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院郴州分院，湖南郴州 423000）

葡萄作為重要的經(jīng)濟(jì)類果樹作物之一，具有悠久的栽培歷史和豐富多樣的品種，是世界第二大水果。我國作為葡萄（Vitis viniferaL.）的生產(chǎn)大國之一，葡萄的栽培面積和產(chǎn)量均居世界前列[1]?！鹈鬯{(lán)寶石’是近幾年所研發(fā)的一種葡萄新品，別名‘月光之淚’，該品種屬于歐亞種，天然無核，果色藍(lán)黑，果肉脆滑，果粒果穗著色均勻一致，果皮輕薄，果肉有淡淡的玫瑰及牛奶香味。果粒為長圓形，最長的超過了5.5 cm，平均粒質(zhì)量7.7 g，最大的果粒質(zhì)量在10 g 以上，果穗較大，穗質(zhì)量2～3 kg，最高產(chǎn)量可達(dá)4 000 kg/667 m2?！鹈鬯{(lán)寶石’優(yōu)質(zhì)、豐產(chǎn)、耐儲運(yùn)，且抗病性強(qiáng)于其它歐亞種，近幾年的市場銷量形勢喜人，栽培該品種的果農(nóng)數(shù)量急劇增加[2]，鑒于近年市場對種植藍(lán)‘甜蜜藍(lán)寶石’葡萄品種的急切需求，快速擴(kuò)繁該品種有助于獲得較高的經(jīng)濟(jì)效益。

葡萄主要通過扦插和嫁接等無性繁殖方法進(jìn)行繁殖，雖然該方法具有簡捷方便的特點(diǎn)，但受到區(qū)域、季節(jié)變化的局限，且容易被病毒感染，最終導(dǎo)致葡萄品種的種性嚴(yán)重退化[3-5]。組織培養(yǎng)則能保持親本特性并在短期內(nèi)大量繁殖，加快市場上優(yōu)質(zhì)種苗的推廣速度[6]，同時(shí)，莖尖接種還可得到部分脫毒的優(yōu)質(zhì)種苗，一直以來，利用組織培養(yǎng)繁育優(yōu)良品種一直是葡萄苗木生產(chǎn)的研究重點(diǎn)[7]。培養(yǎng)基成分與激素的配比能夠影響外植體的啟動培養(yǎng)和繁殖體的增殖效率，研究表明，添加2 mg/L 6-卞氨基嘌呤（6-BA）和0.2 mg/L 萘乙酸（NAA）的MS 培養(yǎng)基作為‘巨峰’的初代培養(yǎng)基萌芽率達(dá)到71.1%，MS 培養(yǎng)基添加0.2 mg/L 3-吲哚丁酸（IBA）、1.0 mg/L 6-BA 和0.5 mg/L KT 啟動培養(yǎng)釀酒葡萄莖段外植體，萌芽率達(dá)73%以上，圓葉葡萄品種在僅加入6-BA 1 mg/L 的MS 培養(yǎng)基中，莖段增殖效率高,植株生長良好[8-9]?！鹈鬯{(lán)寶石’是一個(gè)新品種，其組織培養(yǎng)尚未見報(bào)道，建立其組織培養(yǎng)快速繁育體系，對加快其苗木生產(chǎn)和繁育以及提高苗木質(zhì)量具有重要意義。本試驗(yàn)以‘甜蜜藍(lán)寶石’葡萄當(dāng)年生半木質(zhì)化莖段為外植體，對‘甜蜜藍(lán)寶石’組培技術(shù)條件進(jìn)行篩選，從而獲得合適的培養(yǎng)體系，為組培進(jìn)行快速育苗研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象

以‘甜蜜藍(lán)寶石’葡萄當(dāng)年生半木質(zhì)化莖段為試材，取自郴州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所小埠果樹基地葡萄溫室大棚。

1.1.2 試劑

植物生長調(diào)節(jié)劑：包含6-BA，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；IBA，上海稼豐園藝用品有限公司；NAA，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。蔗糖、瓊脂（BR），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基及配制

