吳帥聰, 秦超, 韓曉鵬, 尹莉芳

（中國藥科大學藥學院, 江蘇 南京 211198）

隨著計算機輔助藥物設計技術的發(fā)展，新藥研發(fā)在縮短研發(fā)周期、節(jié)約研發(fā)成本、提高藥物設計命中率等方面取得了重大成果。然而目前研發(fā)的藥物化合物中約70%以上存在相對分子質量較大、水溶性較差等問題[1-2]?，F(xiàn)階段有多種技術可改善難溶性藥物的溶解度，比如藥物微粉化、環(huán)糊精包合技術、制備固體分散體、制備納米乳劑、藥物納米晶化等[3-5]。其中，納米晶技術可顯著降低難溶性藥物粒徑從而提高其飽和溶解度及溶出速率，口服給藥后使其生物利用度提高數(shù)十倍，展現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢[6]。由于人體胃腸道環(huán)境復雜，研究納米晶口服給藥后體內轉運過程常需借助相關的體外細胞培養(yǎng)模型，且目前尚不清楚納米晶是以晶體態(tài)還是游離態(tài)形式跨腸道上皮細胞轉運[7]，因此研究納米晶跨膜轉運機制對納米晶劑型設計具有指導意義。本文系統(tǒng)地介紹了藥物納米晶的制備工藝、體外細胞培養(yǎng)模型以及影響其轉運吸收的相關因素，以期幫助研究人員從分子水平上解讀納米晶體內轉運過程以及指導難溶性藥物納米晶劑型的設計。

1 納米晶簡介

藥物納米晶是指選取適宜穩(wěn)定劑制備的膠體藥物微粒分散體系，除穩(wěn)定劑外無其他藥用載體，尺寸通常小于1 000 nm[8]。藥物納米晶通常以納米混懸液的形式制備，并通過旋蒸或離心的方法除去有機溶劑，冷凍干燥后得到可重新分散的藥物微粒[9]。與制備藥物分子前藥、環(huán)糊精包合物、固體分散體以及固體脂質納米粒等工藝相比，藥物納米晶化可獲得較高的載藥量和口服生物利用度，且易于工業(yè)化生產(chǎn)。目前多種納米晶藥物被批準上市，部分上市產(chǎn)品如表1 所示。

2 制備工藝及表征

制備藥物納米晶的基本方法有2 種：Top-down法（粉碎法）和Bottom-up 法（納米沉淀法）。Top-down 法是指通過物理方法粉碎藥物粗顆粒從而得到納米級的微粒，主要手段為高壓均質（high pressure homogenization，HPH）和濕法介質研磨；Bottom-up 法的主要手段為反溶劑法，即通過超聲等物理方法制備適宜粒徑大小的微粒。上述2 種制備方法也可聯(lián)合應用。此外，研究表明藥物納米晶的理化性質對其穩(wěn)定性有顯著影響，目前有多種技術可表征藥物納米晶，其中最基本的表征為粒徑分布、Zeta 電位測定、形態(tài)學表征和晶型研究等。

2.1 制備工藝

2.1.1 Top-down 法該方法通過施加較高的物理機械能粉碎藥物顆粒制備納米晶，主要包括HPH 以及濕法介質研磨技術[12]。HPH 技術又可細分為活塞間隙型和微流化型?；钊g隙型原理是將藥物分散在含有穩(wěn)定劑的溶液中并通過高壓迫使藥物混懸液通過微小的空隙來降低藥物粒徑；微流化型原理是指利用2 組高壓氣體流碰撞藥物顆粒從而降低其粒徑。第2 代HPH 技術（Nanopure?技術）采用非水溶劑全部或部分替換水性溶劑制備藥物納米晶，避免了部分藥物在水溶液中易降解的缺陷，如采用甘油-水體系制備滿足靜脈注射等滲要求的納米混懸液。濕法介質研磨主要將藥物分散于含有穩(wěn)定劑的水相中得到粗混懸液，之后將其加入研磨機中，依靠研磨珠剪切摩擦從而降低藥物粒徑。該制備方法通常要求藥物質量分數(shù)在2% ～ 30%以內，且研磨珠的材質、數(shù)量、尺寸、碰撞速度以及研磨時間等參數(shù)均會影響納米晶的粒徑和穩(wěn)定性[13]。相較于Bottom-up 方法，Top-down 法的優(yōu)點是適用范圍廣、不含有機溶劑、制備方法靈活、批間差異小且可進行大批量生產(chǎn)。但該方法操作煩瑣，并不適用于靜脈注射藥物，故其應用受到一定限制[14]。目前大部分被批準上市的口服藥物納米晶采用了濕法介質研磨的制備工藝，如Tricor?和Avinza?等藥品[15-16]。

