劉明月，孫健，鞠皓，常巧呈，3

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319；2.通化市東昌區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，3.汕頭大學(xué)）

虻科昆蟲俗稱“牛虻”，“瞎虻”，隸屬于昆蟲綱雙翅目短尾亞目虻科，共144 屬約4 455 種，其中虻屬約1 300 種[1-5]；虻類不僅叮咬、吸血、騷擾人畜引起皮膚損傷或蕁麻疹樣皮炎，導(dǎo)致牲畜體重下降；還作為重要的生物傳播媒介，傳播多種人畜共患疾病，如土拉弗氏菌病、炭疽和羅阿絲蟲病等，不同種類的牛虻可傳播不同的疾病，給畜牧業(yè)和公共衛(wèi)生安全帶來危害[6-14]。

寄生蟲的準(zhǔn)確鑒定是寄生蟲防控和科學(xué)研究的基礎(chǔ)，當(dāng)前虻的鑒定主要依靠形態(tài)學(xué)鑒定。虻類的鑒定主要依賴于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法，即：頭部基胛和觸角的形狀；背板和翅膀的花紋等。而形態(tài)學(xué)鑒定需要形態(tài)學(xué)鑒定專家?，F(xiàn)在文獻(xiàn)中大部分只是文字的描述，缺少相關(guān)形態(tài)學(xué)圖片數(shù)據(jù)。分子生物學(xué)鑒定在寄生蟲鑒定中具有一定的優(yōu)勢(shì)，但虻類有關(guān)的基因數(shù)據(jù)相對(duì)較少，使鑒定困難。分子生物學(xué)方法主要依據(jù)線粒體或核糖體序列等分子marker[15-16]。對(duì)于GenBank中缺乏序列信息的虻種鑒定以及新虻種的發(fā)現(xiàn)，尚離不開形態(tài)學(xué)鑒定方法。分子技術(shù)在研究虻類種群動(dòng)態(tài)時(shí)可作為提供重要信息強(qiáng)有力的工具，線粒體（mt）細(xì)胞色素c 氧化酶亞基1（COX 1）基因序列因其較為保守，種內(nèi)遺傳差異小等特點(diǎn)被認(rèn)為是區(qū)分不同節(jié)肢動(dòng)物物種的標(biāo)準(zhǔn)方法[17-20]。可用作虻類種屬鑒別的分子遺傳學(xué)標(biāo)志。結(jié)合分子的鑒定方法（DNA 條形碼方法）可以減少僅使用形態(tài)特征的局限性。用PCR 方法擴(kuò)增其COX 1 序列并與GeenBank 上已有的相關(guān)虻科序列進(jìn)行比對(duì)分析和進(jìn)化分析對(duì)虻的鑒定具有重要意義。因此，研究擬綜合應(yīng)用形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定兩種方法對(duì)采集到的虻進(jìn)行鑒定。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 蟲體來源

蟲體采來自黑龍江省大慶市，采集方法為揮網(wǎng)法。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料

昆蟲針，泡沫板，體視鏡，移液管，研磨缽，鑷子，挑針，DNA 提取試劑盒（TIANamp Genomic DNA Kit），ExTaq DNA 聚合酶（TaKaRa），dNTPs（TaKa-Ra），pMD18-T 載體（TaKaRa），大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞（TaKaRa），DNA Marker（2000），1×TAE，蛋白酶K，生理鹽水，75%乙醇，瓊脂糖，溴化乙錠，DNA凝膠回收試劑盒（AxyPrep DNAGel Extraction Kit），甘油，冰乙酸，去離子水等實(shí)驗(yàn)常規(guī)試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

將牛虻用昆蟲針保定在泡沫板上，用相機(jī)拍攝局部特征；隨后在體視鏡下進(jìn)行觀察。依據(jù)蟲體大小和外部形態(tài)，初步判斷是三種牛虻，分別命名為牛虻A(chǔ)、牛虻B 和牛虻C。不斷調(diào)整體視鏡倍數(shù)和蟲體的位置來觀察蟲體外觀及各部位器官的形態(tài)特征[21-24]。

1.2.2 總DNA 提取

將蟲體用生理鹽水反復(fù)清洗三次后，再將部分組織放入研磨缽加入液氮充分研磨，消化后用TIANamp Genomic DNAKit（TIANGEN）試劑盒嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行DNA 提取，提取后將DNA 分裝置于-20 ℃冰箱中保存，用于下一步PCR 擴(kuò)增。

