韓立群 ,張 捷 ,趙 鈺 ,梅 闖,馬 凱

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,烏魯木齊 830052; 2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝作物研究所,新疆特色果蔬基因組研究與遺傳改良重點實驗室,農(nóng)業(yè)部新疆地區(qū)果樹科學(xué)觀測試驗站,烏魯木齊 830091; 3.新疆林業(yè)學(xué)校,烏魯木齊 830026)

低溫作為一種非生物脅迫已經(jīng)成為世界最為嚴(yán)重的災(zāi)害之一,影響植物的生長發(fā)育,嚴(yán)重時會造成植物的死亡[1-2]。揭示植物感知低溫信號的機理對探究植物是如何避免低溫?fù)p傷十分必要[3]。目前,CBF(C-repeat binding factor)轉(zhuǎn)錄因子又稱為DREB1(Dehydration-responsive element binding factor 1),其介導(dǎo)的低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是研究最為透徹的植物低溫響應(yīng)機制[4-5]。DREB1/CBF轉(zhuǎn)錄因子編碼一個植物所特有的高度保守DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(AP2結(jié)構(gòu)域)和兩個特征序列(PKK/RPAGRTKFRETRHP和DSAWR)[6-7]。低溫脅迫下,DREB1/CBF的表達(dá)受到誘導(dǎo),結(jié)合其下游低溫應(yīng)答相關(guān)基因啟動子區(qū)域的順式作用元件,從而調(diào)控基因的表達(dá),增強植物的低溫耐受性[1, 8],其功能作用已經(jīng)在榛子(Corylusheterophylla)[9]、野扁桃(Amygdalusledebouriana)[10]、新疆野蘋果(Malussieversii)[11]、歐李(Cerasushumilis)[12]等多種果樹中得到初步驗證。

核桃(JuglansregiaL.)屬胡桃科核桃屬落葉禾木,是世界四大堅果之一,低溫會嚴(yán)重影響其正常生長發(fā)育,制約核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和經(jīng)濟效益的提高[13]。野生植物經(jīng)極端自然環(huán)境選擇,是挖掘植物優(yōu)異抗性基因的重要材料[2]。新疆野生核桃(JuglansfallaxD.)是中國珍稀野生植物資源,是新疆栽培核桃的直系祖先,在長期進化過程中形成了許多特有變異,具有很大的挖掘利用潛力[14-15]。韓立群等[16]前期研究發(fā)現(xiàn),新疆野生核桃群落中存在具有較強耐寒能力的株系。然而,關(guān)于新疆野生核桃低溫響應(yīng)關(guān)鍵基因的挖掘鮮有報道。因此,本研究以經(jīng)過初步鑒定具有較強耐寒能力的新疆野生核桃‘小矩圓核桃’類型為材料,克隆其低溫響應(yīng)關(guān)鍵基因JfDREB1A,進行生物學(xué)與表達(dá)水平分析,構(gòu)建原核表達(dá)載體并誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá),以期為揭示該蛋白在調(diào)控新疆野生核桃響應(yīng)低溫脅迫中的功能作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

試驗材料為新疆鞏留縣野核桃溝自然保護區(qū)中的‘小矩圓核桃’類型。2020-09-28,在核桃果實成熟時,收集種子,帶回實驗室置于4 ℃冰箱中沙藏3個月,然后冷水浸泡催芽,當(dāng)種子露白時播種于營養(yǎng)缽(20 cm×20 cm)中,基質(zhì)為草炭土∶珍珠巖=3∶1(體積比),每個營養(yǎng)缽點播1粒種子,共播種100粒,獲得幼苗90株。當(dāng)幼苗生長至30 cm高時,選擇生長良好且長勢一致的幼苗5株,采取頂葉下2～5片嫩葉液氮速凍,置于 -80 ℃冰箱中保存,備用;選擇幼苗35株,用于低溫脅迫下基因的表達(dá)量測定。

1.2 方 法

1.2.1JfDREB1A基因克隆 使用天根公司的植物總RNA提取試劑盒提取新疆野生核桃葉片中的總RNA,通過High Capacity cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher Scientific,上海)推薦反應(yīng)體系合成cDNA第一鏈。根據(jù)GenBank公布的核桃CBF基因(登錄號:AFV93473.1)設(shè)計引物(表1),使用PrimeSTAR GXL Premix(TaKaRa,大連)按照說明書進行PCR反應(yīng),反應(yīng)體系:PrimeSTAR GXL Premix 12.5 μL,上、下游引物0.5 μL,cDNA模板1 μL,加ddH2O水至25 μL;反應(yīng)程序:98 ℃預(yù)變性5 min,98 ℃變性10 s, 56 ℃退火15 s,72 ℃延伸60 s,30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,使用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0進行純化(TaKaRa,大連),回收的產(chǎn)物與pMD19-T載體(TaKaRa,大連)連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,測序得到新疆野生核桃JfDREB1A基因的cNDA全長序列。

