田 鑫,張 艷,余 明,曹泮相,張建永,段燦燦

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室,貴州 遵義 563099;2.遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,貴州 遵義 563099;3.貴州務(wù)川萬年峰農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司,貴州 務(wù)川 564300)

香榧(TorreyagrandisFort.),為中國(guó)原產(chǎn)樹種、國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物,主產(chǎn)地為江蘇南部、浙江等,貴州也有引種。香榧目前的藥用部位是種子,其化學(xué)成分包括:萜類和揮發(fā)油、有機(jī)酸、脂肪等?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中有記錄榧子“主腹中邪氣,去三蟲,蛇螫”,并已被2020版《中國(guó)藥典》收錄,其可以起到殺蟲消積、潤(rùn)肺止咳和潤(rùn)燥通便的作用[1]?，F(xiàn)代的藥理學(xué)研究表明香榧種子可降血糖[2],且香榧種子中黃酮類化合物的作用較強(qiáng)[3];香榧種子中的煙酸和葉酸具有助消化和滋潤(rùn)皮膚等藥理活性[4-5]。然而,目前《中國(guó)藥典》中僅有榧子(種子)的薄層色譜定性鑒別和酸敗度、酸值、羰基值、過氧化值檢查項(xiàng),湖北、山東和上海等省市地方標(biāo)準(zhǔn)中加有雜質(zhì)、水分、總灰分檢查項(xiàng)[6-8]。綜上可知,香榧種子目前尚無含量測(cè)定項(xiàng),影響了對(duì)香榧種子指標(biāo)成分的質(zhì)量控制,制約了其進(jìn)一步開發(fā)利用。

貴州省目前引種香榧樹的面積已達(dá)到5.1萬畝[9],主要分布在遵義市,香榧種子作為主要產(chǎn)品初步形成了產(chǎn)業(yè)鏈,整體發(fā)展前景很好。然而引種后的質(zhì)量和品質(zhì)如何?目前尚無相關(guān)研究。因此,本研究擬建立黔產(chǎn)香榧種子HPLC指紋圖譜及多指標(biāo)含量測(cè)定方法,為黔產(chǎn)香榧種子的質(zhì)量控制和進(jìn)一步開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司);沃特浦超純水設(shè)備(四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司);超聲波清洗器(寧波新藝超聲設(shè)備有限公司);電子天平、十萬分之一電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試劑 甲醇(色譜純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司),甲醇(分析純,成都金山化學(xué)試劑有限公司),乙酸(色譜純,賽默飛世爾科技公司),對(duì)照品沒食子酸(分析純,純度≥99%,批號(hào)PS000688,成都普思生物科技股份有限公司),綠原酸(分析純,純度≥99%,批號(hào)PS08072303,成都普思生物科技股份有限公司)。

1.3 樣品 20批香榧種子采自貴州省遵義市務(wù)川縣石朝鄉(xiāng),經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室張建永教授鑒定為紅豆杉科榧樹屬榧樹TorreyagrandisFort.的種子,具體樣品信息見表1。

表1 樣品產(chǎn)地匯總情況

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 香榧種子干燥后粉碎,稱取香榧種子粉末1.0 g于錐形瓶?jī)?nèi),加入20%乙醇30 mL,稱重,充分振搖,超聲60 min(40 kHz,180 W),待其冷卻至室溫,再次稱重,以20%乙醇補(bǔ)足損失的重量,充分振搖,過0.22 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液,備用。

2.2 色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);乙腈(A)-0.06%醋酸-水溶液(B)為流動(dòng)相;梯度洗脫,洗脫程序見表2;在280 nm處檢測(cè);流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量15 μL。

表2 HPLC梯度洗脫程序

2.3 黔產(chǎn)香榧種子的指紋圖譜研究

2.3.1 黔產(chǎn)香榧種子指紋圖譜的方法學(xué)考察

2.3.1.1 儀器精密度的考察 取香榧種子供試品溶液,按上述色譜條件進(jìn)樣6次,記錄5個(gè)共有峰的保留時(shí)間和峰面積,并分別計(jì)算它們的RSD 值,考察色譜峰相似度的一致性。應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版本),評(píng)價(jià)其相似度。結(jié)果6次測(cè)定的5個(gè)共有峰保留時(shí)間的RSD值不超過1.35%,各色譜峰峰面積的RSD值不超過3.72%,相似度為1.000,儀器精密度良好。