基本培養(yǎng)基為MS、1/2 MS 及1/4 MS，其中1/2 MS 是將MS 中大量元素成分減半，1/4 MS 是將MS 中大量元素成分減為1/4；所有培養(yǎng)基中均加3%蔗糖和0.65%瓊脂，pH 調(diào)節(jié)至5.80～5.95，高壓滅菌條件為壓力1.1 kg/cm2，121 ℃保持20 min。

1.2.2 材料消毒

以生長健壯的半木質(zhì)化莖段為外植體，莖段直徑約為0.8 cm，首先用軟毛刷蘸取洗潔精輕刷莖段表面，然后在流水下沖洗1 h，再剪成長2～3 cm 帶一個(gè)腋芽的莖段，置于超凈工作臺上。先用75%酒精消毒40 s，然后用無菌水清洗2 次，再分別用1%、3%次氯酸鈉及0.1%升汞三種試劑消毒，試驗(yàn)設(shè)6 個(gè)不同的消毒處理，見表1。

表1 不同消毒處理Table 1 Different disinfection treatment

1.2.3 接種

莖段消毒完后再用無菌水反復(fù)漂洗5 次，用滅菌的濾紙吸去表面多余水分。然后切去兩端褐化的傷口，將消毒過的材料切成長1.0 cm 左右?guī)б粋€(gè)腋芽的莖段，正插于啟動培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。啟動培養(yǎng)基為1/2 MS，不添加任何激素，每瓶接種1 個(gè)莖段，每個(gè)處理接種20 個(gè)莖段，設(shè)3 次重復(fù)。設(shè)置培養(yǎng)室條件如下：保持溫度26 ℃左右，相對濕度為40%～60%，每日光照12 h。15 d 后，統(tǒng)計(jì)接種材料的污染率、褐變率和成活率，計(jì)算方法分別見公式（1）（2）（3），用以確定最佳的消毒方法。

1.2.4 快繁體系的建立

（1）初代培養(yǎng)

采用篩選出的最佳消毒方法進(jìn)行消毒，把消毒后的莖段接種于初代培養(yǎng)基上，設(shè)置四個(gè)配方（分別記作PC1、PC2、PC3、PC4），培養(yǎng)基成分見表2。每瓶接種1 個(gè)莖段，每個(gè)處理接種30 個(gè)莖段，3 次重復(fù)。培養(yǎng)條件為保持溫度26 ℃左右，相對濕度為40%～60%，每日光照12 h。30 d 后，記錄生長情況并統(tǒng)計(jì)萌芽率。萌芽率按照公式（4）計(jì)算得出。

表2 不同初代培養(yǎng)基配方Table 2 Different formulations of primary mediums

式中，A為萌芽的莖段總數(shù)，T為接種的莖段總數(shù)。

（2）增殖培養(yǎng)

將初代培養(yǎng)腋芽生長最好的培養(yǎng)基作為篩選出的初代培養(yǎng)基配方，接種50 d 后，當(dāng)該培養(yǎng)基上腋芽生長至株高4～5 cm 時(shí)，將其剪下，去掉葉片，從中剪取健康飽滿的處在中間節(jié)位的單芽莖段，長度約0.5～1 cm，做到莖段基本一致，然后接種于增殖培養(yǎng)基上，每瓶接種3個(gè)莖段，培養(yǎng)基設(shè)置5 個(gè)配方（分別記作PZ1、PZ2、PZ3、PZ4、PZ5），培養(yǎng)基成分見表3。每個(gè)處理接種15 個(gè)莖段，設(shè)3 次重復(fù)，培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)。45 d 后統(tǒng)計(jì)萌芽率、平均株高、增殖系數(shù)和生長情況。其中增殖系數(shù)按照公式（5）計(jì)算。

表3 不同增殖培養(yǎng)基配方Table 3 Different formulations of breeding mediums

式中，B為可用于下次繼代的莖段總數(shù)，W為接種的莖段總數(shù)。

（3）生根培養(yǎng)

