李俊輝,王琳,王芳

1.河南省洛陽正骨醫(yī)院,河南省骨科醫(yī)院,河南 鄭州 450016; 2.河南中醫(yī)藥大學,河南 鄭州 450046

類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種常見的自身免疫性疾病,以血管翳和滑膜炎為主要病理改變,導致軟骨破壞和關節(jié)變性,早期會出現(xiàn)全身多關節(jié)對稱性疼痛、腫脹、僵硬[1]。除關節(jié)病變外,還可損害關節(jié)外多器官,包括心、腎、肺、消化系統(tǒng)、眼睛、皮膚和神經系統(tǒng)等[2-3]。RA患者發(fā)生嚴重感染、骨質疏松癥、心血管疾病、死亡的風險高于普通人群,嚴重影響患者生存質量,給社會發(fā)展帶來了沉重負擔[4]。

中醫(yī)藥是中國傳統(tǒng)文化之瑰寶,源遠流長,在認識及治療本病上具有獨特的優(yōu)勢?，F(xiàn)代研究也表明,中醫(yī)藥可抑制炎癥,緩解RA癥狀,延緩關節(jié)骨損害進展[5-6]。柴胡桂枝湯出自張仲景《傷寒論》,顧名思義,該方是小柴胡湯及桂枝湯的合方,包含桂枝、柴胡、黃芩、芍藥、人參、甘草、半夏、大棗及生姜九味中藥,具有溫通經脈、和解表里、調和營衛(wèi)之功效。本方疏通三焦,太陽、少陽經同治,調達全身氣機,氣血正常運行則痹痛自除,對于RA的治療有確切的療效[7]。

但柴胡桂枝湯治療RA的作用機制尚未明確,中醫(yī)藥認識疾病的整體觀念及辨證論治理念與網絡藥理學的原則一致[8-9],網絡藥理學通過構建“疾病-基因-靶點-藥物”網絡表現(xiàn)藥物與疾病之間的關系,探討中醫(yī)治療疾病“多靶點、多成分、多途徑”的機制[10]。因此,本研究以網絡藥理學及分子對接方法為基礎對柴胡桂枝湯治療RA的有效成分、核心靶標及相關通路進行闡述,確定潛在的作用機制,為臨床應用提供理論依據及新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 柴胡桂枝湯中藥物有效成分及對應靶點篩選登錄中藥系統(tǒng)藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.Php)并檢索柴胡桂枝湯中包含的中藥成分(柴胡、桂枝、黃芩、人參、半夏、芍藥、大棗、甘草、生姜),以口服生物利用度(oral bioavailability,OB,OB≥30%)和類藥性(drug like,DL,DL≥0.18)為篩選條件收集符合條件的活性成分和對應靶點,使用perl腳本運行處理藥物有效成分與分子靶標,篩選有效靶標信息,并與Universal Protein數據庫(https://www.uniprot.org/)中經過“Reviewed”“Humam”過濾得到的有效信息比對、整理為藥物靶點ID轉化后的基因symbol信息。

1.2 RA相關靶點的獲取在Genecards、OMIM、TTD、PharmGKB、DrugBank等疾病數據庫中分別檢索關鍵詞“Rheumatoid arthritis”,其中,Genecards數據庫選擇“relevance scores”大于10的基因靶點,與其他四個數據庫靶點取交集,從而得出RA相關的疾病靶點,使用R語言venn程序包將得到的疾病相關數據進行合并,獲得交集基因的數目,并將所得疾病相關靶點數據合并、去重,得到最終的疾病靶點集。

1.3 柴胡桂枝湯-RA交集靶點的篩選使用venn程序包將中藥與疾病相關靶點取交集,獲得柴胡桂枝湯藥物有效成分中直接與疾病有關的靶點。

1.4 Cytoscape交互網絡文件準備使用perl腳本分析比對,將整理為藥物靶點ID轉化形成的symbol信息與疾病基因靶點整理為“Network”“Type”文件進行后續(xù)分析。

1.5 網絡模型的構建及分析將1.4中“Network”“Type”文件導入Cytoscape V3.8.0中對其進行可視化處理,構建疾病-藥物-成分-靶點網絡,并通過節(jié)點度值(degree)篩選其關鍵有效成分。