2.3.1.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份同一批次的香榧種子粉末,以相同的方法制得供試品溶液,在同樣的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣,記錄5個(gè)共有峰的保留時(shí)間和峰面積,并分別計(jì)算RSD 值,考察色譜峰相似度的一致性。應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng),評(píng)價(jià)其相似度。結(jié)果6次測(cè)定的5個(gè)共有峰的保留時(shí)間的RSD值不超過1.35%,各色譜峰峰面積的RSD值不超過2.82%,相似度達(dá)到1.000,表明方法重復(fù)性良好。

2.3.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取一份香榧種子粉末按“2.1”項(xiàng)下制備供試品溶液,分別在0、4、8、12、16、20、24 h連續(xù)進(jìn)樣7次,記錄5個(gè)共有峰的保留時(shí)間和峰面積,并分別計(jì)算RSD 值,考察色譜峰相似度的一致性。應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng),評(píng)價(jià)其相似度。結(jié)果5個(gè)共有峰保留時(shí)間的RSD值不大于2.61%,各色譜峰峰面積的RSD值不超過2.67%,相似度達(dá)到1.000,表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.2 黔產(chǎn)香榧種子HPLC指紋圖譜的建立 稱取不同批次的黔產(chǎn)香榧種子粉末,依照上述方法制備供試品溶液,按色譜條件進(jìn)樣分析。最后有5個(gè)特征峰被選出(這5個(gè)共有色譜峰峰面積之和大于總峰面積的92.05%,符合建立指紋圖譜的技術(shù)要求),S1為對(duì)照?qǐng)D譜,時(shí)間窗寬度是0.1,得到20批黔產(chǎn)香榧種子樣品重疊的HPLC指紋圖譜,如圖1～2。

峰3為沒食子酸;峰5為綠原酸。圖1 對(duì)照指紋圖譜

圖2 20批黔產(chǎn)香榧種子的HPLC指紋圖譜

2.3.3 黔產(chǎn)香榧種子HPLC指紋圖譜相似度的評(píng)價(jià) 應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版本),用中位數(shù)矢量法計(jì)算20批黔產(chǎn)香榧種子的指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度,計(jì)算得到20批香榧種子相似度為0.983～1.000,結(jié)果見表3,顯示相似度良好。

表3 20批黔產(chǎn)香榧種子樣品指紋圖譜相似度的結(jié)果

2.4 香榧種子中2種化學(xué)成分的含量測(cè)定 與對(duì)照品色譜圖進(jìn)行比對(duì)后,定性了黔產(chǎn)香榧種子中可能存在沒食子酸與綠原酸,本部分對(duì)黔產(chǎn)香榧種子中的這2種成分進(jìn)行定量分析。

2.4.1 溶液配制 單一對(duì)照品溶液配制:分別精密稱量適量沒食子酸和綠原酸于2個(gè)25 mL容量瓶?jī)?nèi),以20%乙醇定容,充分振搖,得到單一對(duì)照品貯備液,其濃度分別是0.380 mg/mL和0.312 mg/mL,過0.22 μm微孔濾膜,備用。

混合對(duì)照品溶液①的配制:取2個(gè)單一對(duì)照品溶液各2.0 mL于試管中,揮干溶劑,加入2.0 mL 20%乙醇定容,充分振搖,即得混合對(duì)照品溶液①,過0.22 μm微孔濾膜,備用。

混合對(duì)照品溶液②的配制:取2個(gè)單一對(duì)照品溶液各2.5 mL于5 mL容量瓶中,充分振搖得混合對(duì)照品溶液②,過0.22 μm微孔濾膜,備用。

供試品溶液配制:同“2.1”項(xiàng)下方法。

2.4.2 HPLC色譜條件 同“2.2”項(xiàng)。

2.4.3 專屬性考察 分別將空白溶劑(20%乙醇)、兩種單一對(duì)照品溶液、混合對(duì)照品溶液②、供試品溶液按色譜條件進(jìn)樣。圖3中,黔產(chǎn)香榧種子供試品溶液所測(cè)成分沒食子酸(280 nm、4.752 min)和綠原酸(280 nm、12.917 min)色譜峰的保留時(shí)間與對(duì)照品溶液中色譜峰保留時(shí)間一致,溶劑與其余成分對(duì)測(cè)定均無干擾?？梢妼傩粤己?。

A:空白溶劑(20%乙醇);B:沒食子酸;C:綠原酸;D:混合對(duì)照品溶液②;E:供試品溶液;1:沒食子酸;2:綠原酸。圖3 測(cè)試樣品的HPLC(280 nm)