表1 引物列表Table 1 List of primers

1.2.2 生物信息學(xué)分析 利用ExPASy ProtParam軟件預(yù)測JfDREB1A蛋白質(zhì)的等電點和相對分子質(zhì)量,利用Predict Protein和SMART軟件預(yù)測JfDREB1A蛋白的二級結(jié)構(gòu)和保守功能域,利用DNAMAN軟件進行同源序列分析,利用MEGA7軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3JfDREB1A基因的表達(dá)水平分析 將幼苗置于4 ℃人工培養(yǎng)箱(DLRX-450B-LED,錦玟,上海)中進行脅迫處理,時間設(shè)置為0、1、2、4、8、12和24 h,分別取頂葉下2～5片嫩葉液氮速凍,置于-80 ℃冰箱保存,備用。使用Primer 5.0設(shè)計引物,以18S rRNA作為內(nèi)參,利用qTOWER 3 G熒光定量PCR儀(Analytikjena,德國),使用SYBR Green qPCR Master Mix kit(賽維爾,武漢)方法對幼苗在低溫下的基因表達(dá)水平進行分析。qPCR反應(yīng)體系:qPCR Mix 7.5 μL,上、下游引物0.75 μL,cDNA模板2 μL,加ddH2O水至15 μL;反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,40個循環(huán),熔解曲線(95 ℃～65 ℃,0.3 ℃/15 s),3次生物學(xué)重復(fù)試驗,采用2-ΔΔCt方法計算相對表達(dá)量。

1.2.4JfDREB1A基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建 設(shè)計帶有BamHI和SalI的酶切位點引物(表1),以JfDREB1A質(zhì)粒為模板,利用高保真聚合酶TransStar KD Plus(TransGen)進行PCR擴增,按照孫偉等[17]方法進行酶切連接轉(zhuǎn)化,菌液PCR及測序鑒定陽性克隆。將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DE3感受態(tài)細(xì)胞,菌液PCR篩選陽性克隆,用于接下來的JfDREB1A蛋白誘導(dǎo)試驗。

1.2.5 融合蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 取重組菌液接種于2 mL液體LB培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12～16 h。次日使用1∶50配比轉(zhuǎn)接到10 mL現(xiàn)配LB液體培養(yǎng)基中,待菌液濃度達(dá)到OD600為0.6～0.8時(約3 h),加入(PTG(Isopropyl beta-D-thiogalacyranoside)至終濃度分別為0、0.2、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol/L, 37 ℃誘導(dǎo)4 h。0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h的pET-28a空載體作為對照。取100 μL菌液, 12 000 r/min,離心2 min,棄上清,用40 μL PBS 懸浮菌體,加入10 μL 5×SDS Loading Buffer, 95 ℃變性5 min,冷卻至4 ℃后備用。取10 μL進行12% SDS-PAGE電泳檢測,確定最適誘導(dǎo)劑濃度。

按上述方法,以終濃度0.5 mmol/L IPTG進行誘導(dǎo)表達(dá),以相同條件的pET-28a轉(zhuǎn)化菌為對照,37 ℃條件下培養(yǎng)0、2、4和6 h后分別收集菌液,進行12% SDS-PAGE電泳檢測,確定最適培養(yǎng)時間。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用Microsoft Office Excel 2019進行試驗數(shù)據(jù)分析及圖表制作,低溫脅迫下的表達(dá)水平采用SPSS 21.0軟件統(tǒng)計分析,進行One Way ANOVA和Duncan’s多重比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 JfDREB1A基因的克隆和生物信息學(xué)分析

以新疆野生核桃嫩葉cDNA為模板,通過PCR擴增獲得了DREB1A基因的編碼區(qū),長度為645 bp(圖1),相對分子質(zhì)量為23.96 ku,理論等電點為6.2。NCBI比對表明,該基因與擬南芥DREB1A同源,命名為JfDREB1A。

M.DL2000 marker; 1. JfDREB1A

利用Predict Protein和SMART軟件預(yù)測JfDREB1A蛋白的二級結(jié)構(gòu)和保守功能域,結(jié)果表明:該蛋白由214個氨基酸組成,H-螺旋占 23.36%,H-環(huán)64.02%,包含大約60個氨基酸組成的一個AP2結(jié)構(gòu)域,屬于典型的DREB1/CBF轉(zhuǎn)錄因子(圖2)。

圖2 JfDREB1A蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Schematic diagram of JfDREB1A protein structure

利用DNAMAN 9.0軟件對新疆野生核桃JfDREB1A的氨基酸序列與其他植物基因編碼序列進行多序列比(圖3),結(jié)果表明,JfDREB1A編碼蛋白與其他植物的DREB1轉(zhuǎn)錄因子具有高度同源性,其中同普通核桃的相似性為100%,JfDREB1A基因具有高度保守性。利用MEGA 7.0軟件將JfDREB1A與其他植物DREB1轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,結(jié)果發(fā)現(xiàn),JfDREB1A與普通核桃(AFV93473.1)的DREB1基因聚集在同一分支上,親緣關(guān)系最近(圖4)。