1.6 蛋白之間相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡構建及拓撲分析借助STRING(https://string-db.org/)數據庫,將獲得的交集靶點導入,選定物種為“Homo Sapiens”進行PPI網絡構建,交互得分閾值設定為0.9,并隱藏網絡中斷開連接的節(jié)點,將TSV數據格式文件導出并利用Cytoscape軟件對PPI網絡進行蛋白互作網絡集中性分析和評估,根據其網絡中心度進行拓撲分析,篩選得到核心靶點。

1.7 基因本體(gene ontology,GO)數據庫富集分析和京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析首先,安裝R語言BiocManager程序包,利用library(org.Hs.eg.db)進行Symbol轉為EntrezIDs的轉換,然后安裝R語言DOSE、clusterProfiler等相關程序包,對靶點交集基因ID進行GO富集與KEGG富集分析。GO富集分析包括顯著富集生物學過程(biological process,BP)、細胞成分(cell component,CC)、分子功能(molecular function,MF),并將前10項繪制成柱狀圖。KEGG富集分析繪制的氣泡圖包括顯著富集前的30條通路,據此推斷出柴胡桂枝湯作用于RA的潛在機制。

1.8 分子對接驗證通過PubChem搜索小分子配體結構2D文件,導入Chem3D軟件生成3D優(yōu)化結構,并保存為mol2格式文件,于PDB數據庫得到大分子蛋白結構,經PyMOL去除水分子和小分子配體并保存PDB格式文件,在AutoDock軟件中將大分子文件加氫處理,導出pdbqt文件,設置合適空間對接Box進行分析,導入pdbqt于OpenBabel軟件轉化為pdb格式,通過PyMOL軟件導入文件,進行可視化處理。

2 結果

2.1 柴胡桂枝湯有效活性成分及作用靶點通過TCMSP數據庫中每個藥物OB與DL值篩選,得到柴胡桂枝湯的有效成分共 263 個,結合分子靶標共14 297個,將有效活性成分所對應的靶點通過Uniprot數據庫進行標準化處理,然后選擇“Reviewed”“Human”,得到下載標準靶點名。進行匹配、刪除重復值后獲得靶點3 918個,柴胡桂枝湯靶點信息概況見表1。

表1 柴胡桂枝湯成分、靶點及數據庫匹配結果

2.2 疾病靶點和潛在靶點獲取在Genecards、OMIM、TTD、PharmGKB、DrugBank等5個疾病數據庫中分別檢索“gastroesophageal reflux disease”,其中,Genecards數據庫選擇“relevance scores”大于10的基因靶點,去除重復項目后共獲得關于RA的靶點373個,繪制韋恩圖。將得到的263個藥物活性成分與3 973個疾病靶點進行交集,取交集后獲得169個靶點,即為柴胡桂枝湯治療RA的潛在作用靶點,并繪制韋恩圖,見圖1。

注:A:疾病靶點圖;B:潛在作用靶點圖

圖2 “活性成分-靶點”網絡圖

2.3 構建中藥-活性成分-作用靶點-通路網絡運用Cytoscape V3.8.0軟件將柴胡桂枝湯中的化合物構建出柴胡桂枝湯的中藥-活性成分-靶點-通路網絡,選取degree較前的20個關鍵化合物與靶點作圖,如圖 2 所示。由結果推測,柴胡桂枝湯通過多種化學成分干預多個靶點治療RA。柴胡桂枝湯中作用于RA的主要化學成分槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、漢黃芩素(wogonin)、柚皮素(naringenin)、黃芩素(baicalein)、甘草查爾酮A(licochalcone A)等degree較大,且與多靶點連接,說明其在網絡中發(fā)揮關鍵作用,且 degree 排名前20的關鍵化合物中14個都獨立來自甘草。倒置菱形為177個靶點基因,外側圓圈以及顏色代表不同中藥在化合物成分中占比,圖中深灰色為生姜,粉色為大棗,淺藍色為柴胡,深紅色為甘草,綠色為黃芩,黃色為芍藥,深藍色為人參,紫色為半夏,淺綠色為桂枝。

2.4 構建 PPI 模型圖將藥物-疾病交集靶點基因導入STRING數據平臺獲得PPI模型,圖中共有189個節(jié)點,2 985條邊,每個節(jié)點連起來的邊代表共同基因之間的關聯(lián)度,關聯(lián)程度高低與邊的粗細成正比,節(jié)點為具體的共同基因,見圖3。

