韓帥兵，張耀中，于 淼，薛 雯，李向陽，高中華，周 力

(山東省農(nóng)藥檢定所，山東 濟南 250100)

蔥是一種常見的蔬菜或調(diào)味品，在我國各地均有種植，且種植面積及產(chǎn)量持續(xù)增長[1]，已經(jīng)成為一種比較重要的經(jīng)濟作物。蔥的生長過程中易發(fā)生紫斑病、銹病等病害，影響其產(chǎn)量和質(zhì)量。氰霜唑是對卵菌門細菌具有高度活性的新型苯基咪唑類殺菌劑，廣泛用于防治霜霉病、疫霉病、晚疫病和疫病等病害[2-5]，目前我國在大白菜、番茄、黃瓜、荔枝、馬鈴薯、葡萄、西瓜等作物上對氰霜唑進行了登記。氰霜唑于田間施用后，在植物體內(nèi)會迅速分解為4-氯-5-(4-甲苯基)-1H-咪唑-2-腈(CCIM)結(jié)構(gòu)式(圖 1)，其較母體氰霜唑更易被吸收，同時與氰霜唑相比具有更高的毒性[6]。

圖1 氰霜唑及其代謝物CCIM結(jié)構(gòu)式

關(guān)于氰霜唑在番茄、葡萄、白菜、大蒜等作物上的殘留及消解行為的研究國內(nèi)外已有諸多報道[7-12]。而氰霜唑在蔥上的殘留、消解及膳食風險評估研究至今還未見報道。本文建立了將樣品中氰霜唑及其代謝物CCIM經(jīng)乙腈提取后，用UPLC-MS/MS檢測的方法，并在山東濟南、河北定州、河南濟源、浙江紹興、云南曲靖、湖北武漢進行了100 g/L氰霜唑懸浮劑在蔥上的1年6地殘留及消解動態(tài)田間試驗，并根據(jù)所得試驗數(shù)據(jù)進行了膳食暴露風險評估，為該藥在蔥上的合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與儀器

1.1.1 供試材料 供試農(nóng)藥：100 g/L氰霜唑懸浮劑；氰霜唑標準品(純度98.9%)；CCIM標準品：(純度99.9%)。

1.1.2 儀器 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(島津LCMS-8050配有電噴霧離子源(ESI))；

萬分之一分析天平(CPA 225D)；百分之一分析天平(CP1502)；自動勻漿機(HESTIA A437)；氮吹儀(N-EVAP112)；移液器；0.22 μm有機濾膜；量筒等。

1.1.3 試劑 乙腈(色譜純)；甲醇(色譜純)；NaCl(分析純)。

1.2 田間試驗

1.2.1 試驗地點 山東濟南、河北定州、河南濟源、浙江紹興、云南曲靖、湖北武漢；試驗時間：2018年；小區(qū)面積15 m2，重復(fù)3次，隨機排列，小區(qū)間設(shè)保護帶。另設(shè)對照小區(qū)。100 g/L氰霜唑懸浮劑劑在蔥上防治紫斑病，推薦使用劑量：55～80 g/667m2(82.5～120 g a.i./ha)，噴霧處理，每季最多使用3次，施藥間隔7 d。

1.2.2 消解動態(tài) 按制劑量120 g/667m2(180 g a.i./ ha，推薦最高用量1.5倍)，于蔥生長中期開始施藥，小區(qū)面積50 m2，施藥次數(shù)1次，施藥后間隔2 h(原始沉積量)、1、3、5、7、14、21、28、35 d采集蔥樣品。另設(shè)清水空白對照。每次隨機采集≥2 kg生長正常的蔥樣本，用不銹鋼刀具切碎后充分混勻，縮分后留樣，于-20℃冰箱保存，待測。

1.2.3 最終殘留 設(shè)2個施藥劑量：低劑量和高劑量。每個處理設(shè)3次重復(fù)，每小區(qū)15 m2。低劑量按制劑量80 g/667 m2(120 g a.i./ ha)，高劑量按制劑量120 g/667 m2(180 g a.i./ ha)，各設(shè)3次和4次施藥2個處理，在蔥生長中期開始施藥，施藥間隔為7 d。采樣時間距最后一次施藥的間隔時間為7、10、14 d。另設(shè)清水空白對照。樣品采集及處理方法同消解動態(tài)。

1.3 檢測方法

1.3.1 方法原理簡述 蔥中的氰霜唑及其代謝物CCIM經(jīng)乙腈高速勻漿提取，NaCl鹽析，上清液用甲醇稀釋后，過濾膜，LC-MS/MS檢測。

1.3.2 樣品前處理 稱取蔥樣品15.00 g于具塞離心管中，加入30.0 mL乙腈，高速勻漿2 min。加入4～5 g NaCl，振蕩2 min，3 500 r/m離心5 min。移取1.0 mL上清液于玻璃離心管中，加入1.0 mL甲醇，渦旋，過0.22 μm濾膜待測。