增殖培養(yǎng)45 d 后，將腋芽生長最好的培養(yǎng)基作為篩選出的增殖培養(yǎng)基配方，將其中生長的腋芽剪下，去掉葉片，從中剪取健康飽滿的中間節(jié)位的單芽莖段，長度0.5～1 cm，做到莖段基本一致，接種于生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)基設(shè)置5 個(gè)配方（分別記作PT1、PT2、PT3、PT4、PT5），培養(yǎng)基成分見表4。每瓶接種5 個(gè)莖段，每個(gè)處理接種20個(gè)莖段，設(shè)3 次重復(fù)，培養(yǎng)條件與增殖培養(yǎng)條件一致。50 d后觀察生長情況，統(tǒng)計(jì)萌芽率、生根率、主根密度及平均根長。其中生根率按照公式（6）計(jì)算得出。

表4 不同生根培養(yǎng)基配方Table 4 Different formulations of rooting mediums

式中，C為生根的莖段總數(shù)，W為接種的莖段總數(shù)。

（4）煉苗和移栽

生根培養(yǎng)50 d 以上，當(dāng)生根良好的組培苗株高達(dá)到5～7 cm、帶5～7 個(gè)葉片時(shí)，將試管苗置于煉苗室，先擰松瓶蓋煉苗2～3 d，再完全打開瓶口煉苗7～10 d，待莖稈顏色加深，葉片發(fā)亮?xí)r即可出瓶移栽，將植株小心取出，用自來水洗凈組培苗根部的培養(yǎng)基，準(zhǔn)備配制好的基質(zhì)（含椰糠、草炭土、珍珠巖和蛭石四種成分，比例為2∶1∶1∶1），用多菌靈溶液攪拌至基質(zhì)土坨不散，分裝至營養(yǎng)缽（直徑約6.5 cm），然后移栽組培苗。將苗子置于育苗箱中，蓋上蓋子保濕，然后保持溫度在25 ℃左右，注意通風(fēng)，防止基質(zhì)發(fā)霉，當(dāng)出現(xiàn)新生葉1～2 片時(shí)，打開蓋子通風(fēng)2 d，將苗再次轉(zhuǎn)入營養(yǎng)袋，觀察成活情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

采用Excel 2007 軟件和SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體最佳消毒方法

用次氯酸鈉消毒后，外植體易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，且影響腋芽的萌發(fā)，而用升汞消毒則顏色較正常。由表5 可知，0.1%升汞消毒的表現(xiàn)優(yōu)于1%、3%次氯酸鈉，莖段外植體的最佳消毒處理是T6，即0.1%升汞消毒15 min，外植體污染率、褐變率和成活率分別是46.7%、13.3%和40.0%。因此，外植體的消毒方法采用先用75%酒精消毒40 s，再用0.1%升汞消毒15 min。

表5 外植體最佳消毒方法的篩選Table 5 Selection of the best method for disinfection of explants

2.2 不同初代培養(yǎng)基對莖段誘導(dǎo)的影響

莖段外植體接種到不同初代培養(yǎng)基上，30 d 后統(tǒng)計(jì)莖段外植體萌芽率（見表6）。結(jié)果表明，外植體在四種培養(yǎng)基配方上都有萌芽，但是在不添加任何激素的1/2 MS上的表現(xiàn)最好，萌芽率達(dá)到57.8%，新芽生長正常；以1/2 MS 為基本培養(yǎng)基的另兩個(gè)配方，其中添加了6-BA 和IBA 兩種激素，莖段基部產(chǎn)生較多愈傷組織，且新芽生長不正常，后期出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象；在不添加任何激素的MS培養(yǎng)基上，莖段基部膨大明顯，影響腋芽的生長，導(dǎo)致出芽慢且有玻璃化現(xiàn)象。所以確定最佳初代培養(yǎng)基配方為1/2 MS+30 g/L 蔗糖+6.5 g/L 瓊脂。

表6 不同初代培養(yǎng)基莖段誘導(dǎo)情況Table 6 Stem segment induction in different primary mediums