2.1.2 Bottom-up 法該方法常被稱作反溶劑法，是目前實驗室制備藥物納米晶的常用手段。其主要過程如下：首先將藥物溶解于有機溶劑中作為有機相，將穩(wěn)定劑溶于蒸餾水中作為水相，然后在磁力攪拌的條件下將有機相緩緩注入水相中使藥物結晶析出，探頭超聲制備納米微粒[17]。為了獲得穩(wěn)定的藥物納米晶，除了選擇合適的穩(wěn)定劑外還要篩選投藥量、有機相與水相的體積比、藥物與穩(wěn)定劑的質量比、超聲功率以及時間等參數(shù)。但該方法存在難以控制晶核形成的過程、選擇合適的有機溶劑與穩(wěn)定劑相對困難且有殘留有機溶劑的缺點，因此不易實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。目前應用超臨界流體（supercritical fluid，SCF）技術可以彌補殘留有機溶劑帶來的缺陷，其具體操作是將藥物先溶于超臨界液體中，然后通過微小空隙霧化干燥，超臨界液體因受熱氣化從而使得藥物晶體析出[18]。此法避免了有機溶劑的使用，但噴霧干燥會導致藥物顆粒粘連，無法制備穩(wěn)定的納米晶。

2.1.3 組合方法組合方法是指將Top-down 與Bottomup 方法聯(lián)合起來，利用其各自優(yōu)點制備易于工業(yè)化生產(chǎn)的藥物納米晶[19]。組合技術避免了反溶劑法中晶核增長以及濕法研磨過程中研磨時間過長的問題。美國百特（Baxter）公司申請了一項叫做NanoEdgeTM的組合方法專利，該聯(lián)用技術先通過反溶劑法制備藥物納米晶，而后通過HPH 進一步降低藥物粒徑，提高其物理穩(wěn)定性[20]。

2.2 藥物納米晶的表征

藥物納米晶的粒徑及其表面電荷影響了納米晶的理化性質，納米晶的粒徑大小是最關鍵的物理參數(shù)。一般使用動態(tài)光散射技術（dynamic light scattering，DLS）測定粒徑，同時利用多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）評估粒徑分布的均一性，PDI 的值越小說明粒徑分布越均勻。粒子的表面電荷可通過測定其Zeta 電位表征。X 射線衍射（X-ray diffraction，XRD）技術通常用來評估藥物晶體結構是否發(fā)生變化；納米晶從定形到無定形或多晶型的轉變往往通過差示熱量掃描分析（differential scanning calorimetry，DSC）測定。納米晶的形狀、粒徑以及形態(tài)通過掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）或透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）評估。SEM 表征納米晶形態(tài)需先將納米混懸液凍干，并使用凍干保護劑（如甘露醇）防止凍干過程中藥物微粒聚集。藥物納米晶的相變過程采用拉曼光譜技術表征，此外該技術也可用于藥物輔料相容性研究、納米晶表面改性研究以及定量分析等。藥物納米晶化學性質的改變以及與輔料間的相互作用還可以通過傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared，F(xiàn)T-IR）技術測定[21-23]。

