陳文東,朱秀娟,何玉鵬,王 昱,徐永平

(1.隴南師范高等專科學(xué)校 農(nóng)林技術(shù)學(xué)院,甘肅成縣 742500;2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

催產(chǎn)素(Oxytocin,OT)是在動物機(jī)體下丘腦室旁核(Paraventricular nucleus)和視上核(Supraoptic nucleus)中產(chǎn)生的一種九肽類激素,其分泌主要受神經(jīng)反射弧調(diào)節(jié),經(jīng)神經(jīng)垂體釋放進(jìn)入血液或腦脊液中,在血液循環(huán)中以自由肽的形式存在,催產(chǎn)素的功能是通過其與催產(chǎn)素受體(Oxytocin receptor,OTR)的特異性結(jié)合激活信號通路后而實(shí)現(xiàn)的。Caldwell 等[1]發(fā)現(xiàn)了一些新的催產(chǎn)素受體表達(dá)位點(diǎn),包括內(nèi)皮細(xì)胞、胰島細(xì)胞、幾種類型的癌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨細(xì)胞和成肌細(xì)胞,這些發(fā)現(xiàn)擴(kuò)大了傳統(tǒng)催產(chǎn)素的作用不僅僅是子宮收縮和排乳反射誘導(dǎo)物的范圍,當(dāng)應(yīng)用催產(chǎn)素時(shí),這些不同位點(diǎn)的催產(chǎn)素受體表達(dá)可以激活各自組織胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[2]。最新對OTR定位數(shù)據(jù)表明,催產(chǎn)素受體在消化道內(nèi)廣泛存在,比如腸吸收上皮細(xì)胞和腸腺上皮細(xì)胞,平滑肌和腸神經(jīng)細(xì)胞特別是肌間神經(jīng)叢,催產(chǎn)素可促進(jìn)人類的胃排空,催產(chǎn)素受體抑制劑延遲人類的胃排空[3],但是,催產(chǎn)素延遲鼠的胃排空[4],表明催產(chǎn)素可以以內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的方式對胃腸道發(fā)揮 作用。

結(jié)狀神經(jīng)節(jié)(nodose ganglion,NG)中的神經(jīng)細(xì)胞為假單極神經(jīng)細(xì)胞,這些假單極神經(jīng)細(xì)胞分為兩部分,下行樹突為分布在大范圍消化道、心血管和呼吸器官的感覺神經(jīng)末梢,是迷走神經(jīng)的感覺神經(jīng)纖維成分,上行樹突(中樞突)向腦干投射[5],在胃腸道、呼吸器官和心血管內(nèi)形成的信號可以通過迷走神經(jīng)傳遞到腦干。有文獻(xiàn)報(bào)道食道、心、肺、胃和腸等內(nèi)臟傳入神經(jīng)細(xì)胞主要分布在結(jié)狀神經(jīng)節(jié)內(nèi)。賁門、幽門和胃底等部位的感覺傳導(dǎo)是通過迷走神經(jīng)完成的[6-7]。關(guān)于催產(chǎn)素通過外周神經(jīng)對內(nèi)臟活動影響的研究中,陳文東等[8-9]和任妮等[10-11]運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)分別在腹腔腸系膜前、后神經(jīng)節(jié),頸前神經(jīng)節(jié)和頸胸神經(jīng)節(jié)上發(fā)現(xiàn)了催產(chǎn)素受體的分布,并推斷催產(chǎn)素除了以分泌方式對一些內(nèi)臟器官發(fā)揮調(diào)節(jié)作用外,還有可能通過影響支配這些內(nèi)臟器官的外周交感神經(jīng)細(xì)胞活性而發(fā)揮神經(jīng)調(diào)節(jié)作用,這表明催產(chǎn)素可能通過內(nèi)臟器官反射弧上的傳出神經(jīng)纖維對內(nèi)臟器官發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。那么催產(chǎn)素是否同樣可通過與NG內(nèi)催產(chǎn)素受體特異性結(jié)合,從而通過內(nèi)臟器官反射弧上的傳入纖維對內(nèi)臟器官發(fā)揮神經(jīng)調(diào)節(jié)作用呢?本研究采用免疫組化方法檢測山羊NG內(nèi)催產(chǎn)素受體的表達(dá)分布特點(diǎn),為探索山羊NG是否具有成為OT對內(nèi)臟器官進(jìn)行內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和通過自主神經(jīng)對內(nèi)臟器官進(jìn)行神經(jīng)調(diào)節(jié)兩者相互協(xié)調(diào)作用節(jié)點(diǎn)的條件提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

