董亞尊，柳凱月，陳晶，吳雙雙，馬金柱

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

在現(xiàn)代醫(yī)療中，由于藥物自身的性質(zhì)不夠穩(wěn)定，進(jìn)入機(jī)體后它們?cè)谘褐邪胨テ谳^短，血藥濃度易出現(xiàn)峰谷現(xiàn)象[1]，從而導(dǎo)致治療效果不夠理想，通常需要多次用藥才能治愈，造成了大量的醫(yī)藥資源浪費(fèi)。通過(guò)改變藥物的劑型設(shè)計(jì)可以在一定程度上緩解這種現(xiàn)象，常見(jiàn)的膠囊和片劑用藥效果依舊不夠理想，因此近年來(lái)新開(kāi)發(fā)出了多種藥物載體，包括脂質(zhì)體、合成聚合物膠束、凝膠、磁性納米顆粒、微球和微囊等用于疾病的診斷和治療[2-3]，然而脂質(zhì)體載體的穩(wěn)定性太差，其他載體構(gòu)建的成本太高或者是載藥量太低，亦或是對(duì)于疏水性藥物的緩釋不可控[4]，也有一些材料因其本身的毒性和不可降解性也限制了它們作為藥物載體的應(yīng)用。

理想的載體應(yīng)該是安全、穩(wěn)定、高效、有良好的靶向性和生物利用度的[5]，PLGA 作為一種可生物降解高分子材料，它在體內(nèi)經(jīng)過(guò)水解產(chǎn)生代謝物單體乳酸和乙醇酸，這兩種單體均是內(nèi)源性的，很容易通過(guò)三羧酸循環(huán)途徑被生物體代謝，將其用于藥物載體系統(tǒng)毒性非常小[6]，已被美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于人類(lèi)治療，因此在納米藥物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域大放光彩。除此之外，PLGA 的生物降解速率是可控的，它主要是取決于其結(jié)構(gòu)中的乙交酯與丙交酯的單體數(shù)目比例，乙交酯的單體比例越低，PLGA 的降解時(shí)間就越長(zhǎng)，反之亦然[7]。使用PLGA 包封藥物，可以防止藥物經(jīng)過(guò)消化道時(shí)被降解[8]，使藥物能夠從腸道進(jìn)入血液，提高其體內(nèi)的生物利用度并延長(zhǎng)半衰期，進(jìn)而提高藥物吸收率[9-10]，非常適合藥物和生物大分子的持續(xù)細(xì)胞內(nèi)遞送[11]。

PLGA 用作載體的有效尺寸范圍為1 到1 000 nm[12]，在不同的制備條件下，PLGA 納米微球具有不同的粒徑、多分散指數(shù)和形態(tài)特征，這些特性是確保藥物穩(wěn)定性、包封性和充分釋放的基礎(chǔ)[13]。因此，實(shí)驗(yàn)對(duì)PLGA納米微球的制備條件進(jìn)行了優(yōu)化，以便獲得理想的納米微球，為微球載體后續(xù)的深入應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

聚乳酸羥基乙酸共聚物購(gòu)買(mǎi)自濟(jì)南岱罡生物工程有限公司，聚乙烯醇購(gòu)買(mǎi)自阿拉丁藥物試劑公司，二氯甲烷購(gòu)買(mǎi)自天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 PLGA 納米微球的制備方法