1.2.3 目的基因的擴(kuò)增

通過NCBI 上已有虻科的序列運(yùn)用primer Premier 5 設(shè)計(jì)COX 1 引物，上游引物為：5′-ATT CAA CCA ATC ATA AAG ATA TTG G-3′，下游引物為：5′-TAA ACT TCT GGA TGT CCA AAA AAT CA-3′。引物由吉林庫美生物有限公司合成。以這三種蟲體DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增蟲體COX 1 序列，反應(yīng)體系為25 μL，其中18.3 μL 蒸餾水，2.5 μL 10× Ex Taq buffffer，2 μL dNTP mixture，上下引物各0.5 μL，1 μL DNA 模板和0.2 μL Ex Taq DNA 酶。將PCR 反應(yīng)混合物裝在PCR 管中，放入Takara TP600 擴(kuò)增儀（日本TKAKRA）中，采用以下擴(kuò)增條件：94 ℃5 min（預(yù)變性），94 ℃30 s（變性），40 ℃1 min（退火），72 ℃1 min（延伸）35 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。將擴(kuò)增出的產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)拍照。切下目的條帶后用DNA 瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。然后將回收的DNA 產(chǎn)物連接到pMD18-T 載體上，經(jīng)過無抗LB 培養(yǎng)后，涂在帶有AMP+的固體LB 培養(yǎng)基上，最后將克隆所得陽性質(zhì)粒送到吉林庫美生物有限公司，使用相同的引物進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.4 序列分析與進(jìn)化關(guān)系分析

測(cè)序得到的序列，應(yīng)用DNAStar 軟件中的MegAlign 與虻科的相關(guān)蟲體進(jìn)行同源性分析。利用MEGA X 軟件，基于COX 1 序列，以以舞虻科Rhamphomyia insignis為外群，采用最大簡約法（Maximum Parsimony，MP）將本研究的三種牛虻與虻科4 屬20種牛虻構(gòu)建進(jìn)化樹，探討這三種牛虻與其它屬牛虻之間的親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲體形態(tài)學(xué)觀察

牛虻A(chǔ)：初步判斷為雁虻，雌性體長20～25 mm。胸部背板黑灰色，無縱紋；腹部背板黑色且中間有1列灰白色三角，第1～3 背板兩側(cè)具棕紅色斑；后緣具淺黃色橫帶。復(fù)眼無帶；額灰色，覆黑毛，額頂寬略大于基寬，額高為基寬的4.5 倍；亞胛覆粉；觸角柄節(jié)和梗節(jié)棕色，鞭節(jié)基部紅棕色，端部及端環(huán)節(jié)棕黑色；下顎須棕色，第2 節(jié)長為基寬的4 倍；平衡棒棕黑色，球部頂端棕色。腹板黑灰色，第1～4 腹板棕色，中央具1 列圓形黑斑。是我國東北、華北山區(qū)常見種也是攻擊牲畜的重要種類（圖1ABC）。

圖1 牛虻形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 The morphological observation of Gadflies

牛虻B：初步判斷為廣斑虻，體黃色，雌性體長9～10 mm；觸角梗節(jié)長為寬的2 倍；腹部背板具4 列長三角形黑斑。頭部略寬于胸部，復(fù)眼裸，頭頂具3個(gè)棕黑色單眼，位于灰黑色單眼瘤區(qū)內(nèi)，單眼瘤區(qū)小，覆粉，兩側(cè)遠(yuǎn)離復(fù)眼，著生棕色毛；額高大于基部寬度，頂寬略窄于基寬，棕黃色，著生稀疏的棕色毛；額基胛棕色，兩側(cè)與眼分離；口毛棕色。觸角短，棕色，著生黑毛，下顎須黃棕色，著生棕色毛。喙長，為下顎須長的1.5 倍，棕黑色，唇瓣黑棕色，著生黑毛。胸部：盾片黃棕色，著生棕色短毛，中央有1 窄的且兩側(cè)有1 對(duì)寬的棕黑色縱條，側(cè)板棕黃色，著生棕色毛，有翅端斑。腋瓣煙棕黑色，具棕色纓毛。平衡棒柄棕色，球部暗棕色。足黃棕色，著生棕色毛，前足脛節(jié)及各足跗節(jié)色較暗，富黑毛。腹部：黃棕色，著生棕色毛，背板具4 列長三角形黑斑，各背板側(cè)緣黑色，淺色部分著生棕色毛，黑色部分著生黑毛。腹板黃棕色，著生黃棕色毛。分布于黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、北京等地。是稻作區(qū)的主要吸血虻種（圖1DEF）。

