譚智勇 諶瀟雄 李亞娟 劉賀賀 楊文明 盧志宏

（1. 銅仁學(xué)院 貴州銅仁 554300；2. 貴州財經(jīng)大學(xué)，貴州貴陽 550025；3. 銅仁市農(nóng)業(yè)科教信息站貴州銅仁 554300；4. 銅仁市農(nóng)業(yè)科技園區(qū)管理中心 貴州銅仁 554399；5. 貴州梵天農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司 貴州銅仁 554400）

層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）屬絲孢綱（Hyphomycetes）瘤座孢科（Tuberculariaceae）鐮孢屬（Fusarium）菌種[1]，是主要的植物病原菌，可侵染小麥、玉米、水稻、洋蔥、大蒜、芒果、松樹等多種植物，引起植物葉腐、莖腐、根腐等癥狀[2-3]。目前，生產(chǎn)上對于植物病害的防治以化學(xué)防治為主，存在農(nóng)藥殘留、容易產(chǎn)生抗藥性、環(huán)境污染等問題[4-5]。

植物源農(nóng)藥是來源于植物體的農(nóng)藥，具有環(huán)境友好、對非靶標生物安全、不易產(chǎn)生抗藥性、促進作物生長并提高其抗病性等特點。關(guān)于植物源農(nóng)藥的研究也已成為近些年的熱點課題[6-9]。國內(nèi)外關(guān)于植物源農(nóng)藥對層出鐮刀菌抑制作用的研究報道較少。本文擬篩選出對層出鐮刀菌有抑制效果的植物，為其植物源農(nóng)藥研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)王樹桐教授惠贈。

1.1.2 藥用植物材料15 種藥用植物（表1）采購于貴州省銅仁市碧江區(qū)大健康產(chǎn)業(yè)園，植物材料粉碎后過20 目篩，將制成的藥用植物粉末置于陰涼干燥處密封保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 中藥材名稱及部位

1.2 方法

1.2.1 藥用植物水提物篩選（1）藥用植物水提物制備 稱取20 g 藥用植物粉末加入400 g 的無菌水，在30 ℃搖床振蕩24 h，抽濾后收集上清液，75 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用無菌水定容至50 mL，制成藥用植物的水提物母液，濃度為0.4 g 干樣/mL（即每1 mL 提取物中含0.4 g 植物干物質(zhì)），保存于4 ℃下備用[7]。

（2）含提取物PDA 培養(yǎng)基的制備 在無菌條件下將藥用植物水提物與已滅菌并冷卻至50 ℃的PDA 培養(yǎng)基混合均勻，制成藥用植物水提物的含藥培養(yǎng)基（培養(yǎng)基中藥用植物水提物濃度為20 mg 干樣/mL）[7]。

（3）藥用植物提取物對層出鐮刀菌的抑制活性測定 采用菌絲生長速率法[10]測定藥用植物水提物對供試菌菌落生長的抑制作用，將培養(yǎng)皿置于25 ℃恒溫培養(yǎng)，待對照（CK 為不添加藥物植物提取物的PDA 培養(yǎng)基）長滿培養(yǎng)皿后，用十字交叉法測量菌落直徑，計算方法見公式（1）。

1.2.2 藥用植物水提物對層出鐮刀菌的毒力測定選取對層出鐮刀菌抑制效果最為顯著的藥用植物水提物，將其稀釋為 40.0、20.0、10.0、5.0、2.5 mg/mL 的質(zhì)量濃度，轉(zhuǎn)接菌餅培養(yǎng)7 d 后，按公式（1）計算藥物對菌落生長抑制率。

毒力計算[11]：以提取物不同質(zhì)量濃度的對數(shù)值（x）和菌落生長抑制率的機率值（y）求取毒力回歸方程y=a+bx，并計算EC50值。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析各指標測定均重復(fù)3 次，用SPSS 19 進行方差分析和多重比較（LSD 法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 層出鐮刀菌藥用植物水提物篩選

采用生長速率法測定了15 種藥用植物水提物對層出鐮刀菌菌絲生長的影響（表2）。由表2可知：黃連等15 種藥用植物提取物對層出鐮刀菌菌絲生長有一定的抑制作用，當藥用植物水提物濃度為20 mg 干樣/mL 時，黃連水提物的抑制相對較好，抑制率為77.17%。蘆薈、大黃、薄荷、丁香、甘草、苦參、馬鞭草、黃精、黃柏、馬齒莧、當歸、五加皮、銀杏、蒼術(shù)的抑菌率在0.24%～37.08%。

表2 藥用植物水提物對菌絲生長的抑制效果

2.2 藥用植物水提物對層出鐮刀菌的毒力測定

選取15 藥用植物水提物中抑菌率最好的黃連水提物開展其對層出鐮刀菌的毒力測定試驗。由圖1 可見，黃連水提物濃度在2.5～40 mg/mL 時，均對層出鐮刀菌菌絲生長產(chǎn)生抑制作用，抑制作用隨著濃度的增加而增加。黃連水提物對層出鐮刀菌的毒力回歸方程為y=1.056x+4.581 5，決定系數(shù)R2為0.907 5，回歸方程擬合度較高，EC50值為1.063 0 mg 干樣/mL。

圖1 不同濃度黃連水提物對層出鐮刀菌抑制培養(yǎng)

3 討論與結(jié)論

對于層出鐮刀菌的藥物篩選多集中在化學(xué)農(nóng)藥上，敬雪敏等[12]發(fā)現(xiàn)，多菌靈等4 種化學(xué)藥劑500 倍液均對層出鐮刀菌有一定的抑制效果，其中甲基托布津抑制效果最好。本文首次報道了黃連等15 種藥用植物對層出鐮刀菌的抑制效果，結(jié)果表明，黃連等15 種藥用植物提取物對層出鐮刀菌菌絲生長有一定的抑制作用，當水提物濃度為20 mg 干樣/mL 時，藥用植物水提物抑菌率在0.24%～77.17%，其中以黃連的抑制效果最佳，其抑制作用隨著黃連水提物濃度的增加而增加，黃連水提物對層出鐮刀菌的毒力回歸方程的EC50值為1.063 0 mg 干樣/mL。

黃連為毛茛科（Ranunculaceae）黃連屬（Coptis）多年生草本植物，以根莖入藥，具有廣泛抗菌、抗病毒作用[13-16]。本研究結(jié)果表明，黃連對層出鐮刀菌有較好的抑制效果，但其對病原菌的作用方式、作用機理、活性成分等方面還需要進一步明確，為其植物源農(nóng)藥研發(fā)提供理論依據(jù)。