蔣凱，趙鵬宇，賀顯晶，郭東華

（黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶 163319）

壞死桿菌（Fusobacterium necrophorum，F(xiàn).necrophorum）是一種無鞭毛、無芽孢、嚴格厭氧的革蘭陰性細菌，多以長桿狀存在于自然界中[1]。壞死桿菌感染動物可造成反芻動物腐蹄病、犢牛白喉、牛肝膿腫、奶牛乳房炎和子宮內(nèi)膜炎等疾病，并在宿主體內(nèi)長期存在造成持續(xù)性感染[2-4]。壞死桿菌感染對肉牛和奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。

多種證據(jù)表明，持續(xù)的微生物感染多是以生物被膜（Biofilm）形式存在的細菌所引起的[5]。生物被膜是細菌的一種特殊存在形式，由細菌和自身產(chǎn)生的胞外多糖、胞外DNA 和胞外蛋白共同組成，常附著在生物或非生物載體表面[6]。生物被膜的存在為細菌生長提供穩(wěn)定的環(huán)境，使細菌免受干燥、免疫系統(tǒng)攻擊、原生動物攝取和抗菌劑等環(huán)境壓力的影響[7]。生物被膜的形成主要包括細菌不可逆的表面黏附、細菌增殖與胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和細菌的分離三個連續(xù)階段[8]。細菌的黏附因子在生物被膜形成過程中起著重要作用[9]。對具核梭桿菌使用黏附素RadD 血清孵育后，顯著減弱了生物被膜的形成[10]。使用外膜蛋白FomA疫苗接種后，顯著降低了口腔生物被膜的形成[11]。

43K OMP 是壞死桿菌的一個重要外膜蛋白，由Sun 等首次在壞死桿菌中鑒定發(fā)現(xiàn)[12]。隨后的研究顯示43K OMP 與壞死桿菌黏附宿主細胞的能力有關(guān)，是壞死桿菌重要的黏附因子之一[13-15]。43K OMP 在壞死桿菌生物被膜形成過程中是否發(fā)揮作用，尚未有人研究。因此，通過對壞死桿菌親本株A25 和缺失株A25Δ43K OMP 生物被膜成熟時間、生物被膜不可逆附著階段菌量、生物被膜形態(tài)和對臨床常見藥物耐藥性進行研究，確定43K OMP 基因與生物被膜形成特性的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 菌株

壞死桿菌親本株A25 株購自美國ATCC（Fusobacterium necrophorum，F(xiàn)nn亞種，ATCC 25286），壞死桿菌43K OMP 基因缺失株（A25Δ43K OMP）由黑龍江八一農(nóng)墾大學獸醫(yī)分子病理學實驗室構(gòu)建并保存。

1.2 主要試劑儀器

主要試劑：苛養(yǎng)厭氧菌肉湯培養(yǎng)基（FAB）和腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（BHI）購自山東托普生物工程有限公司；瓊脂購自廣州賽國生物科技有限公司；結(jié)晶紫、碘化丙啶（PI）和熒光素-伴刀豆凝集素標記物（ConA-FITC）購自上海Sigma-Aldrich 貿(mào)易有限公司；甲砜霉素、氨芐青霉素、紅霉素、諾氟沙星、鹽酸林可霉素、四環(huán)素、磺胺嘧啶、慶大霉素、卡那霉素、安普霉素和氯霉素購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

主要儀器：厭氧培養(yǎng)箱（YQX-Ⅱ）購自上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；分光光度計（T6 新悅）購自北京普析通用儀器有限公司；酶標儀（Infinite 200 PRO）購自瑞士TECAN 公司；熒光顯微鏡（INTENSILIGHT C-HGFI）購自株式會社尼康。

1.3 試驗方法

1.3.1 細菌培養(yǎng)

取出存放于-80 ℃冰箱的壞死桿菌A25 與A25Δ43K OMP 菌液，用接菌環(huán)蘸取菌液于FAB 固體平板劃線，在37 ℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)48 h，挑取單菌落接種于5 mL FAB 培養(yǎng)基試管中（缺失株培養(yǎng)基中加入甲砜霉素），37 ℃厭氧培養(yǎng)，連續(xù)傳菌至3 代后用于后續(xù)試驗。

