楊 玲

貴州省銅仁市萬山區(qū)丹都街道辦事處，貴州銅仁 554300

豬圓環(huán)病毒病(PCVD)是生產(chǎn)中常見的豬群感染不同種類豬圓環(huán)病毒(PCV)而引發(fā)的一類病毒性傳染疾病的統(tǒng)稱。PCV 是單股負(fù)鏈DNA 病毒，屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，該病毒無囊膜，目前有PCV-1、PCV-2、PCV-3 3 個(gè)基因型。其中PCV-1 發(fā)現(xiàn)于1974 年，對(duì)豬群沒有致病性[1]；PCV-2 發(fā)現(xiàn)于1998 年，不同品種、不同性別以及不同年齡的豬都具有致病性，尤其是仔豬和母豬感染后，其危害性更大，豬感染PCV-2 后可以引起免疫抑制及各器官損害，PCV-2 呈世界性分布，嚴(yán)重阻礙著全球生豬養(yǎng)殖行業(yè)高效發(fā)展[2]；PCV-3 于2016 年被首次報(bào)道，研究表明PCV-3、PCV-2 在致病性和臨床表現(xiàn)方面具有較大的相類性，但PCV-3 與PCV-2 之間無交叉反應(yīng)，故PCV-2 疫苗無法對(duì)PCV-3 提供有效保護(hù)，且PCV-3 的流行使PCV-2 的防控更加困難[3]。據(jù)報(bào)道，PCV-2 和PCV-3 是當(dāng)前我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)中對(duì)免疫系統(tǒng)有抑制作用的2 種主要疫病。2022 年3月，貴州省某養(yǎng)豬場(chǎng)仔豬發(fā)生一起斷奶仔豬多器官衰竭綜合征死亡病例，在診斷時(shí)，將臨床表現(xiàn)與PCR 診斷技術(shù)相結(jié)合,最終確定該豬場(chǎng)病例同時(shí)感染了PCV-2 和PCV-3 病毒。

1 發(fā)病情況

2022 年3 月初，貴州省某養(yǎng)豬場(chǎng)10 周齡仔豬發(fā)病，發(fā)病仔豬消化功能降低、持續(xù)性腹瀉、進(jìn)行性消瘦、生長(zhǎng)不良甚至停滯、死亡率較低，發(fā)病后曾用抗生素治療無效。經(jīng)詢問，該豬場(chǎng)接種了CSFV、PRV、PRRSV、PEDV 等疫苗，但未進(jìn)行PCV-2、PCV-3 疫苗的免疫接種。

2 臨床癥狀

臨床上病豬表現(xiàn)為精神頹廢、食欲衰退、皮膚發(fā)紺、被毛無光澤、反復(fù)腹瀉、發(fā)燒、氣喘、最后因機(jī)體脫水、消瘦、衰竭而死亡。

3 剖檢特征

解剖病死仔豬胃黏膜可見潰瘍，腎組織水腫，腸黏膜有充血和出血現(xiàn)象，脾腫大，全身多處淋巴結(jié)腫大。

4 實(shí)驗(yàn)室診斷

4.1 樣品處理

將無菌采集的病死豬腸黏膜、淋巴結(jié)、脾臟等組織與滅菌后的生理鹽水按照1∶5 的體積比例混合后，用組織勻漿機(jī)進(jìn)行研磨，并在-20 ℃條件下冷凍后再解凍，如此反復(fù)進(jìn)行3 次，然后離心15 min（12 000 r/min），離心后吸取上清，并將其保存在-20 ℃冰箱中備用。

4.2 分子生物學(xué)試劑與試劑盒

病毒基因組RNA/DNA 提取試劑盒購(gòu)于美國(guó)AXGEY 公司；DL 2000 Marker、2×Taq PCR Master Mix、一步法RT-PCR 試劑盒購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司。

4.3 引物設(shè)計(jì)與合成

設(shè)計(jì)PEDV、CSFV、PRV、PRRSV、PCV2、PCV3的特異性檢測(cè)引物[4-6]，引物信息詳見表1，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物信息表