圖3 柴胡桂枝湯治療RA潛在靶點的PPI網絡圖

2.5 柴胡桂枝湯與RA相互作用核心靶基因從STRING數據平臺導出的TSV格式文件,導入到CytoScape V3.8.0,用Tools工具分析網絡拓撲屬性,用CytoNCA插件對PPI網絡進行蛋白互作網絡集中性分析和評估,以進一步分析PPI模型的核心靶基因。根據介度中心性、接近中心性、程度中心性、特征向量中心性、局部邊連通性和網絡中心性等相關指標對基因進行篩選,后續(xù)分析大于所有指標中位數的基因,經過篩選后,最后獲得核心基因分別是MYC、MAPK14、HIF1A、AKT1、CDKN1A、ESR1、STAT1、RELA、MAPK1、FOS、EGFR、CCND1、TP53、STAT3、MAPK3,見圖4。

注:初步構建的PPI網絡經兩次篩選后的潛在關鍵靶點

2.6 GO與KEGG富集分析安裝R語言程序包,將交集基因Symbol轉為EntrezIDs格式,設置P值和矯正后的P值≤0.05為過濾條件,并去除基因id為NA的基因,將柴胡桂枝湯作用于RA的169個潛在靶點進行GO分析,結果得到對外來反應的刺激(response to xenobiotic stimulus)、膜筏(membrane raft)、脫氧核糖核酸-結合轉錄因子結合(DNA-binding transcription factor binding)等2 468個生物過程、82種細胞組分和203種分子功能。選取BP、CC、MF排名前10的GO條目繪制氣泡圖。KEGG通路富集分析最終得到179條通路,選取KEGG前30的條目繪制柱狀圖,包括脂質與動脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、化學致癌的受體激活(Chemical carcinogenesis-receptor activation)、AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)等關鍵通路,見圖5。

圖5 GO富集分析氣泡圖(左)和KEGG通路分析柱形圖(右)

2.7 分子對接分析及可視化結果選取PPI網絡中degree排名前4的潛在關鍵靶點進行分子對接,活性物質與蛋白質的親和力和構象的穩(wěn)定性程度以對接分數表現(xiàn),結合能的數值越低,則兩者的結合能力越強,具體結果見表2。分子對接結果表明,ESR1與naringenin、RELA與baicalein、絲裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)14和黃芩素(baicalein)、山柰酚(kaempferol)、柚皮素(naringenin)、槲皮素(quercetin)、漢黃芩素(wogonin)的結合能均小于-5.0 kcal·mol-1,分別為-5.6 kcal·mol-1、-5.76 kcal·mol-1和-6.3 kcal·mol-1、-5.36 kcal·mol-1、-6.47 kcal·mol-1,說明基因與柴胡桂枝湯中的有效成分有著良好的結合力。利用PyMOL軟件將分子對接結果進行可視化,MAPK14與槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、柚皮素、黃芩素的3D分子對接可視化結果見圖6。

注:A:MAPK14與槲皮素;B:MAPK14與山柰酚;C:MAPK14與漢黃芩素;D:MAPK14與柚皮素;E:MAPK14與黃芩素

表2 柴胡桂枝湯治療RA中“藥物-成分-靶點”網絡中與其存在作用關系的化合物結合能

3 討論

目前,RA影響全球約0.5%～1.0%的人口[11],針對此病的藥物治療一般為非甾體抗炎藥、傳統(tǒng)風濕抗炎藥(DMARDs)及生物制劑,但應用這些也有一定的不良反應,研究表明,非甾體抗炎藥對胃腸道有較強的刺激,發(fā)生心血管疾病的風險也大大增加[12-13]。

本病屬于中醫(yī)學“痹證”范疇,因其病情復雜,病程長,后代醫(yī)家也稱其為“頑痹”“尪痹”[14]。柴胡桂枝湯主治“支節(jié)煩疼”,此與痹證表現(xiàn)一致[15],該方氣血同治,調和營衛(wèi),固衛(wèi)腠理,散風、寒、濕諸邪,扶養(yǎng)自身正氣,正強邪去則痹痛自除[16]。