1.3.2 生物被膜測定

取無菌12 孔板，每孔加入2 mL 制備好的菌液（OD600nm=0.01），陰性對照為BHI 培養(yǎng)基，每組重復4 孔。37 ℃厭氧培養(yǎng)后，移除孔內(nèi)液體，用無菌PBS溶液洗3 次；每孔加入1 mL 甲醇固定15 min，無菌PBS 溶液洗3 次；待孔內(nèi)干燥后，每孔加入1 mL 結(jié)晶紫溶液染色5 min，無菌PBS 溶液洗3 次；待自然干燥后，每孔加入1 mL 95%乙醇溶液，靜置30 min后用酶標儀測OD570nm值。

1.3.3 生物被膜成熟時間測定

取無菌12 孔板，每孔加入2 mL 制備好的菌液（OD600nm=0.01），陰性對照為BHI 培養(yǎng)基，每組重復4 孔。37 ℃厭氧培養(yǎng)，每24 h 更換BHI 培養(yǎng)基。分別在接種0.5、1、2、3、4 和5 d 用無菌PBS 溶液洗去浮游細菌，根據(jù)1.3.2 節(jié)方法進行結(jié)晶紫染色并測量OD570nm值，根據(jù)OD570nm值繪制生物被膜生長曲線。

1.3.4 不可逆附著菌量計數(shù)

取無菌12 孔板，每孔加入2 mL 制備好的菌液（OD600nm=0.01），陰性對照為BHI 培養(yǎng)基，每組重復4孔。37 ℃厭氧培養(yǎng)，每24 h 更換BHI 培養(yǎng)基。分別在接種6、12、18 和24 h 用無菌PBS 溶液洗去浮游細菌，每孔加入1 mL 2%戊二醛固定1.5 h，無菌PBS溶液洗3 次；每孔加入1 mL PI 避光染色15 min，無菌PBS 溶液沖洗3 次，加入1 mL 40%甘油封頂后，通過熒光顯微鏡觀察并隨機選取3 個視野進行拍照，對每個視野隨機選取3 個200 μm2區(qū)域進行菌量計數(shù)。

1.3.5 生物被膜形態(tài)觀察

取無菌12 孔板，每孔加入2 mL 制備好的菌液（OD600nm=0.01），陰性對照為BHI 培養(yǎng)基，每組重復4孔。37 ℃厭氧培養(yǎng)，每24 h 更換BHI 培養(yǎng)基。分別在接種2、3 和4 d 用無菌PBS 溶液洗去浮游細菌，每孔加入1 mL 2%戊二醛固定1.5 h，無菌PBS 溶液洗3 次；每孔加入1 mL ConA-FITC 避光染色30 min，無菌PBS 溶液沖洗3 次；每孔加入1 mL PI 避光染色15 min，無菌PBS 溶液沖洗3 次，加入1 mL 40%甘油封頂后，通過熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.3.6 耐藥性檢測

根據(jù)CLSI 標準，通過肉湯微量稀釋法檢測壞死桿菌對10 種抗生素的最小抑菌濃度（MIC）。取無菌96 孔板，前10 列作為試驗組，第11 列作為陽性對照，第12 列作為陰性對照。將待測藥物配制為256 μg·mL-1，加入第一孔，用BHI 培養(yǎng)基進行連續(xù)倍比稀釋。試驗組及陽性對照組每孔加入100 μL 壞死桿菌菌液（OD600nm=0.01），陰性對照組加入等體積BHI 培養(yǎng)基，每組4 個重復。37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h 后，觀察細菌生長情況并記錄結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 生物被膜成熟時間

為研究43K OMP 基因缺失對壞死桿菌生物被膜成熟時間是否產(chǎn)生影響，對接種親本株A25 和缺失株A25Δ43K OMP 所產(chǎn)生的生物被膜進行結(jié)晶紫染色，測定OD570nm值。結(jié)果如圖1 所示，親本株A25與缺失株A25Δ43K OMP 生物被膜形成時間無顯著差異，接種1 d 生物被膜無顯著增長現(xiàn)象，接種2 d開始形成生物被膜，接種4 d 生物被膜成熟。壞死桿菌缺失43K OMP 基因后，壞死桿菌成熟生物被膜含量顯著升高。由此可見，43K OMP 基因缺失不影響壞死桿菌生物被膜成熟時間，但對生物被膜含量造成影響。