AFV93473.1.核桃; ALJ92425.1.香樟; AYM54799.1.美味獼猴桃; QDM14392.1.軟棗獼猴桃; AIX87844.1.扁桃;ADZ23479.1.白樺; ABC79626.1.毛白楊; ABR23056.1.番薯; XP_042976720.1.美國山核桃

圖4 JfDREB1A蛋白與其他物種DREB轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of JfDREB1A protein and other DREB1A transcription factors

2.2 JfDREB1A基因在低溫脅迫下的表達(dá)水平

在4 ℃低溫脅迫處理下,JfDREB1A基因在1 h時表達(dá)量即明顯上調(diào),直到8 h時達(dá)到最大,相對表達(dá)量為2.05,為對照的2.1倍,之后開始降低并保持相對恒定,處理24 h時的表達(dá)量仍高于對照(圖5)。

圖5 JfDREB1A基因在4 ℃低溫脅迫下的表達(dá)變化Fig.5 Relative expression level of JfDREB1A gene at 4 ℃

2.3 原核表達(dá)載體構(gòu)建及SDS-PAGE檢測

將JfDREB1A基因片段與pET-28a(+)表達(dá)載體連接后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DE3),成功獲得pET-28a-JfDREB1A重組表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)菌液PCR鑒定,表達(dá)載體正確(圖6)。

M.DL2000 marker; A:1.pET-28a-JfDREB1A; B:1～8.pET-28a-JfDREB1A菌液PCR

SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果如圖7所示,在誘導(dǎo)溫度為37 ℃,0.2、0.5、1.0、1.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)下,均能誘導(dǎo)出pET-28a-JfDREB1A蛋白,且與預(yù)期大小一致,而經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的對照pET-28a空載體則沒有表達(dá)(圖7)。另外,用0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)JfDREB1A重組蛋白2、4和6 h,均能誘導(dǎo)出pET-28a-JfDREB1A蛋白,在2 h時表達(dá)量達(dá)到峰值,而對照pET-28a空載體則沒有表達(dá)(圖8)。

M.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量; 1.pET-28a-JfDREB1A未誘導(dǎo); 2～5.pET-28a-JfDREB1A經(jīng)終濃度為0.2、0.5、1.0、1.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4 h; 6.pET-28a空載體經(jīng)終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4 h

M.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量; 1～4.pET-28a-JfDREB1A經(jīng)終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)0、2、4、6 h; 5～8.pET-28a空載體經(jīng)終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)0、2、4、6 h

3 討論與結(jié)論

研究植物如何響應(yīng)低溫脅迫一直是植物研究領(lǐng)域中的熱點話題,對于保障植物可持續(xù)發(fā)展有著重要的理論與實踐價值[3, 18]。植物可通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)應(yīng)激信號途徑中基因的表達(dá),從而響應(yīng)低溫逆境脅迫[19],DREB1/CBF轉(zhuǎn)錄因子能與DRE/CRT元件結(jié)合,在植物應(yīng)對低溫等非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用[1, 20-21]。本研究從新疆野生核桃中克隆得到JfDREB1A基因的cDNA全長序列,對其結(jié)構(gòu)域、進化關(guān)系、低溫脅迫表達(dá)特征及蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)等方面進行了分析。新疆野生核桃JfDREB1A基因的開放閱讀框為645 bp,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為23.96 ku,具有DREB1/CBF轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域,與普通核桃的CBF基因(AFV93473.1)聚集在同一分支上,親緣關(guān)系最近。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)受到低溫脅迫時,核桃CBF基因表達(dá)上調(diào),預(yù)測其受低溫信號調(diào)節(jié),在核桃適應(yīng)寒冷的過程中起著重要作用[22]。與同源的核桃CBF基因相似,JfDREB1A基因?qū)Φ蜏孛{迫表現(xiàn)出很強的誘導(dǎo)表達(dá)特征,4 ℃低溫脅迫1 h時表達(dá)量即明顯上調(diào),8 h時達(dá)到最大,推測JfDREB1A基因在新疆野生核桃響應(yīng)低溫過程中可能具有一定功能。

為進一步探索JfDREB1A基因在大腸桿菌(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中的高效表達(dá),構(gòu)建了pET-28a-JfDREB1A重組表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)SDS-PAGE檢測得到大小約為29 ku的融合蛋白pET-28a-JfDREB1A,與預(yù)測蛋白大小相符。原核表達(dá)融合蛋白的結(jié)果易受多種條件影響[23]。不同的蛋白,最佳誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時間也不同[24-25]。新疆野生核桃pET-28a-JfDREB1A重組蛋白在誘導(dǎo)劑IPTG終濃度為0.5 mmol/L、誘導(dǎo)時間為 2 h時表達(dá)量最高。在添加一定濃度IPTG時,IPTG濃度和表達(dá)速度成正比,新疆野生核桃pET-28a-JfDREB1A重組蛋白在2 h表達(dá)量最高,可能是由于IPTG的終濃度比上述研究濃度要高。由于原核表達(dá)受誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時間等多種條件影響,還需進一步優(yōu)化以更好地獲取目的蛋白,制備抗體、研究其功能作用。