楊凌農(nóng)戶養(yǎng)殖的成年關(guān)中奶山羊,雌雄各5只,健康,雌性未懷孕。

1.2 試劑及儀器

免疫組化SP超敏試劑盒和內(nèi)源性生物素阻斷試劑盒(邁新生物);一抗兔抗OTR多克隆抗體(北京康為世紀(jì));四鹽酸3,3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(金橋生物);Leica石蠟切片機(jī);顯微成像系統(tǒng)(賽默飛世爾)。

1.3 試驗(yàn)方法

頸總動脈放血致死山羊,找出頸部迷走交感干,小心分離迷走神經(jīng)和交感神經(jīng),然后順著迷走神經(jīng)向胸部找到左右兩側(cè)結(jié)狀神經(jīng)節(jié),在靠近神經(jīng)節(jié)處剪斷上下連接的神經(jīng)纖維,取下結(jié)狀神經(jīng)節(jié),迅速放入裝有4%多聚甲醛溶液的廣口瓶里固定。按陳文東等[8]方法制作石蠟切片。制作出的石蠟切片分別進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)染色,HE染色用于觀察NG組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn),其染色步驟為:脫蠟,梯度酒精復(fù)水,蘇木精染色,自來水反藍(lán),伊紅染色,酒精脫水,二甲苯透明,最后中性樹膠封片。用于免疫組織化學(xué)染色的石蠟切片分成3 組,第一組為免疫組織化學(xué)SP法染色,用于OTR陽性染色定位及圖像分析,OTR陽性著色為棕褐色、黃褐色或淡黃色,第二組為免疫組織化學(xué)SP法染色,蘇木精復(fù)染,用于觀察OTR陽性細(xì)胞分布特點(diǎn),第三組為空白對照,用于確定OTR染色的特異性。免疫組織化學(xué)SP法染色步驟為:石蠟切片經(jīng)過脫蠟,復(fù)水,抗原修復(fù)后,按免疫組化SP超敏試劑盒說明書進(jìn)行染色,試劑盒A液(內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑)、B液(羊非免疫血清)、C液(生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG)和D液(鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶)在濕盒內(nèi)分別孵育15、15、20、20 min,第一組在B液之后滴加兔抗OTR多克隆抗體(以1∶200的體積比稀釋),4 ℃冰箱過夜,D液之后加DAB顯色5 min,以上每個(gè)步驟完成后均需用0.01 mol/L PBS充分漂洗(連續(xù)3次,每次5 min)。第二組在免疫組化SP法染色后用蘇木精復(fù)染,其他步驟同SP法染色,第三組在B液孵育后滴加抗體稀釋液替代兔抗OTR多克隆抗體,其他步驟同第二組。以上切片經(jīng)常規(guī)脫水、透明、封片后,Motic生物顯微鏡下觀察,拍照,并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.4 圖片分析及統(tǒng)計(jì)分析

用motic生物顯微鏡觀察免疫組織化學(xué)染色后的組織切片,并在顯微成像系統(tǒng)下拍照。選出10張免疫組織化學(xué)切片,每張切片再隨機(jī)拍5張400×照片,用Image-pro plus 6.0對照片進(jìn)行光密度測定,操作步驟為首先設(shè)置光密度校正、測量項(xiàng)目(IOD和area)和分色選擇參數(shù),然后在Count/Size窗口選擇Manual選項(xiàng),點(diǎn)Select Colors調(diào)出segmentation工具選擇AOI (area of interest),最后點(diǎn)擊Count測定結(jié)狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的平均光密度(平均光密 度=光密度累加值IOD/目標(biāo)分布區(qū)域面積 area)[12]。用SPSS 20分析數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)表示形式為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”,用單因子方差分析(One- way ANOVA,LSD)法檢驗(yàn)比較結(jié)狀神經(jīng)節(jié)內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的OTR分布差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 HE染色結(jié)果