圖1 生物被膜成熟時間測定Fig.1 Determination of maturation time of biofilm

2.2 生物被膜不可逆附著菌量

為研究缺失43K OMP 基因?qū)ι锉荒げ豢赡娓街A段細菌附著數(shù)量的影響，根據(jù)生物被膜成熟時間選定接種24 h 以內(nèi)為不可逆附著階段，對接種6、12、18 和24 h 生物被膜進行PI 染色，熒光染料PI特異性與細菌DNA 進行結(jié)合發(fā)出紅色熒光，通過熒光顯微鏡對200 μm2內(nèi)細菌進行計數(shù)，結(jié)果如表1和圖2 所示。在接種6～18 h，親本株A25 與缺失株A25Δ43K OMP 含量均無顯著差異，接種24 h，缺失株A25Δ43K OMP 細菌含量顯著下降。結(jié)果表明缺失43K OMP 基因?qū)乃罈U菌生物被膜形成早期的不可逆附著階段有一定影響。

表1 生物被膜不可逆附著階段細菌含量Table 1 Bacterial content in the irreversible attachment stage of biofilm

圖2 生物被膜不可逆附著階段細菌含量Fig.2 Bacterial content in the irreversible attachment stage of biofilm

2.3 生物被膜形態(tài)

為研究43K OMP 基因缺失對壞死桿菌生物被膜形態(tài)是否產(chǎn)生影響，用熒光染料ConA-FITC 特異性結(jié)合生物被膜內(nèi)胞外多糖并發(fā)出綠色熒光，用熒光染料PI 復染特異性結(jié)合生物被膜內(nèi)細菌DNA 分子并發(fā)出紅色熒光，在熒光顯微鏡下觀察壞死桿菌親本株A25 和缺失株A25Δ43K OMP 的生物被膜形態(tài)。結(jié)果如圖3 所示，壞死桿菌親本株A25 和缺失株A25Δ43K OMP 均檢測到生物被膜的形成。親本株A25 接種3 d 出現(xiàn)聚集性小菌落；缺失株A25Δ43K OMP 接種2 d 出現(xiàn)聚集性菌落，接種4 d 出現(xiàn)溝壑狀結(jié)構(gòu)。43K OMP 基因的缺失對壞死桿菌生物被膜形態(tài)未產(chǎn)生影響，但對生物被膜菌落形成時間產(chǎn)生影響。

圖3 生物被膜的熒光顯微鏡圖像（200×）Fig.3 Fluorescence microscope image of biofilm（200×）

2.4 最小抑菌濃度（MIC）檢測

為研究43K OMP 基因缺失對壞死桿菌耐藥性的變化，檢測親本株A25 和缺失株A25Δ43K OMP對10 種抗菌藥的MIC 值。結(jié)果如表2 所示，缺失43K OMP 基因后，壞死桿菌對磺胺嘧啶、慶大霉素、卡那霉素和安普霉素的耐藥性減弱。結(jié)果表明，缺失43K OMP 基因?qū)乃罈U菌耐藥性產(chǎn)生影響。

表2 親本株A25 和缺失株A25Δ43K OMP 對10 種抗菌藥的MIC Table 2 MIC of A25 and A25Δ43K OMP against 10 antibiotics

3 討論

檢測生物被膜的方法有很多種，主要包括剛果紅瓊脂培養(yǎng)基法、結(jié)晶紫染色法、掃描電子顯微鏡法、激光共聚焦掃描顯微鏡法、質(zhì)譜分析和PCR 檢測法[16]。研究采用結(jié)晶紫染色法對壞死桿菌生物被膜進行定量研究。結(jié)果顯示，壞死桿菌親本株A25 和缺失株A25Δ43K OMP 接種2 d 開始形成生物被膜，接種4 d 生物被膜含量不再增加，生物被膜成熟。缺失株A25Δ43K OMP 所產(chǎn)生的生物被膜含量顯著高于親本株A25 所產(chǎn)生的生物被膜含量。由此可見，43K OMP 基因在壞死桿菌生物被膜形成過程中起到一定作用。在坂崎腸桿菌（Cronobacter sakazakii）的研究中，坂崎腸桿菌在NaCl 脅迫下缺失外膜蛋白OmpW的菌株形成的生物被膜含量顯著高于親本株，這可能是缺失突變株通過促進生物被膜的形成來適應NaCl 脅迫[17]。43K OMP 基因的缺失導致壞死桿菌對外界環(huán)境感知降低，從而增強生物被膜形成促進自身存活。