1.3.3 分析測定條件 色譜柱：Shim-pack XR-ODS Ⅲ(2.0 mm I.D.×75 mm，1.6 μm)。

流動相：A甲醇，B 0.1%甲酸水溶液

流速及梯度：(表1)

表1 流動相流速及梯度設(shè)置

離子源：ESI；檢測方式：MRM；電離電壓：4.5 kV；碰撞氣及壓力：Ar，0.23 MPa；霧化氣流速：3.0 L/min；檢測器電壓：1.74 kV；干燥氣流速：10.0 mL/min加熱氣流速：10.0 mL/min；進樣量：0.5 μL；監(jiān)測離子對及碰撞電壓(表2)。

氰霜唑、CCIM標準溶液及試驗樣品譜圖(圖2～4)。

表2 監(jiān)測離子對及碰撞電壓

圖2 氰霜唑、CCIM標準溶液譜圖

圖3 空白蔥樣品譜圖

圖4 蔥樣品譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 線性范圍及定量限 氰霜唑和CCIM殘留量測定采用外標法定量。分別準確稱取適量氰霜唑及CCIM標準品，用甲醇配制成100 mg/L左右的氰霜唑及CCIM標準溶液，再移取適量兩種標準溶液用甲醇配制成4.0 mg/L混合標準溶液。為消除液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測樣品時的基質(zhì)效應(yīng)[13]，用空白蔥基質(zhì)溶液逐級稀釋成0.002、0.01、0.1、0.2、0.4、1.0 mg/L系列標準溶液，在上述色譜條件下進行測定，以氰霜唑及CCIM的質(zhì)量濃度與色譜峰面積分別作標準曲線。其中Y為氰霜唑或CCIM峰面積，X為標準溶液質(zhì)量濃度，結(jié)果表明，在0.002～1.0 mg/L范圍內(nèi)，氰霜唑、CCIM峰面積與質(zhì)量濃度間均成良好的線性關(guān)系(圖5)。

圖5 氰霜唑與CCIM標準曲線

氰霜唑在蔥基質(zhì)中線性方程為：Y= 1.727 12×106X+1 372.1R2=0.998 8

CCIM在蔥基質(zhì)中線性方程為：Y=810 216X+729.1R2=0.995 0

通過最小添加水平得到氰霜唑和CCIM在蔥中的定量限(LOQ)均為0.01 mg/kg。

2.2 添加回收率和精密度 在蔥空白樣品中，分別添加0.01、0.1、2.0 mg/kg 3個質(zhì)量分數(shù)水平的氰霜唑、CCIM標準溶液，每個水平重復(fù)5次，用上述分析方法測定回收率。CCIM在蔥中的添加回收率為84.6～92.0%，相對標準偏差為1.1%～2.9%(表3)；氰霜唑在蔥中的平均添加回收率為91.7%～94.3%，相對標準偏差為2.0%～2.1%(表4)，符合農(nóng)藥殘留分析標準要求。

表3 CCIM在蔥中添加回收率試驗結(jié)果

表4 氰霜唑在蔥中添加回收率試驗結(jié)果

2.3 氰霜唑在蔥中的消解動態(tài) 山東氰霜唑在蔥中的原始沉積量為2.83 mg/kg，藥后14 d消解達85.2%，藥后21 d以后樣品中殘留量均<0.01 mg/kg；浙江氰霜唑在蔥中的原始沉積量為3.46 mg/kg，藥后14 d消解達94.4%，藥后28 d以后樣品中殘留量均<0.01 mg/kg，總的來說消解速度較快。氰霜唑的殘留量(C，mg/kg)與其施藥后的取樣時間(t，d)之間呈較明顯的負指數(shù)關(guān)系，可用一級化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)方程式：Ct=C0e-kt，(其中C0為施藥后氰霜唑的原始沉積量，Ct為取樣間隔t時間的氰霜唑的濃度，k為消解速率常數(shù)，t為取樣間隔的天數(shù))來表示。山東為：C= 2.769e-0.18t，R2=0.910，T1/2=3.9 d；浙江為：C= 2.608e-0.18t，R2=0.962，T1/2=3.9 d。具體檢測數(shù)據(jù)(表5)，擬合曲線(圖6)。