牛虻C：初步判斷為土耳其麻虻，雌性體長8～10 mm，灰色，翅長7～8 mm。腹部背板黑棕色，中央具不明顯縱淺條，第2～6 背板兩側(cè)具大的圓灰白斑，各背板具淺色后緣。頭部：額兩側(cè)平行，基部寬度大于高，基胛黑色，寬為高的4～5 倍，兩側(cè)與復(fù)眼分離，側(cè)點(diǎn)與基胛和復(fù)眼均分離，中央點(diǎn)小；在觸角間具黑色絨斑，口毛白色。觸角柄節(jié)黑色，覆灰粉，著生白毛，長約為寬的3 倍，端部背面具凹陷，梗節(jié)背突小，灰色，具黑毛，鞭節(jié)的基環(huán)節(jié)黃棕色，有時(shí)端部黑色，略長于柄節(jié)，端部3 個(gè)環(huán)節(jié)黑色。下顎須淺灰白色，主要著生白毛。胸部：盾片黑色，中縱條窄。側(cè)板和足基節(jié)棕灰黑色，具灰棕色毛?；堪咨?、后足脛節(jié)黑色，具2 個(gè)棕黃色環(huán)，跗節(jié)黑色。翅膀具有玫瑰型花斑，翅透明。平衡棒淺黃棕色。腹板灰色，著生灰白色毛，具淺色后緣（圖1GHI）。

2.2 目的基因的擴(kuò)增

成功擴(kuò)增三種牛虻的COX 1 序列，分別在1 500 bp左右出現(xiàn)明亮且單一條帶，與目的基因大小相似（圖2）。

圖2 三種牛虻COX 1 擴(kuò)增結(jié)果圖Fig.2 The COX 1 amplification results of three gadflies

圖3 基于COX 1 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree based on COX 1 sequences

2.3 序列分析與進(jìn)化分析

將陽性質(zhì)粒送至吉林庫美生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，拼接后得到長度分別為1 506 bp、1 500 bp 和1 506 bp 的COX 1 序列。牛虻A(chǔ) 的A+T 含量為69.85%，經(jīng)MegAlign 同源性序列分析比較發(fā)現(xiàn)，蟲體與GenBank 上已經(jīng)發(fā)表的Tabanus chrysurus（NC 062705.1）的同源性最高為96.5%。牛虻B 的A+T 含量為69.00% ，與Chrysops niger（NC 067608.1）的同源性最高為90.1%；牛虻C 的A+T 含量為68.26%。與Haematopota pluvialis（MT 584146.1）的同源性最高為91.1%?；贑OX 1 序列，與虻科4 屬20 種牛虻構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示，虻科四屬牛虻形成三個(gè)大的分支，第一個(gè)大的分支為黃虻屬；第二個(gè)大的分支又包括兩個(gè)小的分支，分別是麻虻屬與虻屬；第三個(gè)大的分支為斑虻屬。牛虻A(chǔ) 與虻屬聚集在一起，與金色虻處于同一分支中親緣關(guān)系較近；牛虻B 與斑虻屬聚集在一起，與Chrysops distinctipennis和Chrysops dispar處于同一分支中親緣關(guān)系較近；牛虻C 與麻虻屬聚集在一起，與Haematopota sp.處于同一分支中親緣關(guān)系較近。因此鑒定牛虻A(chǔ) 為虻屬；牛虻B 為斑虻屬；牛虻C 為麻虻屬。

結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定牛虻A(chǔ) 為雁虻，牛虻B 為廣斑虻，牛虻C 為土耳其麻虻。

3 討論

虻類對(duì)所有節(jié)肢動(dòng)物的侵襲都會(huì)造成動(dòng)物的煩擾不安，動(dòng)物為了躲避也會(huì)造成能量的損耗。當(dāng)成年虻特別多時(shí)，放牧家畜可受到連續(xù)不斷的瘋狂攻擊，可能消耗大量時(shí)間和精力去抵御這種襲擊，以至無法充分休息或采食，最終家畜出現(xiàn)疲憊，影響生產(chǎn)力，有時(shí)出現(xiàn)死亡。家畜對(duì)牛虻特別懼怕，叮咬時(shí)，虻的上腭和下腭劃破血管，用唇舔食從傷口流出的血液，造成劇烈疼痛。對(duì)奶牛乳房和乳溝等皮膚皺褶處的反復(fù)攻擊可導(dǎo)致廣泛的滲出性濕疹病變，還可能繼發(fā)細(xì)菌感染[25]。