實(shí)驗(yàn)采用雙溶劑乳化法制備PLGA 納米微球，首先將120 mg PLGA 顆粒溶于6 mL 的二氯甲烷中，避光使其充分溶解。然后稱(chēng)量0.4 g PVA 干粉試劑倒入小燒杯并加入超純水，放入水浴鍋中在70 ℃下攪拌溶解，后定容至40 mL 后冷卻至室溫等待使用。隨后將PLGA 溶液在冰浴環(huán)境中放入細(xì)胞破碎儀，以30 W 功率4 s 超聲開(kāi)關(guān)間隔超聲乳化1 min。吸取初步乳化液2 mL 逐滴加入PVA 溶液中，將混合溶液以相同條件二次超聲乳化，之后將形成的微球懸液用磁力攪拌器以600 rpm·min-1過(guò)夜攪拌，使二氯甲烷充分揮發(fā)。第二天將微球懸液在4 000 g 條件下離心5 min，棄掉上清，重懸PLGA 納米微球進(jìn)行洗滌和離心，反復(fù)3 次，末次離心后用微量的超純水重懸PLGA 納米微球，在-70 ℃下冷凍2 h 后放入低溫干燥冷凍機(jī)中，經(jīng)過(guò)24 h 冷凍干燥后，收集PLGA 納米微球干粉進(jìn)行后續(xù)表征檢測(cè)，表征檢測(cè)包括粒徑大小、粒徑分布和zeta 電位等。

1.3 不同乳化劑濃度對(duì)PLGA 納米微球表征的影響

PLGA 納米微球的制備方與2.2 中相同，將乳化劑PVA 的濃度分別設(shè)置為1%、2%、3%、4%和5% 共5 個(gè)濃度梯度進(jìn)行單因素控制變量實(shí)驗(yàn)，探究不同的PVA 濃度對(duì)PLGA 納米微球的表征的影響。

1.4 不同超聲功率對(duì)PLGA 納米微球表征的影響

PLGA 納米微球的制備方與2.2 中相同，將超聲功率分別設(shè)置為30、45、60、75 和90 W 共5 個(gè)功率梯度進(jìn)行單因素控制變量實(shí)驗(yàn)，探究不同的超聲乳化功率對(duì)PLGA 納米微球的表征的影響。

1.5 不同超聲時(shí)間對(duì)PLGA 納米微球表征的影響

PLGA 納米微球的制備方與2.2 中相同，將超聲時(shí)間分別設(shè)置為1、2、3、4 和5 min 共5 個(gè)時(shí)間梯度進(jìn)行單因素控制變量實(shí)驗(yàn)，探究不同的超聲乳化時(shí)間對(duì)PLGA 納米微球的表征的影響。

1.6 優(yōu)化條件下的PLGA 納米微球制備

對(duì)微球制備的最優(yōu)乳化劑濃度、超聲時(shí)間和超聲功率進(jìn)行確定后，將各個(gè)最優(yōu)條件進(jìn)行匯總聯(lián)合，以此條件來(lái)制備PLGA 納米微球，并對(duì)微球進(jìn)行形態(tài)表征。

1.7 統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)均以平均值±SD 表示，并采用GraphPad Prism 8.0 進(jìn)行顯著性分析，其中“*”表示P＜0.05，“**”表示P＜0.01，“***”表示P＜0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳化劑濃度的確定

在不改變其他變量的條件下，分別用1%、2%、3%、4%和5%的PVA 濃度制備PLGA 納米微球，并依次對(duì)各組納米微球進(jìn)行形態(tài)表征，結(jié)果如圖1 所示，隨著PVA 濃度的增大，各組納米微球的平均粒徑和PDI 指數(shù)均呈現(xiàn)出先減小后增大的趨勢(shì)，且以2%的PVA 濃度制備出的PLGA 納米微球有最小的平均粒徑和PDI 指數(shù)，平均粒徑約為750 nm，PDI 指數(shù)約為0.19，與其余各組有顯著差異，表明這組微球的粒徑大小更為均一，形態(tài)分布上更加集中。再對(duì)比各組微球的zeta 電位，發(fā)現(xiàn)以5% PVA 濃度制備出的PLGA 納米微球zeta 電位絕對(duì)值最高，約為31.5，與其余各組有顯著差異。綜合比較上述結(jié)果，優(yōu)先考慮平均粒徑與PDI 指數(shù)的影響，確定了以2% PVA 濃度來(lái)制備PLGA 納米微球。

圖1 不同乳化劑濃度條件下制備出的PLGA 納米微球Fig.1 PLGA nanospheres prepared under different emulsifier concentrations