由圖1可知,結(jié)狀神經(jīng)節(jié)中可見神經(jīng)細(xì)胞成群分布,相對于其他細(xì)胞,神經(jīng)細(xì)胞體積較大,胞體結(jié)構(gòu)各異,各神經(jīng)細(xì)胞之間及神經(jīng)細(xì)胞與周圍組織之間邊界清晰,結(jié)構(gòu)完整,還可見部分無核神經(jīng)細(xì)胞。神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)著色為紫紅色;胞核呈圓形或卵圓形,在神經(jīng)細(xì)胞的邊緣或正中央位置,著色為藍(lán)色,少部分胞核內(nèi)可見核仁結(jié)構(gòu),染色較核質(zhì)顏色更深,此外可見到部分多核或雙核神經(jīng)細(xì)胞。神經(jīng)細(xì)胞周邊有支持細(xì)胞環(huán)繞,其形態(tài)扁平狀,結(jié)構(gòu)清晰。在眾多神經(jīng)細(xì)胞之間有神經(jīng)纖維和微血管通過,神經(jīng)纖維上包裹有雪旺細(xì)胞,胞核呈長卵圓狀;微血管內(nèi)壁上的血管內(nèi)皮細(xì)胞清晰可見,微血管管腔內(nèi)可見有少量血細(xì)胞存在,著色為紅色。

1-1.免疫組織化學(xué)SP法對照組山羊結(jié)狀神經(jīng)節(jié)HE染色;1-2.免疫組織化學(xué)SP法染色及蘇木精復(fù)染組山羊結(jié)狀神經(jīng)節(jié)HE染色;1-3.免疫組織化學(xué)SP法染色組山羊結(jié)狀神經(jīng)節(jié)HE染色;A.神經(jīng)細(xì)胞;B.神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì);C.神經(jīng)細(xì)胞胞核;D.支持細(xì)胞;E.微血管;F.血管內(nèi)皮細(xì)胞;G.過路神經(jīng)纖維;H.雪旺細(xì)胞

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

對照組切片復(fù)染結(jié)果(圖2-1)可見,神經(jīng)細(xì)胞胞體著色為淺紫色,神經(jīng)細(xì)胞胞核著色為深紫色,整個(gè)切片背景為淺藍(lán)色,沒有其他著色。試驗(yàn)組切片復(fù)染結(jié)果(圖2-2)可見,神經(jīng)細(xì)胞胞體著色為棕褐色或黃褐色,其他非神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)胞核著色為紫色,證明催產(chǎn)素受體免疫組化SP染色結(jié)果沒有非特異性著色。

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(圖2-3)可見,結(jié)狀神經(jīng)節(jié)各種細(xì)胞著色深淺不一,根據(jù)著色深淺將OTR表達(dá)分為4 個(gè)等級:棕褐色為強(qiáng)陽性;黃褐色為中等陽性;淡黃色為弱陽性;無著色為陰性。試驗(yàn)組免疫組化SP染色結(jié)果可知,結(jié)狀神經(jīng)節(jié)內(nèi)OTR免疫陽性產(chǎn)物分布廣泛,神經(jīng)細(xì)胞、過路神經(jīng)纖維、血管內(nèi)皮細(xì)胞、支持細(xì)胞和雪旺細(xì)胞均有不同程度的著色。神經(jīng)節(jié)內(nèi)著色神經(jīng)細(xì)胞大小不等,最大神經(jīng)細(xì)胞直徑達(dá)61 μm,最小直徑為32 μm(測量圖片內(nèi)有核神經(jīng)細(xì)胞,Image-pro plus 6.0測量)。神經(jīng)細(xì)胞的胞核和支持細(xì)胞著色最深,為棕褐色,OTR分布強(qiáng)陽性。大部分神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)(圖2-B)著色為黃褐色,OTR分布中等陽性,這部分神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)約占神經(jīng)細(xì)胞總數(shù)的78%。血管內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞膜,以及一小部分神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)著色較淺,為淡黃色,OTR分布弱陽性。神經(jīng)細(xì)胞胞核的核仁呈圓形,著色極淺或不著色,OTR分布陰性。

2-1.OTR的免疫組織化學(xué)SP法對照組及蘇木精復(fù)染;2-2.OTR的免疫組織化學(xué)SP法染色及蘇木精復(fù)染;2-3.OTR的免疫組織化學(xué)SP法染色;A.神經(jīng)細(xì)胞;B.神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì);C.神經(jīng)細(xì)胞胞核;D.支持細(xì)胞;E.微血管;F.血管內(nèi)皮細(xì)胞;G.過路神經(jīng)纖維;H.雪旺細(xì)胞

2.3 NG中OTR的表達(dá)量

圖像分析結(jié)果表明,結(jié)狀神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的OTR表達(dá)量極顯著大于非神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu) (P<0.01,表1)。

表1 結(jié)狀神經(jīng)節(jié)OTR免疫組化染色的平均光密度值Table 1 Mean density of OTR stained by immunohisto chemistry in nodose ganglions

