張春鋒，李長建，劉沛，吳春磊

（1．新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，衛(wèi)輝 453100；2．新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院泌尿外科，新鄉(xiāng) 453000）

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC）在全世界范圍內(nèi)每年導(dǎo)致超過330 000 例被診斷的病例與大約140 000 例死亡病例，并且近數(shù)十年來，其發(fā)生率一直在不斷增加。僅僅是在2018 年，全美新確診的腎臟癌癥患者就超過65 340 人，而與腎癌有關(guān)的死亡人數(shù)也達(dá)到了14 970 人[1]。在腎細(xì)胞癌的患者中，男性患者的數(shù)量是女性的1．5～2．0 倍，而高發(fā)年齡范圍是60～70 歲[2]。腎透明細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是腎細(xì)胞癌中最常見的一種亞型，占到了75%～80%[3]。早期ccRCC 的治愈率高，5年以上生存率達(dá)90%以上[4]。與此相反，晚期遠(yuǎn)處移患者的5 年生存率則下降到了12%[5]。但是，近幾年來，隨著研究的不斷深入和認(rèn)知水平的提高，人們對該疾病的治療近年來取得了重大進(jìn)展。

Kinesin 家族蛋白是基于微管的馬達(dá)蛋白家族。Aiken 等[6]首次報道了巨烏賊軸突中的Kinesin 家族蛋白。隨后，在不同的生物組織中均發(fā)現(xiàn)kinesin 蛋白，如哺乳動物神經(jīng)細(xì)胞、海膽卵和果蠅細(xì)胞[7－8]。Kinesin 家族成員22（Kinesin family member 22，KIF22）能夠與微管和染色體結(jié)合，從而運(yùn)輸細(xì)胞器、蛋白質(zhì)和mRNA[8]。KIF22 蛋白已被報道影響多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，如乳腺癌、肺癌、前列腺癌等，并與這些腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)[9－14]。然而，針對ccRCC 而言，KIF22 在其中的表達(dá)水平和作用仍有待進(jìn)一步研究。本研究主要探究ccRCC 組織中KIF22 蛋白的表達(dá)，從而為在ccRCC 的治療尋找新的靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 生信分析 應(yīng)用GEPIA 在線數(shù)據(jù)庫和pro teinatlas 在線數(shù)據(jù)庫提取KIF22 在不同器官癌癥組織中的表達(dá)（http：//gepia．cancer－pku．cn/detail．php?gene=KIF22；https：//www．proteinatlas．org/EN SG00000079616－KIF22/pathology），并對其生物信息進(jìn)行分析。利用這些數(shù)據(jù)庫信息分析ccRCC 的表達(dá)差異以及這種表達(dá)差異與疾病預(yù)后的關(guān)系，并利用Kaplan－Meier 曲線比較生存期。

1.2 組織收集 為了探索KIF22 與ccRCC 發(fā)生、發(fā)展之間的潛在關(guān)系，本研究從接受手術(shù)治療的患者中收集了77 例ccRCC 組織及其對應(yīng)的癌旁組織。本研究收集我院從2012 年1 月—2018 年12 月的ccRCC 手術(shù)患者的腫瘤組織和癌旁組織。這些標(biāo)本的來源中有男性44 例，女性33 例，年齡40～74 歲，平均52．6 歲，其中腫瘤病理高中分化40例，低分化37 例。選擇診斷為ccRCC，無全身廣泛遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，并無手術(shù)切除禁忌且有手術(shù)切除適應(yīng)癥的患者，術(shù)后均經(jīng)病理證實(shí)為ccRCC。排除標(biāo)準(zhǔn)：有病理證實(shí)并非ccRCC 或存在第2 種原發(fā)腫瘤或存在全身廣泛轉(zhuǎn)移或全身情況存在手術(shù)切除禁忌等。

1.3 免疫組化實(shí)驗(yàn) 將腫瘤組織用10%的中性緩沖福爾馬林固定24 h 后進(jìn)行石蠟包埋，之后將石蠟包埋的組織切片在75℃加熱30 min 后用二甲苯溶液浸泡10 min，再放入100%、95%、85%和75%乙醇中各5 min。隨后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)檢測方法主要根據(jù)免疫組織化學(xué)檢測規(guī)范（Cell Signaling Technology，Danvers，Massachusetts，USA）。將切片標(biāo)本在PBS 緩沖液中洗滌2 次，每次2 min，在檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)并用3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶后，將切片用2%牛絲氨酸白蛋白在PBS 中浸泡20 min，并與抗KIF22 抗體（thermo fisher scientific，Waltham，MA，USA，1∶200）一起孵化，在4℃環(huán)境下過夜。

次日，將切片室溫放置1 h，用PBS 緩沖液洗滌2 次，每次2 min。室溫下辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（Sanying，China，1∶1 000）孵育1 h，用二氨基苯胺（DAB，Cell Signaling Technology，Pudong，Shanghai，China）洗滌染色5 min，最后用中性樹膠封片后在顯微鏡（Nikon，Tokyo，Japan）下觀察。