2.2 超聲功率的確定

在不改變其他變量的條件下，分別用30、45、60、75 和90 W 的超聲功率制備PLGA 納米微球，并對(duì)各組納米微球進(jìn)行形態(tài)表征，結(jié)果如圖2 所示，隨著超聲功率的增大，各組納米微球的平均粒徑和PDI 指數(shù)均呈現(xiàn)出先減小后增大的趨勢(shì)，以75 W 超聲功率條件下制備的納米微球平均粒徑更小，與其余各組有顯著差異，而60 W 微球組的平均粒徑要略小于45 W 微球組，但未呈現(xiàn)出差異性。對(duì)比分析各組微球的PDI 指數(shù)，以60 W 超聲功率制備出的PLGA 納米微球PDI 指數(shù)更低，約為0.263，表明該組微球的粒徑大小更為均一，形態(tài)分布上更加集中，與其余各組有顯著差異。最后分析zeta 電位的測(cè)定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)以45 W 超聲功率制備出的PLGA 納米微球zeta 電位絕對(duì)值最高，約為19.10，與其余各組有顯著差異。綜合比較上述結(jié)果，優(yōu)先考慮平均粒徑與PDI 指數(shù)的影響，確定了以60 W 超聲功率來(lái)制備PLGA 納米微球。

圖2 不同超聲功率條件下制備出的PLGA 納米微球Fig.2 PLGA nanospheres prepared under different ultrasonic power conditions

2.3 超聲時(shí)間的確定

在不改變其他變量的條件下，分別用1、2、3、4和5 min 的超聲時(shí)間制備PLGA 納米微球，并依次對(duì)各組納米微球進(jìn)行形態(tài)表征，結(jié)果如圖3 所示，隨著超聲時(shí)間的增加，納米微球的平均粒徑和PDI 指數(shù)呈現(xiàn)出先減小后增大的趨勢(shì)，且以4 min 超聲時(shí)間制備的納米微球有最小的平均粒徑和PDI 指數(shù)，平均粒徑約為441.5 nm，PDI 指數(shù)約為0.272，與其余各組有顯著差異，表明該組微球的粒徑大小更為均一，形態(tài)分布上更加集中。最后分析zeta 電位的測(cè)定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)各微球組的zeta 電位隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)為先降低后升高，其中以2 min 超聲時(shí)間制備出的PLGA 納米微球zeta 電位絕對(duì)值最高，約為22.03，與其余各組有顯著差異。綜合比較上述結(jié)果，優(yōu)先考慮平均粒徑與PDI 指數(shù)的影響，確定了以4 min 超聲時(shí)間來(lái)制備PLGA 納米微球。

圖3 不同超聲時(shí)間條件下制備出的PLGA 納米微球Fig.3 PLGA nanospheres prepared under different ultrasonic time

2.4 優(yōu)化條件下的PLGA 納米微球制備

將上述的制備條件聯(lián)合，制備出PLGA 納米微球并對(duì)其進(jìn)行表征，結(jié)果如圖4 所示，2% PVA 濃度下，用60 W 超聲功率進(jìn)行4 min 超聲，所得到的納米微球平均粒徑為332.2 nm，軟件評(píng)估PDI 指數(shù)為0.114，而zeta 電位的絕對(duì)值為19.1，從平均粒徑到微球的均一性，都優(yōu)于單變量條件優(yōu)化下制備的納米微球。掃描電鏡的結(jié)果如圖5 所示，從圖5A 中，可以看出沒(méi)有經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化制備的微球粒徑較大，形態(tài)大小不一，粒徑分布較寬；從圖5B 中，可以看出經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化后制備的微球粒徑要比前者小，形態(tài)上更加均一，粒徑分布較窄，表明PLGA 納米微球的制備條件優(yōu)化是比較成功的。

圖4 最優(yōu)條件下制備出的PLGA 納米微球Fig.4 PLGA nanospheres prepared under optimal condition

圖5 PLGA 納米微球的掃描電鏡圖片F(xiàn)ig.5 Scanning electron microscope image of PLGA nanospheres