3 討 論

OT是第一個(gè)被確定生物活性和化學(xué)結(jié)構(gòu)的性激素,它經(jīng)垂體后的下丘腦神經(jīng)終末進(jìn)入血液循環(huán),可以加強(qiáng)雌性動物子宮收縮和促進(jìn)乳腺排乳。Jankowski 等[13]研究發(fā)現(xiàn),大鼠皮下注射不同劑量的OT可引起血漿催產(chǎn)素濃度在生理學(xué)范圍內(nèi)升高,增加低鈉飲食大鼠的尿鈉排泄作用,且這種作用可以被OTR抑制劑所阻斷,證明OT誘導(dǎo)的鈉尿排泄是依賴OTR而實(shí)現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn),人類和大鼠的所有心臟腔室、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞[14]和腎臟[15]均有催產(chǎn)素受體存在,OT通過G1或Gq蛋白偶聯(lián)通路與這些受體相互作用調(diào)節(jié)心率和心肌收縮力、舒縮血管,以及調(diào)節(jié)腎小球的血流量。催產(chǎn)素誘導(dǎo)豚鼠胃竇平滑肌細(xì)胞放松[16],且降低狗和大鼠的胃動力[17-19]。上述資料表明,催產(chǎn)素可以直接與相應(yīng)組織器官上的催產(chǎn)素受體特異性結(jié)合而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。OTR還存在于大鼠胰腺內(nèi)胰島周邊及頸動脈體內(nèi)[20],因此,OT可調(diào)節(jié)胰島素或胰高血糖素的產(chǎn)生而間接對大鼠血糖指數(shù)產(chǎn)生影響。

有關(guān)催產(chǎn)素受體在人類體內(nèi)分布的研究發(fā)現(xiàn),催產(chǎn)素受體基因位于3p25和3p26染色體區(qū)域上,包含4 個(gè)外顯子和3 個(gè)內(nèi)含子,跨越19 210 個(gè)堿基對,其在人類下丘腦、杏仁核和海馬等“社會”腦區(qū)分布密度最大[21],單劑量催產(chǎn)素給藥時(shí)可顯著提高孤獨(dú)癥譜系障礙(ASD)患者對面部表情的識別能力、提高采訪者面部眼睛區(qū)域的注視點(diǎn)數(shù)和注視時(shí)間、增加社會注意加工等[22]。鼻吸催產(chǎn)素可以增加人類個(gè)體對面孔眼區(qū)部分的注意,增加自我知覺,提高男性的情緒共情和觀點(diǎn)采擇能力,調(diào)節(jié)人類的應(yīng)激反應(yīng),提高對morphing面孔圖片中自我面孔的識別邊界[23]。研究表明,除了盲腸和膽囊外,人類胃腸道的各部分均表達(dá)催產(chǎn)素和催產(chǎn)素受體的mRNA[24],人類催產(chǎn)素全身用藥可增加胃排空,吸入催產(chǎn)素可以使患有嚴(yán)重慢性便秘的婦女排便次數(shù)增加一倍[25]。以上資料表明,催產(chǎn)素可與人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)及外周組織內(nèi)分布的催產(chǎn)素受體特異性結(jié)合而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。此外,催產(chǎn)素受體在人的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞表面也有存在,催產(chǎn)素通過與這些受體結(jié)合而對骨代謝發(fā)揮調(diào)解作用[26-27]。

OTR在動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)分布[28],對于嚙齒動物類,OTR主要在嗅球和嗅結(jié)節(jié)、新皮層、海馬結(jié)構(gòu)、中央和外側(cè)杏仁核、伏隔核、終紋床核和下丘腦腹內(nèi)側(cè)核表達(dá)分布[29-30]。催產(chǎn)素通過與上述部位的催產(chǎn)素受體特異性結(jié)合發(fā)揮減少焦慮和壓力,促進(jìn)社會交往、孕產(chǎn)婦保健和避免條件性逃避行為。Huber 等[31]對中央杏仁核的急性腦切片應(yīng)用高度特異性的OTR激動劑,可使224個(gè)神經(jīng)細(xì)胞中21%的自發(fā)峰值頻率增加,50%的神經(jīng)細(xì)胞峰值頻率下降,且兩種反應(yīng)是完全可逆的、可重復(fù)的,而且應(yīng)用OTR阻斷劑對這種反應(yīng)具有拮抗作用。Yoshida 等[32]發(fā)現(xiàn),中縫核中相當(dāng)數(shù)量的血清胺神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)OTR,這些受體可能通過刺激血清素釋放發(fā)揮抗焦慮作用。直接將OT注入到大鼠腦室或側(cè)腦室內(nèi),動物表現(xiàn)出明顯的鎮(zhèn)痛功效,誘發(fā)丘腦束旁核內(nèi)關(guān)于痛興奮的神經(jīng)細(xì)胞放點(diǎn)頻率表現(xiàn)一定程度的降低,縮短關(guān)于痛的抑制性神經(jīng)細(xì)胞放電時(shí)間[33],以上作用均在OTR的介導(dǎo)下完成的。