2.3 不同增殖培養(yǎng)基對莖段培養(yǎng)的影響

增殖培養(yǎng)過程中，5 種培養(yǎng)基上的莖段生長表現(xiàn)各不相同，第45 天統(tǒng)計(jì)情況，結(jié)果見表7。以不添加任何激素的1/2 MS 增殖效果最好，增殖系數(shù)高達(dá)5.2，顯著高于其他處理，基本不產(chǎn)生愈傷，生長正常，還能同時(shí)生根；在PZ1、PZ2 和PZ3 三種培養(yǎng)基上，莖段基部愈傷率都達(dá)到100%，隨著6-BA 濃度的提高，萌芽率逐漸升高，但是愈傷組織越來越大，新芽葉片短小、節(jié)間短縮，且部分出現(xiàn)叢生芽及玻璃化的現(xiàn)象；PZ4 中生長激素用NAA 替換IBA，但是其產(chǎn)生的愈傷組織更大，葉片小且偏黃，新芽生長不正常，說明該配方不合適。

表7 不同增殖培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果Table 7 Culture effect of different propagation medium

2.4 不同生根培養(yǎng)基對葡萄生根的影響

生根培養(yǎng)50 d 后，隨機(jī)選取10 株苗進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表8（見下頁）。‘甜蜜藍(lán)寶石’葡萄品種容易生根，不添加任何激素的1/2 MS 培養(yǎng)基生根率也很高，但是新梢莖稈纖細(xì)，不利于移栽。添加不同濃度的生長素后均有生根，其中1/4 MS 培養(yǎng)基中添加IBA 濃度為0.1 mg/L 時(shí)，即培養(yǎng)基PT1 效果最好，萌芽率達(dá)到91.7%，生根率達(dá)到88.3%，生長正常，隨著IBA 濃度逐漸提高，雖然新梢莖稈更加粗壯，但基部產(chǎn)生的愈傷更多，導(dǎo)致萌芽率及生根率逐漸降低，新梢生長過慢。而添加0.5 mg/L 的NAA，則出現(xiàn)部分只長根不萌芽的現(xiàn)象，萌芽率只有30%，生根率只有55%，且根為氣生根，愈傷組織大而疏松。

表8 不同生根培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果Table 8 Culture effect of different rooting medium

2.5 煉苗移栽情況

試管苗馴化時(shí)，保持溫度20～28 ℃，濕度在80%左右，讓試管苗逐漸適應(yīng)外界的環(huán)境，不能操之過急。本試驗(yàn)采用配制好的基質(zhì)土用于幼苗的馴化，再次移栽至營養(yǎng)袋時(shí)，已經(jīng)產(chǎn)生較多新根，在營養(yǎng)袋生長兩周后，統(tǒng)計(jì)成活率高達(dá)90%。

3 討論

外植體消毒作為組織培養(yǎng)的第一步，具有關(guān)鍵作用，外植體的生長發(fā)育情況及對其消毒時(shí)間的長短，對發(fā)芽率尤為重要，因此尋求最佳的消毒藥劑及其濃度和時(shí)間的組合，控制外植體污染和褐變率，是消毒環(huán)節(jié)的重要問題[10-11]。本試驗(yàn)篩選出了較優(yōu)的消毒方法，但外植體污染率太高，萌芽率過低，可能因?yàn)槿〔挠谝巴獾沫h(huán)境，且取材季節(jié)過晚，雨季天氣來臨，病菌種類多變且繁殖活躍[12]，導(dǎo)致難以消毒。雖然通過延長消毒時(shí)間可以降低部分污染率，但同時(shí)也增加了死亡率，最終萌芽率也不高。所以進(jìn)一步探索合適的取材時(shí)間很有必要。