3 討論

實(shí)驗(yàn)中使用的是雙溶劑乳化法制備PLGA 納米微球，技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)在于技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單易操作，成本較低，因而被人們廣泛使用。但制備出的微球可重復(fù)性差，粒徑分布寬，形態(tài)可調(diào)整性較小，作為載體包封率低[14]，且不適用于大批量制備納米微球，要達(dá)到理想的使用條件，需要進(jìn)行大量的重復(fù)實(shí)驗(yàn)來(lái)摸索出最佳的微球制備條件，因此存在一定的局限性。隨著人們對(duì)納米微球載體的研究不斷深入，已經(jīng)有越來(lái)越多的新型制備方法被開(kāi)發(fā)出來(lái)，其中包括：超臨界流體乳化法、噴霧干燥法、水凝膠模板法、微流體法及膜乳化法等。和雙溶劑乳化法相比，微流體法將材料的溶液流體通過(guò)固定的微管，可以獲得窄尺寸分布且粒徑控制精準(zhǔn)的微球，同時(shí)還能極大提高對(duì)藥物的包封率和負(fù)載率[15-16]。另外在微球制備前，PLGA 需要選擇適當(dāng)?shù)娜軇┻M(jìn)行溶解后才能進(jìn)行乳化，在實(shí)驗(yàn)中，用的是二氯甲烷作溶劑進(jìn)行溶解，除此之外還可以選擇氯仿或乙酸乙酯等作為溶劑，然而上述的溶劑都是有較強(qiáng)毒性的，對(duì)人體有巨大的危害，目前報(bào)導(dǎo)出的無(wú)毒替代物種類(lèi)較少且效果不佳，因此尋求高效的無(wú)毒替代物就成了日后亟待解決的問(wèn)題。

PLGA 納米微球作為一種非常便捷的藥物載體，它的形態(tài)特征、大小和PDI 都是控制藥物釋放動(dòng)力學(xué)的重要因素，在相關(guān)的文獻(xiàn)中已經(jīng)有相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型能夠通過(guò)評(píng)估粒子的形態(tài)和尺寸參數(shù)來(lái)預(yù)測(cè)藥物的釋放動(dòng)力學(xué)[17]。由于PLGA 聚合物鏈末端存在羧基，所以PLGA 納米微球zeta 電位常為負(fù)值[18]。然而有研究表明，表面帶有正電荷的納米微球會(huì)更容易被細(xì)胞所攝取，而且會(huì)誘導(dǎo)更多的T 淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌[19-20]。因此為了達(dá)到更好的治療效果，將PLGA 用帶有正電荷的材料進(jìn)行修飾，在正負(fù)電荷間的中和作用下，可以極大減少PLGA 納米微球zeta 電位的負(fù)值[21]。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，制備的納米微球在掃描電鏡下觀(guān)察，有些微球表面孔隙很多，有的微球表面接近于光滑，這可能是由外界氣溫變化，致使二氯甲烷揮發(fā)速度不同導(dǎo)致的。在去除有機(jī)溶劑過(guò)程中聚合物的沉淀速率會(huì)對(duì)微球的形態(tài)產(chǎn)生影響，緩慢消除有機(jī)溶劑利于微球緩慢沉淀從而形成光滑的表面，相反如果溶劑被快速去除則微球形成多孔表面[22]。Wang 等[23]研究發(fā)現(xiàn)溶劑的揮發(fā)性越低則形成的微球孔徑就越大，而溶劑的揮發(fā)性越高則形成的微球孔徑就越小。微球孔隙與藥物輸送的關(guān)系緊密，多孔性微球具有更大的表面積和更低的密度，能夠使藥物得到較快的釋放[24]。因此，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格保持在一個(gè)穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，這樣會(huì)更有利于獲得理想的納米微球。