催產(chǎn)素受體在外周神經(jīng)也有表達(dá)分布,GABA受體和催產(chǎn)素受體可共存于背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞膜,在動物處于某些刺激條件下的時(shí)候,垂體釋放OT與背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞膜上的OTR結(jié)合,在脊髓水平對感覺信息,特別是痛覺信息進(jìn)行調(diào)節(jié)[34]。有研究表明,催產(chǎn)素的鞘內(nèi)給藥可激活存在于脊髓交感節(jié)前神經(jīng)細(xì)胞的催產(chǎn)素受體,而起到增加心率,引起血壓輕微升高的作用[35]。支配陰莖的副交感神經(jīng)節(jié)前神經(jīng)細(xì)胞有催產(chǎn)素受體存在,催產(chǎn)素注入脊髓副交感神經(jīng)核可引起大鼠陰莖勃起,阻斷催產(chǎn)素受體可去勃起作用[36-37]。以上資料提示,催產(chǎn)素可通過與神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的催產(chǎn)素受體特異性結(jié)合,從而通過神經(jīng)細(xì)胞纖維對支配器官發(fā)揮作用。本研究通過免疫組織化學(xué)試驗(yàn)技術(shù)證實(shí),OTR免疫陽性產(chǎn)物在山羊結(jié)狀神經(jīng)節(jié)內(nèi)廣泛表達(dá)分布,且結(jié)狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的OTR陽性產(chǎn)物表達(dá)量極顯著大于其他非神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)(P<0.01)。表明催產(chǎn)素受體主要表達(dá)分布在山羊結(jié)狀神經(jīng)節(jié)內(nèi)臟感覺神經(jīng)細(xì)胞中,內(nèi)臟感覺神經(jīng)細(xì)胞具備對催產(chǎn)素刺激作出反應(yīng)的條件,提示OT發(fā)揮作用的主要靶細(xì)胞為山羊結(jié)狀神經(jīng)節(jié)中的內(nèi)臟感覺神經(jīng)細(xì)胞。盆腔和腹腔內(nèi)大多數(shù)臟器的內(nèi)臟痛覺傳入主要來自交感神經(jīng),迷走神經(jīng)感覺纖維與血管運(yùn)動反射、內(nèi)分泌反射和特殊的內(nèi)臟運(yùn)動反射等有關(guān)系[38]。NG內(nèi)的內(nèi)臟傳入神經(jīng)細(xì)胞中樞突與腦干連接,與孤束核、三叉神經(jīng)脊束核、迷走神經(jīng)背運(yùn)動核和網(wǎng)狀巨細(xì)胞核等核團(tuán)有廣泛的聯(lián)系[39]。內(nèi)臟傳入沖動可以引起內(nèi)臟活動改變,還可引起內(nèi)臟軀體反射(即引起軀體的活動)。因此,調(diào)整內(nèi)臟活動主要受源于內(nèi)臟感覺神經(jīng)沖動的改變來完成。本試驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)SP法發(fā)現(xiàn)山羊NG中催產(chǎn)素受體廣泛分布表達(dá),表明山羊NG具有OT對內(nèi)臟器官進(jìn)行內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和通過自主神經(jīng)對內(nèi)臟器官進(jìn)行神經(jīng)調(diào)節(jié)兩者相互協(xié)調(diào)作用節(jié)點(diǎn)的條件,但催產(chǎn)素通過自主神經(jīng)對內(nèi)臟器官活動產(chǎn)生什么樣的影響,還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

OTR免疫陽性產(chǎn)物在山羊NG中廣泛表達(dá)分布,且主要分布在NG內(nèi)臟感覺神經(jīng)細(xì)胞內(nèi),提示催產(chǎn)素有可能作用于NG內(nèi)臟感覺神經(jīng)細(xì)胞,從而通過內(nèi)臟反射弧的傳入神經(jīng)纖維影響內(nèi)臟器官活動,而NG可能成為OT對內(nèi)臟器官進(jìn)行內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和通過自主神經(jīng)對內(nèi)臟器官進(jìn)行神經(jīng)調(diào)節(jié)兩者相互協(xié)調(diào)作用的節(jié)點(diǎn)。