4.4 核酸提取

取-20 ℃保存的冷凍上清液200 μL，用病毒基因組提取試劑盒提取病毒DNA/RNA，然后置于-80 ℃冰箱保存待用。

4.5 PCR/RT-PCR 擴(kuò)增

以本文4.4 中提取核酸樣品為模板，進(jìn)行PCR/RT-PCR 擴(kuò)增[4-6]，擴(kuò)增體系及反應(yīng)程序見表2，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

5 綜合診斷結(jié)果

PCR/RT-PCR 結(jié)果如圖1 所示，擴(kuò)增后PEDV、CSFV、PRV、PRRSV 4 種病毒均無任何特異性條帶，為陰性，而PCV-2 病毒在大小約為486 bp 處有特異性擴(kuò)增條帶，PCV-3 在大小約為270 bp 處有特異性擴(kuò)增條帶，故PCV-2 和PCV-3 的檢測(cè)結(jié)果均為陽性。這就從分子水平上證實(shí)臨床病料樣品中存在PCV-2 和PCV-3 的核酸，說明該豬場(chǎng)發(fā)生了PCV-2 和PCV-3 混合感染。

圖1 臨床病料樣品的PCR/RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果

6 治 療

臨床上，豬圓環(huán)病毒一般不會(huì)出現(xiàn)單獨(dú)感染的現(xiàn)象，在感染該病的同時(shí)經(jīng)常伴隨著其他疾病的發(fā)生，如豬藍(lán)耳病。因此，在治療時(shí)應(yīng)控制好其他病原，做好綜合治療。根據(jù)病情，每天給病豬注射頭孢噻呋鈉1～2 次,持續(xù)給藥3 d，注射量為3～5 mg/kg；對(duì)于10 日齡的患病仔豬還可選擇用黃芪多糖注射液稀釋過的豬白細(xì)胞干擾素來治療，每頭豬注射1 mL，對(duì)于體重為10～50 kg 的病豬可加大用量，注射量為4 mL/頭，超過50 kg 的病豬劑量為6 mL/頭，根據(jù)病情每天注射1～2 次，3 d 不間斷用藥。

7 討論

近年來，我國(guó)生豬養(yǎng)殖的規(guī)模不斷擴(kuò)大，但疫病防控技術(shù)相對(duì)落后，各種豬病呈現(xiàn)出日趨復(fù)雜的流行態(tài)勢(shì)，多種疾病同時(shí)感染發(fā)病的現(xiàn)象頻繁發(fā)生，這不僅對(duì)豬群有巨大的危害性，還使得疫病的綜合防控難度進(jìn)一步加大。

由于PCV 感染后會(huì)導(dǎo)致免疫抑制，使PCV 在臨床中更容易發(fā)生與其他致病原的混合感染或繼發(fā)感染，國(guó)內(nèi)經(jīng)常有PCV 與CSFV、PRRSV 或其他細(xì)菌性疾病發(fā)生混合感染的報(bào)道[7-10]。在致病性、臨床表現(xiàn)等方面，PCV-2 和PCV-3 具有明顯的相似性，故在臨床上必須要采用實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的方法來進(jìn)行鑒別診斷。PCR 檢測(cè)法不僅能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出致病原的核酸，還具有操作方便、簡(jiǎn)單易行、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，故該法在基層養(yǎng)殖場(chǎng)獸醫(yī)檢查中得到了廣泛應(yīng)用，因此對(duì)貴州省某養(yǎng)豬場(chǎng)的病例采用PCR 技術(shù)進(jìn)行分子水平上的鑒定,使得診斷結(jié)果更加可靠、更加準(zhǔn)確。

在本試驗(yàn)中，將臨床表現(xiàn)和PCR 檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合的方法不僅能夠準(zhǔn)確鑒別豬圓環(huán)病毒病，還能為養(yǎng)殖場(chǎng)抓住該病的最佳治療機(jī)會(huì)提供保障。同時(shí)，通過該病例的診斷也使基層獸醫(yī)工作者意識(shí)到實(shí)驗(yàn)室診斷在疫病綜合防控中的重要性，對(duì)不能確診、臨床癥狀復(fù)雜、混合感染或繼發(fā)感染的病例要果斷采用實(shí)驗(yàn)室診斷的方法進(jìn)行確診，防止因診斷不清楚而錯(cuò)失治療良機(jī)，從而帶來更大的損失。