2.4.4 線性關(guān)系的考察 將混合對(duì)照品溶液①按一定比例稀釋,按上述色譜條件進(jìn)樣。濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算其回歸方程和線性范圍等,結(jié)果如表4,表明沒食子酸和綠原酸的對(duì)照品溶液在各自濃度范圍里有良好的線性關(guān)系,(S/N>10)。

表4 2種對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.5 精密度考察 取混合對(duì)照品溶液②,在同樣的色譜條件下進(jìn)樣6次,分別計(jì)算2個(gè)對(duì)照品色譜峰的保留時(shí)間和峰面積的RSD值。沒食子酸、綠原酸保留時(shí)間的RSD值分別為0.72%和0.56%;峰面積的RSD值分別為0.29%和0.25%,表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次黔產(chǎn)香榧種子,依照上述方法制備供試品溶液,在“2.2”項(xiàng)色譜條件下,在0、4、8、12、16、20、24 h不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣,分別計(jì)算2個(gè)對(duì)照品色譜峰的保留時(shí)間和峰面積的RSD值。沒食子酸、綠原酸保留時(shí)間的RSD值分別是2.61%和1.25%;峰面積的RSD值分別是4.69%和0.37%。樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.7 重復(fù)性考察 取同一批次黔產(chǎn)香榧種子粉末6份,依照上述方法制得供試品溶液,在同樣的色譜條件下進(jìn)樣,分別計(jì)算2個(gè)對(duì)照品色譜峰的保留時(shí)間和峰面積的RSD值。結(jié)果沒食子酸、綠原酸保留時(shí)間的RSD值分別是2.56%和1.55%;其含量的RSD值分別是1.49%和0.84%。從結(jié)果可以看出該方法的重復(fù)性良好。

2.4.8 加樣回收率的試驗(yàn) 稱取9份已知含量的黔產(chǎn)香榧種子粉末,每份為0.5 g,依次按照80%、100%、120%的比例分別精密加入對(duì)應(yīng)體積的2種單一對(duì)照品溶液,按“2.1”項(xiàng)下制備供試品溶液,在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,記錄2種化學(xué)成分對(duì)應(yīng)的色譜峰峰面積,計(jì)算其加樣回收率。沒食子酸和綠原酸的平均回收率在97.75%～98.82%,符合95%～105%的范圍,RSD≤1.62%,符合要求,由此可見該方法的加樣回收率良好(表5)。

表5 黔產(chǎn)香榧種子中2種成分加樣回收率的結(jié)果

2.4.9 20批香榧種子樣品中2種成分的含量測(cè)定結(jié)果 取20批香榧種子樣品,依照上述方法制備供試品溶液,按色譜條件逐個(gè)進(jìn)樣,分別將沒食子酸和綠原酸的峰面積代入線性回歸方程,計(jì)算其含量(表6)。其中,沒食子酸和綠原酸含量最高的分別是S15(貴州省遵義市務(wù)川縣石朝鄉(xiāng)高峰村)和S8(貴州省遵義市務(wù)川縣石朝鄉(xiāng)浪水村)。該2種化學(xué)成分總含量最高的為S9(貴州省遵義市務(wù)川縣石朝鄉(xiāng)浪水村)。

表6 20批香榧種子中2類成分含量(μg/g)

2.4.10 聚類分析 應(yīng)用Simca-P 14.1軟件,共有峰峰面積為變量,展開系統(tǒng)聚類分析(HCA),結(jié)果如圖4。20批香榧種子樣品被分為2類:Ⅰ類包括S14～S16號(hào)樣品,此類樣品均產(chǎn)自遵義市高峰村;Ⅱ類包括S6、S8和S9號(hào)樣品,此類樣品均產(chǎn)自遵義市浪水村;Ⅲ類包括S1～S5、S7、S10～S13和S17～S20號(hào)樣品,其中S1～S5號(hào)樣品產(chǎn)自遵義市大漆村,S7號(hào)樣品產(chǎn)自遵義市浪水村,S10～S13號(hào)樣品產(chǎn)自遵義市京竹村,S17～S20號(hào)樣品產(chǎn)自遵義市沙坂村。Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ樣品表明不同村子之間的樣品存在一定差異。

Ⅰ類:S14～S16號(hào)樣品;Ⅱ類:S6、S8和S9號(hào)樣品;Ⅲ類:S1～S5、S7、S10～S13和S17～S20號(hào)樣品。圖4 3類樣品聚類分析情況