壞死桿菌43K OMP 由Sun 等首次發(fā)現(xiàn)，在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)其能夠介導壞死桿菌黏附宿主細胞[12-13，18]。利用重組43K OMP 制備的血清與壞死桿菌共孵育后可抑制壞死桿菌與倉鼠腎細胞（BHK）細胞的結(jié)合[14，19]。2022 年He 等研究發(fā)現(xiàn)43K OMP 可與纖連蛋白結(jié)合介導壞死桿菌與BHK 細胞黏附[15]。43K OMP 是壞死桿菌重要的黏附因子之一。在生物被膜形成初期，細菌的黏附因子在不可逆附著階段起重要作用。在艱難梭菌生物被膜研究中，其表面蛋白及大分子如鞭毛、Ⅳ型菌毛和S 層均參與生物被膜的形成[20]。在糞腸球菌黏附素ace 基因的研究中，存在ace 基因的腸球菌生物被膜平均厚度、細菌密度及活菌比例均高于無ace 基因的腸球菌[21]。43K OMP基因的缺失導致接種24 h 壞死桿菌生物被膜含菌量顯著降低，這說明43K OMP 基因?qū)ι锉荒ば纬删哂幸欢ㄓ绊憽?/p>

生物被膜的結(jié)構(gòu)形態(tài)與細菌的菌種相關(guān)，小菌落是大多數(shù)生物被膜的基本單位，但是其結(jié)構(gòu)因細菌種類而差異巨大。在流動培養(yǎng)室相同條件下培養(yǎng)，惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）形成松散突出的小菌落，而假單胞菌（Pseudomonas knackmussii）則形成球形小菌落[22]。此外，當兩種假單胞菌在生物膜中一起生長時，其菌落特征互不影響[22]。生物被膜形態(tài)結(jié)構(gòu)不僅與細菌種類有關(guān)，也與細菌所處的環(huán)境有關(guān)。Klausen 等[23]證明當銅綠假單胞菌用葡萄糖培養(yǎng)基培育時，所形成的生物被膜則為蘑菇狀的小菌落，而在用檸檬酸鹽培養(yǎng)基培育時，則形成平坦的生物被膜。在研究中，通過熒光顯微鏡觀察壞死桿菌親本株A25 和缺失株A25Δ43K OMP 的生物被膜形態(tài)。結(jié)果顯示親本株A25 和缺失株A25Δ43K OMP 均產(chǎn)生溝壑狀生物被膜，缺失株A25Δ43K OMP 的溝壑結(jié)構(gòu)出現(xiàn)的更早。生物被膜形成后期，生物被膜內(nèi)形成部分通道，這些通道可輸送營養(yǎng)物質(zhì)和分布氧氣并能去除廢棄產(chǎn)物[24]。43K OMP 基因的缺失使得壞死桿菌更早的出現(xiàn)溝壑結(jié)構(gòu)，43K OMP 基因可能介導壞死桿菌營養(yǎng)輸送。

生物被膜的形成使得細菌的耐藥性增加，其耐藥性比游離細菌提高了甚至1 000 倍，給疾病治療帶來了嚴重的挑戰(zhàn)[25]。研究中，缺失43K OMP 基因使得壞死桿菌對慶大霉素、卡那霉素和安普霉素的耐藥性減弱。該三類藥物均屬于氨基糖苷類藥物，主要用于治療革蘭陰性需氧菌、葡萄球菌和其他革蘭陽性菌引起的感染，革蘭陰性厭氧菌對氨基糖苷類藥物具有一定耐藥性[26]。氨基糖苷類抗生素耐藥主要通過突變16S rRNA、甲基化16S rRNA、改變細胞膜通透性、外排泵泵出細胞內(nèi)抗生素和低活性乙酰轉(zhuǎn)移酶螯合抗生素[27]。有研究預測，壞死桿菌43K OMP 結(jié)構(gòu)更傾向于孔蛋白[28]。那么43K OMP 在壞死桿菌外膜上是否調(diào)控細胞膜的通透性直接影響到壞死桿菌對營養(yǎng)攝取、胞外基質(zhì)酶排出和藥物排出等功能，43K OMP 是否作為外排泵使得壞死桿菌對氨基糖苷類藥物產(chǎn)生耐藥，還需進一步研究，對43K OMP 結(jié)構(gòu)的揭示將有助于對43K OMP 功能的研究。因此，壞死桿菌43K OMP 基因缺失促進壞死桿菌生物被膜的形成，抑制壞死桿菌對氨基糖苷類藥物的耐藥。