成年虻在飽血之前如被宿主趕走，很快會(huì)飛到第二個(gè)宿主身，上完成吸血，這樣傷口就會(huì)受到機(jī)械性傳播的細(xì)菌（如炭疽）、病毒（如馬傳染性貧血病毒）等污染。每個(gè)虻都吸入大量的血液（高達(dá)虻重量的4 倍），彌補(bǔ)了血液中低濃度微生物在中間宿主體內(nèi)不能繁殖的缺陷，也提高了虻作為機(jī)械性傳播媒介的有效性。有些哺乳動(dòng)物的錐蟲（血鞭毛蟲）也可通過虻機(jī)械性或生物性傳播。在亞洲，馬、駱駝、大象和犬的一種致死性疾病即蘇拉病（伊氏錐蟲）可通過虻機(jī)械性傳播。泰勒錐蟲必須在虻的體內(nèi)繁殖，因?yàn)樗诩倚蟮难褐蟹浅Ｏ∩?，通常必須通過培養(yǎng)才能證明它的存在。據(jù)報(bào)道，寄生在糜鹿、綿羊體內(nèi)的施氏血管線蟲，從血液中的微絲蚴發(fā)育到感染性第三期幼蟲都是在虻體內(nèi)完成的[26-27]。

虻科昆蟲種類多、分布廣，世界已知3 亞科137屬約4 300 種，中國虻科最早在20 世紀(jì)40 年代文獻(xiàn)記載有4 屬68 種，自20 世紀(jì)60 年代以后我國虻科研究有了明顯進(jìn)展，至20 世紀(jì)90 年代我國的虻科記載有11 屬418 種0 至今，我國的虻科昆蟲經(jīng)統(tǒng)計(jì)有14 屬454 種。我國東北三省虻科昆蟲研究起步較晚，自20 世紀(jì)80 年代以后才有明顯的研究進(jìn)展，黑龍江虻類采集記述采自該省的虻類5 屬37 種[28-29]。我國虻科區(qū)系調(diào)查工作雖已取得很大成績，種數(shù)已達(dá)世界已知種數(shù)的十分之一，但要徹底搞清中國的虻科區(qū)系還有一段距離。由于目前虻相關(guān)的分類研究資料和數(shù)據(jù)還相對(duì)較少，許多種類的牛虻序列Geenbank 中還沒有，研究首次擴(kuò)增了三種牛虻的cox1 序列，并上傳GeenBank，與相關(guān)序列比較分析，并構(gòu)建了分子進(jìn)化樹。基于COX 1 序列構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示，牛虻A(chǔ) 與虻屬聚集在一起，與金色虻（Tabanus chrysurus）處于同一分支中親緣關(guān)系較近；牛虻B 與斑虻屬聚集在一起，與Chrysops distinctipennis和Chrysops dispar處于同一分支中親緣關(guān)系較近；牛虻C 與麻虻屬聚集在一起，與Haematopota sp.處于同一分支中親緣關(guān)系較近。因此鑒定牛虻A(chǔ) 為虻屬；牛虻B 為斑虻屬；牛虻C 為麻虻屬。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定牛虻A(chǔ) 為雁虻，牛虻B 為廣斑虻，牛虻C 為土耳其麻虻。填補(bǔ)虻科基因組數(shù)據(jù)庫，為探究虻科分類以及與其他虻科親緣關(guān)系提供依據(jù)。

在虻種群集中活躍的林區(qū)、農(nóng)業(yè)區(qū)采取必要的防護(hù)措施，如戴防護(hù)帽、涂抹驅(qū)避劑等。牧區(qū)可選擇在清晨或夜間放牧，以避開虻種群活動(dòng)高峰期。在虻害嚴(yán)重的居民生活區(qū)周圍，注意疏通渠道、填平溝洼及清除雜草，以減少虻孳生和產(chǎn)卵場(chǎng)所。在畜舍周圍的樹木、草叢和柵欄等虻種群棲息地，適時(shí)適量地噴施殺螟松、溴氰菊酯和三氯殺蟲酯等藥物進(jìn)行防治[30]。虻和斑虻很難被徹底殺死或驅(qū)除，最好的措施是在虻活動(dòng)的高峰期將家畜關(guān)在有防護(hù)措施的圈舍內(nèi)。

4 結(jié)論

經(jīng)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定了大慶地區(qū)的三種牛虻，并描述了其種類的形態(tài)特征。雁虻體形最大約為23 mm，廣斑虻和土耳其麻虻體形最小約10 mm。研究鑒定的三種牛虻體色具有明顯差異，雁虻的體色為棕黑色，是虻類里體形最大的。廣斑虻體色為黃色，翅膀的花紋是斑虻屬獨(dú)有的。土耳其麻虻體色為灰色，翅膀透明且具有玫瑰型花斑是麻虻屬獨(dú)有的特征?？紤]到牛虻種類的繁多，研究提供的大慶地區(qū)牛虻種類鑒定是有限的。因此，為了更好地了解牛虻的多樣性、流行率、在疾病傳播中的作用及牛虻攜帶的病原體等，有必要進(jìn)行進(jìn)一步的采集鑒定。為后續(xù)深入研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)這將促進(jìn)對(duì)牛虻這一被忽視的媒介采取更有效的防控措施。