植物激素具有刺激形成層細(xì)胞的分裂、誘導(dǎo)愈傷組織、不定芽和不定根的形成等生理作用，缺乏或者過多都會對植物生長產(chǎn)生不利影響[7]。植物組織培養(yǎng)增殖過程中，可以通過腋芽產(chǎn)生不定芽（叢生芽）和腋芽萌發(fā)成新梢兩種方式擴(kuò)繁，生長素類物質(zhì)在兩種方式中均是必需的，而細(xì)胞分裂素類物質(zhì)在促發(fā)叢生芽的方式中是必需的，但在腋芽萌發(fā)成新梢的過程中不是必需的[13-15]。但本試驗(yàn)增殖培養(yǎng)過程，在添加了激素的培養(yǎng)基中，因?yàn)榛慨a(chǎn)生較多愈傷，抑制了發(fā)根和抽莖，芽的生長受到抑制，生長緩慢；或者部分產(chǎn)生了叢生芽，但是難以繼續(xù)生長，并出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，所以選擇不添加任何激素的1/2 MS 基本培養(yǎng)基作為增殖培養(yǎng)基，以腋芽萌發(fā)成新梢的方式進(jìn)行擴(kuò)繁，不產(chǎn)生叢生芽，繼代增殖系數(shù)相對較低，但組培苗生長健壯，多次繼代培養(yǎng)后無玻璃化、褐化現(xiàn)象[16-17]；生根培養(yǎng)過程中，隨著添加IBA 濃度的逐步升高，基部產(chǎn)生的愈傷也不斷增多，導(dǎo)致萌芽率及生根率逐漸降低，新梢生長減緩，但是在不添加生長激素的培養(yǎng)基中，新梢莖稈纖細(xì)，不利于移栽，所以選擇添加0.1 mg/L的IBA 進(jìn)行生根培養(yǎng)最合適，這說明一定濃度的外源生長素如IBA、IAA 可促進(jìn)葡萄根的發(fā)育和試管苗生長，但濃度過高誘導(dǎo)產(chǎn)生大量愈傷組織，則會抑制試管苗的生長[18-21]，與大部分研究一致。

營養(yǎng)物質(zhì)對組培苗的生長狀況影響很大[20]。雖然本試驗(yàn)中莖段可以一次成苗，一次成苗即將繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)同時(shí)進(jìn)行，既能加快試管苗的培育速度，又能減少勞動力的消耗，具有很大優(yōu)勢，但因?yàn)椴捎迷鲋撑囵B(yǎng)基配方同步生根的苗子莖稈過于纖細(xì)，不利于煉苗移栽；而采用生根培養(yǎng)基配方一次成苗，則增殖太慢，因?yàn)樯囵B(yǎng)后的瓶苗莖稈過于老化，難以再增殖。而用兩次成苗法，即用增殖培養(yǎng)基先增殖，然后再轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，則起到了壯苗的作用，能有效提高移栽的成活率，且培養(yǎng)基大量元素的用量減半，在生產(chǎn)上更有成本優(yōu)勢。所以本試驗(yàn)增殖和生根分兩步完成，這與大部分研究一次成苗的結(jié)論不一致[21]，分析原因可能是培養(yǎng)基的配方需要調(diào)整，也可以嘗試縮短生根培養(yǎng)的時(shí)間，及時(shí)轉(zhuǎn)接繼代，用以提高增殖率，今后仍需進(jìn)一步探索。

4 結(jié)論

‘甜蜜藍(lán)寶石’葡萄的組織培養(yǎng)包括莖段外植體消毒、啟動培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)以及煉苗移栽環(huán)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)，‘甜蜜藍(lán)寶石’外植體的最佳消毒方法是先采用75%酒精消毒40 s，再用0.1%升汞消毒15 min；最佳初代培養(yǎng)基為1/2 MS＋30 g/L 蔗糖+6.5 g/L 瓊脂，萌芽率達(dá)到57.8%；1/2 MS 增殖培養(yǎng)效果最好，增殖培養(yǎng)45 d，增殖系數(shù)高達(dá)5.2；生根培養(yǎng)基以1/4 MS+IBA 0.1 mg/L效果最好，生根培養(yǎng)50 d，生根率達(dá)到88.3%，新芽莖稈較為粗壯，生長正常；煉苗時(shí)，保持溫度20～28 ℃，濕度在80%左右，成活率高達(dá)90%。該組培繁殖體系可用于‘甜蜜藍(lán)寶石’葡萄新品種的繁育，有一定的潛在應(yīng)用前景，為其商業(yè)化生產(chǎn)提供了理論參考。