3 藥物納米晶的口服吸收研究

3.1 納米晶的口服遞送概述

藥物納米晶有多種給藥途徑，如透皮給藥、靜脈注射、肺部吸入、眼部遞送和口服給藥等[24]。其中口服給藥是臨床治療的首選方案。大量研究表明藥物納米晶口服遞送可以顯著提高難溶性藥物的口服生物利用度。Nimotop?（尼莫地平片）由美國拜耳公司研發(fā)，該藥因絕對生物利用度（約13%）較低，患者必須每4 h 服用2 片（規(guī)格：30 mg），極大地降低了患者的依從性。Fu 等[25]通過HPH 的方法制備了粒徑為833.3 nm 的尼莫地平納米晶，經(jīng)口給藥后，與原研制劑相比其生物利用度顯著提高，出現(xiàn)該結果的原因為部分納米晶通過M 細胞轉運至腸系淋巴膜吸收從而避免了肝臟首過效應。Chen 等[26]采用反溶劑組合微流化的方法制備了貝沙羅汀納米晶，與對照組相比，納米晶的體外溶出速率顯著提高，大鼠藥動學實驗研究表明，貝沙羅汀納米晶顯著提高了口服生物利用度并降低了藥物的毒性和副作用。Sarnes 等[27]制備了伊曲康唑納米晶口服片劑，通過濕法介質研磨制備伊曲康唑納米混懸液后，冷凍干燥并制備片劑。相較于市售制劑Sporanox?，伊曲康唑納米晶顯示出更高的溶出速率，但大鼠藥動學研究表明，與市售產(chǎn)品相比，納米晶的口服生物利用度并未顯著提高，且其體內轉運機制尚未闡明。

3.2 體外轉運研究細胞模型的建立

借助相關的體外細胞培養(yǎng)模型可以從細胞水平深入分析藥物納米晶的轉運機制。基于Transwell 培養(yǎng)小室的體系是研究藥物轉運途徑的經(jīng)典方法。該小室由10 μm 的聚碳酸酯或聚酯膜將其分隔為上室和基底室，分別對應于腸腔黏膜以及黏膜下層?；赥ranswell 小室的細胞培養(yǎng)模型包括單一的細胞培養(yǎng)模型、共培養(yǎng)細胞模型、三重細胞培養(yǎng)模型和3D細胞培養(yǎng)模型等。

3.2.1 單一的細胞培養(yǎng)模型人克隆結腸腺癌細胞（Caco-2 細胞）為最經(jīng)典的模型。Caco-2 細胞模型可以表達多種腸道上皮細胞代謝酶，常用于測定藥物滲透性及其轉運機制的研究。通常將Caco-2細胞以1×105cells · cm-2的密度接種于12 孔的Transwell 板上培養(yǎng)約21 天，隔天測量跨膜電阻值（transepithelial electrical resistanc，TEER）來監(jiān)測細胞的生長狀態(tài)，頂端微絨毛以及緊密連接的形成是判斷該模型是否培養(yǎng)成功的標志。但因培養(yǎng)周期較長、缺少黏液層、P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）表達過高等缺點，其應用受到了限制[28]。犬腎臟上皮細胞（MDCK 細胞）模型也被用于納米晶跨膜機制的研究，其具有跨膜電阻值與小腸上皮細胞相近、培養(yǎng)周期較短等優(yōu)點，但因其為非人源性細胞且缺少相關的內吞作用途徑，其應用也受到限制[29]。單一的細胞培養(yǎng)模型無法準確研究藥物納米晶的轉運機制，通常采用細胞共培養(yǎng)模型具體研究其轉運機制。

3.2.2 共培養(yǎng)細胞模型人結腸癌細胞（HT29 細胞）在含有甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）的培養(yǎng)基中可以分化為分泌黏液的杯狀細胞，但因其生長緩慢且不表達P-gp，通常將HT29 細胞與Caco-2 細胞以1 : 9或3 : 7 的比例建立共培養(yǎng)細胞模型，研究藥物納米晶的跨膜轉運機制[30-31]。該共培養(yǎng)細胞模型具有黏液層，且緊密連接更加松散，通透性更加接近人體胃腸道細胞，因此常被用于研究藥物納米晶與黏膜之間的相互作用。該模型的不足之處是黏液層覆蓋不均勻，導致共培養(yǎng)模型中出現(xiàn)無黏液層覆蓋的Caco-2 細胞。