實(shí)驗(yàn)中選擇的乳化劑為PVA，且選擇改變其濃度來(lái)優(yōu)化PLGA 納米微球的制備條件，是因?yàn)槲⑶虻牧酱笮∨c乳化劑的種類(lèi)及其濃度有關(guān)。Noviendri等[25]通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較了聚乙烯醇（PVA）、吐溫20（Tween 20）、斯潘20（Span 20）和十二烷基硫酸鈉（SDS）4 種乳化劑對(duì)微球粒徑的影響。結(jié)果表明，使用PVA 作乳化劑可以制備出最小粒徑的微球，而使用SDS 作乳化劑制備出的微球粒徑最大。而微球粒徑的大小與所選擇的治療途徑關(guān)系緊密，例如對(duì)于心肌內(nèi)應(yīng)用，適宜的粒徑大小約為5～8 μm，而對(duì)于吸入劑或親代顆粒適宜的粒徑約為1～5 μm。Hernández 等[26]研究了單一乳化法和納米共沉淀法制備PLGA 納米粒子的不同，分析了聚合物及乳化劑濃度、有機(jī)溶劑含量、超聲波幅度和注射速度（納米沉淀）對(duì)最終結(jié)果的影響，總結(jié)出聚合物的組成和濃度影響納米粒子的物理化學(xué)性質(zhì)（粒徑、PDI 和zeta 電位），有機(jī)溶劑主要控制微球顆粒的尺寸，而PLGA 和PVA 的濃度則影響納米共沉淀劑的效果。

PLGA 納米微球是理想的藥物載體，可極簡(jiǎn)單的通過(guò)單體組成、分子量和端基功能化來(lái)修飾達(dá)到調(diào)控降解時(shí)間和靶向性的目的，此外它還可以用來(lái)搭載多種類(lèi)型的負(fù)載物，能適用于制藥、食品等多個(gè)工業(yè)領(lǐng)域，在應(yīng)用上有很強(qiáng)的塑造性。在食品領(lǐng)域，Zhu等[27]將具有廣譜抗菌性的麝香草酚用PLGA 進(jìn)行包封，極大地延緩了麝香草酚的揮發(fā)，將其應(yīng)用在牛奶樣品中作抗菌保添加鮮劑，后樣品經(jīng)過(guò)檢測(cè)分析證明該保鮮劑對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有很強(qiáng)的拮抗作用，研究結(jié)果為食品保鮮行業(yè)的發(fā)展帶來(lái)了新思路。而在靶向治療腫瘤方面，Ruoslahti 等[28]用PLGA 負(fù)載紫杉醇（PTX），將表面用與腫瘤生長(zhǎng)有關(guān)的神經(jīng)通透性蛋白（NRP）作靶向分子進(jìn)行修飾，對(duì)小鼠腫瘤模型進(jìn)行治療，與未修飾的PLGA 微球相比，修飾過(guò)的PLGA 微球治療小鼠的存活率提高了1.6 倍，這一結(jié)果為腫瘤治療發(fā)展提供了重要的參考價(jià)值。

到目前為止，只有少數(shù)幾類(lèi)以納米載體為基礎(chǔ)的藥物被批準(zhǔn)用于臨床，因此未來(lái)的研究重點(diǎn)在于完成實(shí)驗(yàn)室成果到臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化，這需要制藥公司、科學(xué)家和臨床醫(yī)生等多方的密切合作?；诮陙?lái)的制備工藝不斷進(jìn)步以及大量相關(guān)研究的出現(xiàn)，相信作為藥物載體的納米粒子將徹底改變醫(yī)療領(lǐng)域的局面，在不久的將來(lái)，基于納米微球的療法會(huì)更加智能和個(gè)性化，有望進(jìn)行臨床應(yīng)用。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)通過(guò)探究不同乳化劑濃度、超聲時(shí)間和超聲功率對(duì)微球表征結(jié)果的影響，確定了微球制備的優(yōu)化條件為2% PVA 濃度下，以60 W 功率超聲4 min，此時(shí)獲得的PLGA 納米微球最理想，這一結(jié)果為下一步用PLGA 納米微球包封相關(guān)抗原抗金黃色葡萄球菌感染的研究奠定了基礎(chǔ)。