本研究以網絡藥理學技術為方法探討柴胡桂枝湯治療RA的作用機制,構建的“藥物-活性成分-靶點”網絡圖提示,柴胡桂枝湯作用于RA可能是通過槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、柚皮素、黃芩素、甘草查爾酮A等核心活性成分為物質基礎實現(xiàn)的。槲皮素是一種天然類黃酮,已經廣泛應用治療自身免疫性疾病,發(fā)揮抗感染、抗氧化作用[17]。相關研究表明,槲皮素通過抑制中性粒細胞活性,促進其凋亡,降低體內炎癥細胞的水平,從而改善RA小鼠的關節(jié)炎癥表現(xiàn)[18]。山柰酚對FLS的增殖和遷移至關重要[19],通過阻斷MAPK途徑的活化來抑制類風濕性關節(jié)炎FLS的遷移和侵襲,減少炎癥反應,延緩關節(jié)軟骨的破壞[20]。漢黃芩素通過靶向作用NF-κB/MAPK信號通路,改善氧化應激標志物,從而減緩RA關節(jié)炎癥[21]。有研究提示,柚皮素、黃芩素、甘草查爾酮A均可減少炎癥細胞浸潤及滑膜損傷,抑制RA發(fā)展[22-24]。

通過PPI網絡分析和兩次篩選,最終我們得到MAPK14、HIF1A、ESR1、RELA、AKT1、MAPK1、FOS、STAT3、MAPK3等15個核心作用靶點。腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1和白細胞介素-6是參與控制RA免疫反應的促炎細胞因子,與炎癥反應和激活破骨細胞活性密切相關[25]。MAPK14、MAPK1、MAPK3均屬于MAPK家族,可以調節(jié)這些促炎細胞因子的產生,在細胞增殖、存活、凋亡和侵襲方面起著關鍵作用[26]。研究表明,RELA可以直接介導NLRP3炎癥小體活化,還可通過miR-30a作為前饋方式間接介導NLRP3的表達,經ReLA/MicroRNA-30a/NLRP3信號軸影響巨噬細胞中的NLRP3炎性小體表達,從而參與類風濕性關節(jié)炎的發(fā)生[27]。ESR1是介導雌激素發(fā)揮生物學作用的分子,動物實驗表明,miR-203負調控雌激素受體α,從而導致大鼠關節(jié)細胞炎癥聚集和加劇關節(jié)軟骨破壞[28]。許多研究提示,與男性RA患者相比,女性RA患者的預后較差,ESR1基因與關節(jié)軟骨調控密切相關,其會增加RA患者發(fā)生關節(jié)骨破壞的風險[29]。

筆者借助KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn),柴胡桂枝湯治療RA的主要通路包括脂質與動脈粥樣硬化、PI3K-Akt信號通路、化學致癌的受體激活、AGE-RAGE信號通路等通路。PI3K-Akt通路是參與多種細胞過程的最重要通路之一,可調節(jié)細胞代謝,參與生長因子及多種細胞因子的信號傳導[30]。該通路受PTEN、SHIP、TNF-α、TGF-β、TRAI等因子調控,控制RA患者關節(jié)滑膜細胞增殖與凋亡的平衡狀態(tài)[31]。研究表明,抑制 PI3K-Akt信號通路的表達可降低關節(jié)炎癥水平,抑制破骨細胞分化,起到治療RA骨破壞的效果,同時該信號通路與FLS滑膜細胞的增殖與遷移密切相關[32-33]。晚期糖基化終產物與關節(jié)炎、阿茲海默癥、糖尿病等疾病的進展密切相關,其可與AGE受體相互作用,介導NF-κB活化,誘導NLRP3炎癥小體釋放,進而引起組織炎癥損傷[34]。分子對接結果表明,藥物有效成分均可與核心靶點進行自發(fā)結合,其中,ESR1與柚皮素、RELA與槲皮素、AKT1與漢黃芩素、MAPK14與每個核心活性成分均以較高結合能結合,顯示出良好的穩(wěn)定性,提示ESR1、RELA、MAPK14、AKT1可能是柴胡桂枝湯治療RA的核心靶點。

綜上所述,柴胡桂枝湯治療RA具有多靶點、多成分、多通路的特點,其可能通過槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、柚皮素、黃芩素等核心活性成分作用于MAPK14、ESR1、RELA、AKT1、MAPK1、FOS、MAPK3等核心靶點,調節(jié)PI3K-Akt信號通路、AGE-RAGE信號通路等通路調節(jié)免疫,減輕炎癥反應,緩解類風濕關節(jié)疼痛,為臨床應用提供了理論依據。但本研究僅限于采用分子對接形式進行理論驗證,有待進一步的體外實驗加以驗證。