3.2.3 三重細胞培養(yǎng)模型有研究表明建立Caco-2/HT29-MTX/Raji-B 細胞共培養(yǎng)模型可以精確模擬人體胃腸道細胞[32]。Raji-B 細胞為人Burkitt,s 淋巴瘤細胞，其可誘導部分Caco-2 細胞分化為M 細胞，M 細胞是抗原采集樣細胞，可以介導藥物微粒、細菌和生物大分子等的轉運，常被視作口服納米粒的重要轉運通路。將HT29-MTX 和Caco-2 細胞以1 : 9或3 : 7 的比例接種于Transwell 上室，培養(yǎng)至14 天后，向下室加入Raji-B 細胞可以誘導上室的Caco-2 細胞分化為M 細胞。由于M 細胞的TEER 小于Caco-2細胞，所以通過檢測TEER 可以判斷三重細胞培養(yǎng)模型是否成功建立。當TEER 降低至200 ～ 250 Ω · cm2時可認為模型建立成功[32]。

3.2.4 3D 細胞培養(yǎng)模型與上述細胞模型相比，3D細胞培養(yǎng)模型可以精準模擬體內細胞存活的微環(huán)境，從而提供更加可靠的分子生物學信號，比如：提供代謝分析、腫瘤特征、細胞間相互作用機制和干細胞研究等。然而3D細胞培養(yǎng)技術因可操作性難度大、原代細胞容易喪失活性、培養(yǎng)支架基質膠材料較為昂貴等因素，使得該模型培養(yǎng)技術開展受限、操作風險高且重現(xiàn)性較差[33]。隨著3D 細胞培養(yǎng)模型技術的不斷發(fā)展，相信在不久的將來，3D 細胞培養(yǎng)模型會成為研究體外細胞實驗的主要手段。

3.3 影響藥物納米晶口服轉運機制的因素

一般而言，影響藥物納米晶吸收機制的主要因素為：藥物的飽和溶解度以及溶出速率、黏膜的吸附作用、藥物在黏液層中的擴散、跨膜轉運途徑以及穩(wěn)定劑種類等[34]。

3.3.1 飽和溶解度及溶出速率納米晶技術可提高藥物的飽和溶解度及溶出速率，在腸道上皮細胞處形成較高的藥物濃度梯度，從而促使藥物以游離或晶體形式跨膜轉運。根據(jù)Ostwald-Freundlich 方程可知，藥物粒徑減小，藥物的飽和溶解度增加；根據(jù)Noyes-Whitney 方程可知，藥物飽和溶解度增加會導致其在胃腸道的溶出速率增加[35]。此外，通過改變納米晶的粒徑、晶型、形狀等因素可以顯著影響藥物的飽和溶解度及溶出速率。因此納米晶憑借較低的粒徑以及較大的表面積顯著提高了難溶性藥物的口服生物利用度。Song 等[36]制備了美洛昔康納米晶速溶舌下膜劑（meloxicam-nanocrystals-fast dissolving sublingual films，MLX-NS-FDSFs）， 該納米晶粒徑為（196.4 ± 6.3）nm，極大地提高了美洛昔康的飽和溶解度和溶出速率；與美洛昔康粗混懸液相比，美洛昔康納米晶的體外溶出速率顯著提高；大鼠藥動學實驗表明，舌下給予MLX-NSFDSFs 后，與美洛昔康粗混懸液膜劑相比，達峰時間（Tmax）顯著縮短且生物利用度提高了3.0 倍。Seto 等[37]采用反溶劑法制備了平均粒徑為230 nm的葉黃素納米晶，與葉黃素粗混懸液相比，其在水中的飽和溶解度顯著提高；大鼠藥動學研究表明，其相對生物利用度提高了15.2 倍。

