趙 瑩,游普云,盛譽妍,高 璐,朱奎成,何美霞

1)鄭州大學醫(yī)藥科學研究院 鄭州 450052 2)鄭州大學醫(yī)學科學院 鄭州 450052

順鉑是腫瘤化療的主要藥物之一,但腎毒性和骨髓抑制毒性影響了其在臨床上的應用[1]。目前對于順鉑不良反應的處理手段十分有限,急需有效的藥物。生物活性肽是一類來源于動植物并具有生物活性的肽類物質,其作用主要包括抗氧化、調(diào)節(jié)血壓、降低膽固醇、抑菌、抗腫瘤和提高免疫力等[2]。本研究通過制作小鼠順鉑腎損傷模型,研究白蛋白肽、小麥低聚肽、大豆肽和玉米低聚肽這4種生物活性肽對順鉑不良反應的影響,同時探討其藥理活性與抗氧化作用的關系,旨在為生物活性肽類的開發(fā)和臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑與儀器C57BL/6雄性小鼠,SPF級,6～8周齡,體重160～170 g,許可證號:SCXK(豫)2017-0001,由河南省實驗動物中心提供。順鉑(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司),尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒和總蛋白定量試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;ATP含量檢測試劑盒和超微量Na+,K+-ATP檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。YQ-3 型電動漩渦勻漿機(江蘇江陰周莊科研器械廠),IMark 酶標儀(北京友華照欽醫(yī)療器械有限公司),ULTRA-TURRAX高速分散機(德國IKA公司),Pentra 80全自動血細胞計數(shù)儀(日本HORIBA公司),透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司),超聲波粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 實驗分組及給藥將42只C57BL/6雄性小鼠采用隨機數(shù)字表法均分為6組(n=7):正常對照組、順鉑模型組、白蛋白肽組、小麥低聚肽組、大豆肽組、玉米低聚肽組。4種生物活性肽組每天先以4 mg/kg劑量腹腔注射順鉑,30 min后以600 mg/kg劑量灌胃給予活性肽,隔天1次;順鉑模型組每天以4 mg/kg劑量腹腔注射順鉑,30 min后灌胃給予等體積的蒸餾水,隔天1次;正常對照組每天腹腔注射等體積的生理鹽水。以上處理持續(xù)5 d,共注射3次。

1.3 外周血白細胞計數(shù)(WBC)和血小板計數(shù)(PLT)的檢測在各組小鼠給藥后第6天,眼內(nèi)眥靜脈取血約1 mL,加EDTA抗凝,用血細胞計數(shù)儀檢測WBC、PLT。

1.4 血清中BUN、Scr、GSH含量和CAT活性的檢測將1.3中所取靜脈血離心取血清,按照試劑盒說明操作,檢測BUN、Scr、GSH含量和CAT活性。

1.5 腎臟MDA含量和SOD活性的檢測給藥后第6天,將小鼠頸椎脫臼處死后分離左側腎臟,稱取0.1 g腎臟皮質組織塊置于0.9 mL生理鹽水中,用勻漿機制備組織勻漿,向組織勻漿中加入1.5 mL組織裂解液,2 min后4 ℃、2 000 r/min離心15 min,取上清液,按試劑盒說明操作,檢測MDA含量和SOD活性。

1.6 腎臟線粒體中ATP含量和Na+,K+-ATP活性的檢測取1.5中離心后的沉淀物,按照試劑盒說明操作,檢測ATP含量和Na+,K+-ATP活性。

1.7 腎組織病理學觀察及腎損傷評分對小鼠腎臟冠狀位前1/2組織進行脫水、透明、包埋、切片,行PAS染色。每個切片選擇5個區(qū)域,在顯微鏡下觀察腎小管和腎小球的形態(tài)結構。腎小管擴張、刷狀緣脫落、腎細胞壞死、空泡化等為腎組織損傷表現(xiàn)。根據(jù)損傷面積進行腎損傷評分。0分:無損傷;1分:損傷面積<10%;2分:損傷面積10%～;3分:損傷面積25%～;4分:損傷面積50%～;5分:損傷面積>75%。

1.8 統(tǒng)計學處理采用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)分析。各組間所有指標的比較均采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組小鼠外周血WBC和PLT的比較結果見表1。由表1可知,與正常對照組相比,順鉑模型組小鼠WBC、PLT降低;與順鉑模型組相比,4種生物活性肽組小鼠WBC、PLT增加。