本研究進(jìn)一步根據(jù)染色面積和染色強(qiáng)度對KIF22 表達(dá)進(jìn)行評分。無顏色為0 分，淺黃色為1分，棕色為2 分，深棕色為3 分。每個視野下0 分是陰性，1～4 分是弱陽性，5～8 分是陽性，9～12 分是強(qiáng)陽性。在本研究中，本研究將KIF22 的陽性表達(dá)分為低表達(dá)（陰性和弱陽性）和高表達(dá)（陽性和強(qiáng)陽性）。結(jié)果用雙盲法判斷。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 22．0 軟件（SPSS Inc，IBM Corp，Armonk，NY）進(jìn)行分析，并通過χ2檢驗(yàn)比較臨床特征與蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KIF22 在多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)研究顯示，KIF22 在不同的腫瘤組織中的表達(dá)上調(diào)，且與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。本研究利用proteinatlas 數(shù)據(jù)庫和GEPIA 在線數(shù)據(jù)庫對來自不同組織器官的腫瘤細(xì)胞中的KIF22 表達(dá)情況進(jìn)行研究。

在proteinatlas 數(shù)據(jù)庫之中，本研究選取了包括腎癌在內(nèi)的17 種不同類型的腫瘤加入到了此次生物信息學(xué)分析之中，根據(jù)腫瘤基因組ALTAS（TCGA）的數(shù)據(jù)庫分析其中KIF22 基因的RNA 表達(dá)。結(jié)果顯示，KIF22 基因的RNA 表達(dá)水平出現(xiàn)明顯較高者，且RNA 表達(dá)的特異性較低（圖1）。

圖1 KIF22 基因的RNA 表達(dá)在多種癌細(xì)胞中呈低特異性Fig 1 The RNA expression of KIF22 gene shows low specificity in a variety of cancer cells

而在GEPIA 數(shù)據(jù)庫中，本研究選取包括腎癌在內(nèi)的20 種腫瘤結(jié)果顯示有大部分腫瘤細(xì)胞KIF22表達(dá)水平較高。在甲狀腺癌、結(jié)腸癌和頭頸部腫瘤的腫瘤細(xì)胞中，KIF22 表達(dá)較高。然而，在淋巴瘤、子宮內(nèi)膜癌與肺癌等中KIF22 表達(dá)較低，皮膚癌中KIF22 不表達(dá)。腎癌中KIF22 的表達(dá)水平不高，但依然具有一定的提示價值（圖2）。

圖2 KIF22 基因在不同腫瘤組織中的表達(dá)上調(diào)Fig 2 The expression of KIF22 gene was up-regulated in different tumor tissues

2.2 KIF22 的表達(dá)與ccRCC 患者不良預(yù)后相關(guān) 本研究利用GEPIA 數(shù)據(jù)庫對KIF22 與ccRCC 患者預(yù)后進(jìn)行了Kaplan-Meier 生存分析，發(fā)現(xiàn)KIF22 的表達(dá)水平與患者的預(yù)后不良相關(guān)。在研究KIF22 高表達(dá)患者的疾病總生存期時，選擇GEPIA數(shù)據(jù)庫516 例患者，高表達(dá)與低表達(dá)患者各258 例，研究結(jié)果顯示KIF22 高表達(dá)的患者總生存期低于低表達(dá)的患者（P=0．012，圖3）。而在研究無病生存期時，收錄的患者數(shù)為517 例，高表達(dá)患者52 例，低表達(dá)患者465例，結(jié)果為KIF22 高表達(dá)患者的無病生存期顯著低于KIF22 低表達(dá)的患者（P=0.047，圖3）。

圖3 KIF22高表達(dá)及低表達(dá)患者的疾病總生存期和無進(jìn)展生存期比較Fig 3 Overall disease survival and disease free survival in patients with high and low expression of KIF22

2.3 KIF22 在ccRCC 中高表達(dá) 本研究首先通過對ccRCC 腫瘤樣本中的KIF22 進(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)KIF22 主要位于ccRCC 組織的細(xì)胞核中（圖4A）。而根據(jù)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與腫瘤組織相比，KIF22在癌旁組織中的表達(dá)較低（圖4B）。

圖4 免疫組化檢測KIF22 在ccRCC 患者腫瘤樣本中的表達(dá)水平Fig 4 The expression level of KIF22 in tumor samples of renal clear cell carcinoma was determined by immunohistochemistry

2.4 KIF22 的表達(dá)與ccRCC 患者的臨床特征相關(guān)性 本研究進(jìn)一步對于KIF22 的染色強(qiáng)度進(jìn)行評分，并由此分析了KIF22 高、低表達(dá)患者的臨床病理特征差異。數(shù)據(jù)顯示，ccRCC 中KIF22 的表達(dá)與ccRCC 腫瘤直徑（P=0.010）具有顯著相關(guān)性，但KIF22 的表達(dá)與其他臨床特征，如患者年齡、性別、腫瘤分化程度等特征無顯著相關(guān)性（表1）。