表5 氰霜唑在蔥中消解動態(tài)試驗結(jié)果

圖6 氰霜唑在蔥上的消解動態(tài)曲線

2.4 氰霜唑在蔥中的最終殘留 在蔥上的最終殘留試驗低劑量按制劑量80 g/667 m2(120 g a.i./ha)和120 g/667 m2(180 g a.i./ ha)于蔥生長中期進行第1次施藥，施藥間隔期7 d，施藥3～4次，于末次施藥后間隔7、10和14 d采集蔥樣本分析測試。試驗結(jié)果如下：

采收間隔期7 d，氰霜唑殘留量為0.029～6.15 mg/kg，CCIM殘留量為<0.01～0.056 mg/kg；采收間隔期10 d，殘留量為氰霜唑殘留量為<0.01～2.01 mg/kg，CCIM殘留量為<0.01～0.014 mg/kg；采收間隔期14 d，殘留量為氰霜唑殘留量為<0.01～1.88 mg/kg，CCIM殘留量為<0.01～0.014 mg/kg。具體數(shù)據(jù)(表6、7)。

2.5 氰霜唑在蔥上的膳食風險評估 JMPR會議(2015 Evaluation)報告規(guī)定氰霜唑膳食攝入評估定義為氰霜唑與其代謝物CCIM之和[14]，則氰霜唑(含CCIM)殘留量按照以下公式進行計算：

公式中，X為氰霜唑(含CCIM)殘留量，C氰霜唑為氰霜唑殘留量，CCCIM為CCIM殘留量，當CCIM殘留量

表6 氰霜唑在蔥中的最終殘留

表7 CCIM在蔥中的最終殘留

表8 氰霜唑(含CCIM)在蔥中的最終殘留

依據(jù)2004年衛(wèi)生部發(fā)布的《中國不同人群消費膳食分組食譜》，綜合試驗所得的殘留試驗中值和已制定的最大殘留限量(MRLs)，采用以下公式進行膳食風險評估。

NEDI(mg/kg，bw)=

其中，NEDI為每日攝入量；FI為食物攝入量；STMR為試驗所得殘留中值或已制定的最大殘留限量；bw為中國居民平均體重，為63 kg；RQ為風險商，ADI為每日允許攝入量，我國規(guī)定氰霜唑的ADI值為0.2 mg/kg bw[15]。RQ值越高表示風險越高，RQ>1則表示對人類健康的風險不能接受。

基于風險最大化原則，本研究將目前氰霜唑在我國已有的登記作物均納入了膳食風險評估范圍，包括大白菜、番茄、馬鈴薯、黃瓜、葡萄等作物，這些作物中國均規(guī)定了最大殘留限量[15]。本研究根據(jù)蔥10 d采收間隔的最終殘留數(shù)據(jù)來評估氰霜唑的長期膳食風險，所用殘留中值、參考限量值及評估結(jié)果(表9)。結(jié)果表明，氰霜唑在所有登記作物中的膳食暴露風險值RQ為0.12，遠低于1。因此，氰霜唑在蔥中的殘留量對我國一般人健康風險可以接受。

表9 蔥中氰霜唑膳食風險評估結(jié)果

3 結(jié)論

研究建立了UPLC-MS/MS測定蔥中氰霜唑及其代謝物CCIM殘留量的分析方法。結(jié)果表明：氰霜唑和CCIM在蔥中的定量限(LOQ)均為0.01 mg/kg。氰霜唑在蔥中添加質(zhì)量分數(shù)為0.01～2.0 mg/kg時，平均回收率為91.7%～94.3%，相對標準偏差為2.0%～2.1%；CCIM在在蔥中添加質(zhì)量分數(shù)為0.01～2.0 mg/kg時，平均回收率為84.6%～92.0%，相對標準偏差為1.1%～2.9%。方法的重現(xiàn)性好，回收率、精密度及檢出限均可滿足該農(nóng)藥的殘留分析要求。

氰霜唑在蔥中的殘留消解符合一級動力學(xué)方程，在山東、浙江的半衰期均為3.9 d。

我國制定氰霜唑在蔥上的最大殘留限量為5 mg/kg，氰霜唑的ADI值為0.2 mg/kg bw。最后1次施藥后10 d，六地蔥中氰霜唑的殘留量為<0.01～2.01 mg/kg，均未超過我國規(guī)定的氰霜唑在蔥中的MRL值；根據(jù)膳食風險評估結(jié)果，氰霜唑日均攝入風險商值為0.12，<1，不會對一般人群健康產(chǎn)生不可接受的風險。

試驗結(jié)果：100 g/L氰霜唑懸浮劑，防治蔥紫斑病，最高制劑用藥量80 g/667 m2(有效成分120 g a.i./ha)，最多施藥3次，施藥間隔7 d，安全間隔期為10 d。