3.3.2 黏膜吸附黏液層主要由高度糖基化的黏蛋白組成，在胃腸道中起到了保護和潤滑的作用，其可以與藥物顆粒之間相互作用形成致密的網(wǎng)狀結構，而藥物與黏液層之間的吸附以及黏液層的厚度對藥物的口服吸收產(chǎn)生影響[38]。藥物納米晶通過靜電吸引、氫鍵和范德華力等作用機制增強了納米晶與黏膜之間的相互作用，從而延長了藥物在胃腸道的保留時間。但較強的吸附作用使得部分藥物納米晶無法轉運至腸道上皮細胞中，導致其口服生物利用度降低。與游離藥物相比，納米晶因其較小的粒徑可以與黏液層之間形成儲庫，合適的穩(wěn)定劑可以避免黏液粘連，從而提高藥物在黏液層中的穿透能力。Soisuwan 等[39]分別使用泊洛沙姆407、泊洛沙姆407 和月桂基硫酸鈉 （sodium lauryl sulfate，SLS）、泊洛沙姆407 和十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）作為穩(wěn)定劑，制備了電中性、帶負電荷以及帶正電荷的克拉霉素納米晶。通過Caco-2 細胞模型研究得知，與電中性和帶負電荷的納米晶相比，帶正電荷的納米晶具有更強的黏膜粘附力，且藥物滲透量更高。分析其原因可能是黏膜層帶負電，帶正電荷的納米晶與黏膜層通過靜電吸引可產(chǎn)生更強的粘附力，進而提高了納米晶的藥物滲透量。Ueda 等[40]選擇用羥丙甲纖維素（hydroxy propyl methyl cellulose，HPMC）作為穩(wěn)定劑并采用濕法介質研磨技術制備非諾貝特納米晶；研究發(fā)現(xiàn)HPMC 可以作用于黏蛋白而改善非諾貝特與黏液層之間的滲透性，從而促進藥物在黏液層中的擴散；此外還發(fā)現(xiàn)當使用較低相對分子質量的HPMC 時會增加非諾貝特納米晶柔韌性并抑制其與黏液層的相互作用。

3.3.3 跨膜轉運途徑近年來，藥物納米晶是否以完整的晶體形式跨膜轉運成為研究的熱點，圖1 簡述了目前常見的幾種納米晶跨膜轉運途徑。大量研究表明，內吞作用是納米晶進入腸道上皮細胞的主要機制，納米晶的體內轉運途徑復雜，內吞入胞后還可能伴有轉胞吞、胞吐等過程。內吞作用的主要機制有網(wǎng)格蛋白介導、小窩蛋白介導、脂筏介導以及巨噬細胞介導[41]。此外，高爾基體、溶酶體、M 細胞以及內體等也參與了納米晶胞內轉運的過程。其中M 細胞介導的納米晶轉運過程至關重要。M 細胞位于派爾集合淋巴結（Peyer’s patch）表面的濾泡相關上皮（follicle-associated epithelial，F(xiàn)AE）中，M細胞在胃腸道中的含量極少（＜1%），但M 細胞作為抗原采樣細胞具有良好的轉運功能，可以轉運病毒、抗原、細菌以及各種藥物微粒等。Shen 等[42]的研究表明，M 細胞可以識別并轉運完整的雜化槲皮素納米晶，并將其轉運至腸系膜淋巴管中從而提高口服生物利用度；Ma 等[43]制備了表面由聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]修飾的納米微球，包裹蛋白質口服遞送，研究發(fā)現(xiàn)該納米?？杀籑 細胞識別并轉運至淋巴吸收；根據(jù)Liu 等[44]的研究發(fā)現(xiàn)，完整的卡維地洛納米晶可以通過M 細胞轉運，避免了肝臟首過效應從而極大地改善了其口服生物利用度。