3 討論

3.1 方法的建立

3.1.1 色譜柱和流動(dòng)相考察 考察了2種色譜柱類型:Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)和Agilent Eclipse XDB C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),結(jié)果表明,Agilent Eclipse Plus C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)的柱效更好。并且考察了不同的流動(dòng)相體系:甲醇-水、乙腈-水、甲醇-醋酸水和乙腈-醋酸水等。結(jié)果使用乙腈-0.06%醋酸水為流動(dòng)相體系時(shí),色譜出峰時(shí)間最佳,特征峰分離度可達(dá)到要求,色譜圖基線較平穩(wěn),色譜峰有較好的對(duì)稱性。

3.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 采用HPLC-DAD對(duì)各對(duì)照品以及香榧種子供試品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。沒食子酸和綠原酸的紫外最大吸收波長(zhǎng)分別是270 nm和330 nm。但香榧種子在330 nm處無峰,而綠原酸在265 nm左右吸光度最低。在280 nm時(shí),香榧種子中沒食子酸和綠原酸對(duì)應(yīng)色譜峰的峰面積都高于270 nm時(shí)其二者的峰面積。參考各對(duì)照品的紫外光譜圖以及香榧種子色譜圖,最終決定以280 nm作為沒食子酸和綠原酸的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.1.3 黔產(chǎn)香榧種子樣品處理方法考察 其他條件相同時(shí),本實(shí)驗(yàn)分別考察了5%、10%、20%、40%、70%、100%乙醇提取香榧種子的效果,對(duì)比特征峰峰形和峰面積選擇最優(yōu)提取溶劑百分比。再以20%甲醇同法操作,測(cè)得結(jié)果和20%乙醇的結(jié)果相比較。最終確定當(dāng)提取溶劑為20%乙醇時(shí),樣品峰形較好,2個(gè)對(duì)照品對(duì)應(yīng)色譜峰峰總面積最大。

其他條件相同時(shí),實(shí)驗(yàn)中分別考察了超聲30、60、90 min提取香榧種子的效果,發(fā)現(xiàn)提取60 min時(shí)香榧種子的2個(gè)對(duì)照品對(duì)應(yīng)的峰總面積最大,因此選擇提取60 min。

其他條件相同時(shí),實(shí)驗(yàn)分別考察了采用超聲、冷浸和水浴回流提取香榧種子的效果,發(fā)現(xiàn)超聲提取香榧種子時(shí),香榧種子的2個(gè)對(duì)照品對(duì)應(yīng)的峰總面積最大。因此,本研究選擇超聲方式提取香榧種子。

在保證其余條件一樣的情況下,實(shí)驗(yàn)考察了料液比1∶10,1∶20,1∶30,1∶40時(shí)的香榧種子提取效果,發(fā)現(xiàn)料液比1∶30時(shí)2個(gè)對(duì)照品的總含量最高。

香榧種子樣品處理方法最終篩選結(jié)果為:以20%乙醇提取香榧種子,料液比為1∶30,超聲60 min。

3.2 黔產(chǎn)香榧種子質(zhì)量分析 本實(shí)驗(yàn)的20批香榧種子樣品采自貴州省遵義市務(wù)川縣石朝鄉(xiāng)的5個(gè)不同村子,樣品批次多,具有一定的代表性。測(cè)定結(jié)果表明,20批不同村子香榧種子指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜相似度為0.983～1.000,相似度均較高,表明引種后,貴州省遵義市務(wù)川縣石朝鄉(xiāng)樣品之間的指紋圖譜具有較好的一致性。20批香榧種子的沒食子酸和綠原酸含量分別為 33.25～97.00 μg/g和1 072.28～1 279.56 μg/g。不同村子香榧種子中2種成分含量有一定差異,2種成分總含量平均值為1 231.92 μg/g,總含量最高的為浪水村的S9(1 327.88 μg/g),總含量最低的為沙坂村的S17(1 157.39 μg/g),采自浪水村的S6、S8和S9總含量排進(jìn)前四位。香榧種子中化學(xué)成分總含量的村子排序規(guī)律與前期研究中假種皮規(guī)律相反,這可能與香榧的生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)建立了黔產(chǎn)香榧種子的指紋圖譜,建立了同時(shí)測(cè)定香榧種子中的沒食子酸與綠原酸2種化學(xué)成分含量的HPLC分析方法,為黔產(chǎn)香榧種子的品質(zhì)評(píng)價(jià)及資源利用提供科學(xué)依據(jù)。更多具有藥理活性的化學(xué)成分有待進(jìn)一步研究。