表1 77 例ccRCC 患者的KIF22 表達(dá)和臨床病理特征的關(guān)系Tab 1 Correlation between KIF22 expression and clinicopathologic features in 77 patients with renal clear cell carcinoma

3 討論

目前ccRCC 的治療主要以手術(shù)為主。盡管醫(yī)學(xué)技術(shù)在不斷提高，但其實(shí)總體治療效果仍不盡如人意。行根治性腎切除術(shù)的患者仍有30%～40%復(fù)發(fā)[15]。且雖然無轉(zhuǎn)移患者的5 年生存率可較高，但有轉(zhuǎn)移的晚期患者的預(yù)后明顯較差[4-5]。這一結(jié)果的部分原因是缺乏可用的治療靶點(diǎn)。因此，ccRCC 靶向化療藥物的選擇非常重要。

此前廣泛的研究證明，KIF22 是一種馬達(dá)蛋白，能夠調(diào)控多種重要的細(xì)胞過程，如細(xì)胞分裂、細(xì)胞遷移中的物質(zhì)運(yùn)輸與重新分布、纖毛發(fā)生等[16]。這種馬達(dá)蛋白基于微管的功能可能直接對于腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲等產(chǎn)生重要影響。也有報道證實(shí)KIF22 可對多種信號通路產(chǎn)生影響，比如其受SIAH-1 調(diào)控[13]。另外，KIF22 與微管結(jié)合，而微管在受體轉(zhuǎn)運(yùn)中起重要作用，這些受體即包括EGFR[17-18]。KIF22 調(diào)控微管穩(wěn)定性，上調(diào)EGFR 信號通路，刺激細(xì)胞分裂，進(jìn)一步對腫瘤細(xì)胞的異常增殖產(chǎn)生影響[19]。而且此前文獻(xiàn)報道，KIF22 還能夠參與紡錘體的形成及有絲分裂過程中的染色體運(yùn)動，這暗示其可能也會通過影響ccRCC 細(xì)胞分裂而影響其發(fā)展。

研究顯示，KIF22 參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[13]。在Yu 等[9]的報道中提及，抑制KIF22 能夠抑制腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，進(jìn)而使得腫瘤細(xì)胞的增殖能力降低。他們同時發(fā)現(xiàn)KIF22 在多種腫瘤組織中均有高表達(dá)。為了進(jìn)一步研究KIF22 與腫瘤發(fā)生的關(guān)系，他們在癌基因數(shù)據(jù)庫中分析幾種腫瘤中的KIF22表達(dá)，證實(shí)KIF22 在卵巢癌、肺癌和宮頸癌中有高表達(dá)[9]。Zhang 等[14]檢測62 個原發(fā)性乳腺癌組織和成對鄰近正常組織中KIF22 表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與鄰近組織相比，腫瘤組織KIF22 的表達(dá)均顯著上調(diào)。而本研究同樣發(fā)現(xiàn)KIF22 在多種腫瘤中出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)的情況，且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)上調(diào)與ccRCC 患者的不良預(yù)后有關(guān)，提示KIF22 可能參與了ccRCC 的發(fā)生和發(fā)展，也提示KIF22 可以作為ccRCC 新的治療靶點(diǎn)。

在生信分析中本研究發(fā)現(xiàn)了KIF22 在ccRCC中的高表達(dá)，KIF22 與ccRCC 患者的預(yù)后相關(guān)。而在接下來的研究中，本研究收集了77 個ccRCC 組織和鄰近正常組織標(biāo)本檢測KIF22 的表達(dá)水平，其結(jié)果為KIF22 在ccRCC 組織中高表達(dá)。之后，本研究又通過結(jié)合患者臨床信息分析腫瘤組織中KIF22的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)KIF22 的表達(dá)水平與ccRCC 腫瘤組織直徑存在一定聯(lián)系。先前Liu 等[20]的研究也報道，KIF22 在腫瘤的生長中發(fā)揮了重要作用。Pike 等[19]研究表明，KIF22 的下調(diào)會顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，從而進(jìn)一步抑制相關(guān)腫瘤的發(fā)展。而本研究的研究數(shù)據(jù)表明，KIF22 參與了ccRCC 的發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控過程。

綜上所述，本研究主要發(fā)現(xiàn)了KIF22 在ccRCC細(xì)胞中顯著高表達(dá)，并與患者的不良預(yù)后緊密相關(guān)。KIF22 與腫瘤直徑、患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)。所以，KIF22 基因可能在ccRCC 的發(fā)生、發(fā)展中起到了不可忽略的作用。

然而，本研究中存在了一定的局限。首先，本研究預(yù)后分析使用的數(shù)據(jù)庫為公共數(shù)據(jù)庫，而非本研究單位組建。其次，本研究的實(shí)驗(yàn)樣本較少，缺乏多中心大樣本研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。再次，本研究在KIF22 的作用機(jī)制上研究較淺，在ccRCC 中的表達(dá)水平和作用仍有待進(jìn)一步研究。