圖1 藥物納米晶的轉運途徑概況Figure 1 Trans-epithelial pathways of drug nanocrystals

3.3.4 穩(wěn)定劑的影響穩(wěn)定劑的主要功能是防止藥物微粒的聚集，提高藥物納米晶的穩(wěn)定性。穩(wěn)定劑的種類包括離子型[如：殼聚糖和SLS]和非離子型（如：HPMC 和F127）兩大類。對于離子型穩(wěn)定劑而言，維持穩(wěn)定的主要機制為靜電排斥；對于非離子型穩(wěn)定劑而言，穩(wěn)定劑可以在藥物微粒之間形成保護膜，依靠空間位阻效應維持穩(wěn)定。穩(wěn)定劑還可以通過提高藥物的飽和溶解度及溶出速率、增強藥物與黏膜之間的粘附、打開細胞的緊密連接以及抑制P-gp 轉運等方式促進納米晶跨腸道轉運。例如，Ullah 等[45]采用HPMC-聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）和HPMC-聚丙烯酸樹脂（Eudragit，EUD）組合作為穩(wěn)定劑，采用反溶劑法制備了難溶性藥物右旋布洛芬（dexibuprofen，Dexi）納米晶。實驗結果表明：Dexi 原料藥在水中和該穩(wěn)定劑溶液中的飽和溶解度分別為（51.0±2.0）和（92.0±3.0）mg · L-1，而采用該穩(wěn)定劑制備的Dexi 納米晶的飽和溶解度顯著增加至（270.0±3.5）mg · L-1；與Dexi原料藥和上市片劑相比，Dexi 納米晶的溶出速率也顯著提高。又如，Shweta 等[46]開發(fā)了新型泊洛沙姆接枝殼聚糖（Pluronic -grafted- chitosan，Pl-g-CH）共聚物，并將其作為功能性穩(wěn)定劑制備了紫杉醇納米晶；體外Caco-2 單層細胞模型實驗發(fā)現(xiàn)，與紫杉醇相比，用該穩(wěn)定劑制備的紫杉醇納米晶極大地提高了紫杉醇在Caco-2 細胞內的累積量，且TEER 值明顯下降，后者表明該穩(wěn)定劑能夠打開細胞間的緊密連接，從而促進藥物的細胞旁轉運。再如，P-gp廣泛存在于各種細胞表面，其主要功能是識別并轉運外來異物，使機體免受有毒物質的侵害。紫杉醇是典型的難溶性藥物，同時也是P-gp 的底物，通過選取具有P-gp 抑制作用（如Tween80）的穩(wěn)定劑制備紫杉醇納米晶可以較好地改善其口服生物利用度。據(jù)Sharma 等[47]報道，HPH 研磨制備的Tween80 紫杉醇納米晶可以有效抑制紫杉醇的外排轉運；大鼠藥動學實驗研究表明，其口服生物利用度較紫杉醇納米晶提高了約12.5 倍。Du 等[48]以具有P-pg 抑制作用的維生素E 聚乙二醇琥珀酸酯作為穩(wěn)定劑，濕法介質研磨制備的難溶性藥物穿心蓮內酯納米晶也被證實抑制了藥物的P-gp 外排轉運；大鼠藥動學實驗結果發(fā)現(xiàn)，與對照組HPMC-E5 制備的穿心蓮內酯納米晶（E5-NCs）相比，其具有更高的達峰濃度（Cmax）及血藥濃度-時間曲線下面積（AUC0-24h）。

4 總結與展望

藥物納米晶技術可以有效降低藥物粒徑，顯著提高藥物飽和溶解度以及溶出速率，從而促進其跨腸道上皮細胞轉運。盡管通過Caco-2，HT29-MTX和MDCK 等單層細胞模型以及Caco-2/HT29-MTX和Caco-2/HT29-MTX/Raji-B 等多重細胞培養(yǎng)模型可以研究納米晶口服給藥后的體內轉運過程，但仍無法定量考察藥物納米晶口服吸收時游離態(tài)和晶體態(tài)的比例。由于藥物間理化性質存在差異，且藥物納米晶經(jīng)胃腸道吸收入血過程復雜，根據(jù)胃腸道生理結構精準設計藥物納米晶劑型具有較大挑戰(zhàn)。隨著分子生物學的發(fā)展，相信在未來會有更加精準的細胞培養(yǎng)模型從分子水平上分析口服藥物納米晶的跨腸道轉運機制。