表1 各組小鼠外周血WBC和PLT的比較(n=7)

2.2 各組小鼠血清中BUN、Scr、GSH含量和CAT活性的比較結果見表2。由表2可知,與正常對照組相比,順鉑模型組小鼠血清中BUN、Scr含量升高,GSH含量和CAT活性降低;與順鉑模型組相比,4種生物活性肽組小鼠BUN、Scr含量降低,GSH含量和CAT活性升高。

表2 各組小鼠血清中BUN、Scr、GSH含量和CAT活性的比較(n=7)

2.3 各組小鼠腎臟中MDA含量和SOD活性的比較結果見表3。由表3可知,與正常對照組相比,順鉑模型組腎臟中MDA含量升高,SOD活性下降;與順鉑模型組相比,4種生物活性肽組MDA含量均下降,SOD活性均上升。

表3 各組小鼠腎臟中MDA含量和SOD活性的比較(n=7)

2.4 各組小鼠腎臟線粒體中ATP含量和Na+,K+-ATP活性的比較與正常對照組相比,順鉑模型組小鼠線粒體/ATP含量和Na+,K+-ATP活性均降低;與順鉑模型組相比,4種生物活性肽組線粒體中ATP含量和Na+,K+-ATP活性均升高(表4)。

表4 各組小鼠腎臟線粒體中ATP含量和Na+,K+-ATP活性的比較(n=7)

2.5 各組小鼠腎組織病理學表現(xiàn)和腎損傷評分的比較結果見圖1和表5。正常對照組小鼠腎小管形態(tài)完整,排列整齊。順鉑模型組小鼠腎小管上皮細胞出現(xiàn)水腫、壞死,并向管腔內(nèi)脫落,管腔狹窄。4種生物活性肽組小鼠腎小管上皮細胞水腫現(xiàn)象均明顯減輕,結構也較為完整。與正常對照組比較,順鉑模型組腎損傷評分升高;與順鉑模型組相比,4種生物活性肽組腎損傷評分均降低。

A:正常對照組;B:順鉑模型組;C:白蛋白肽組;D:小麥低聚肽組;E:大豆肽組;F:玉米低聚肽組

表5 各組小鼠腎損傷評分的比較(n=7)

3 討論

順鉑是臨床上應用廣泛且療效可靠的廣譜抗腫瘤藥物,具有明顯的腎毒性和骨髓抑制毒性[3]。順鉑的腎毒性主要表現(xiàn)為腎小管上皮細胞急性壞死、變性及腎間質水腫等,大劑量或連續(xù)用藥可導致腎功能衰竭甚至死亡[4];順鉑的骨髓抑制毒性主要表現(xiàn)為WBC和PLT減少[5]。本實驗中在小鼠腹腔注射順鉑后,腎毒性和骨髓抑制毒性指標明顯改變,表明小鼠順鉑腎毒性和骨髓抑制毒性模型復制成功。此外,研究[6]發(fā)現(xiàn)氧化應激與順鉑的毒性有關。血清中GSH含量和CAT活性、腎組織中MDA含量和SOD活性可以反映抗氧化能力的變化。在本實驗中,順鉑可以導致小鼠血清中GSH含量、CAT活性和腎組織中SOD活性降低,腎組織中MDA含量升高,進一步說明了順鉑所致腎損傷可能與氧化應激反應有關。

目前臨床上針對順鉑的骨髓抑制毒性,大多采用提升WBC和PLT等藥物,但這類藥物不僅價格高,而且本身就有較多的不良反應,如肌肉骨骼系統(tǒng)毒性和消化系統(tǒng)毒性,甚至還可能造成休克和間質性肺炎等[7]。白蛋白肽、小麥低聚肽、大豆肽和玉米低聚肽這4種生物活性肽具有抗氧化、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等生物活性[8],可通過清除ROS、降低MDA含量和增強抗氧化酶的活性[9-10]等途徑,減輕氧化應激損傷。此外,它們還有安全性高、易于吸收、來源廣泛以及價格低廉等優(yōu)點[11]。在本研究中,給予這4種生物活性肽后,模型小鼠外周血WBC、PLT提升,血清中BUN、Scr含量降低,血清中GSH含量、CAT活性以及腎組織中SOD活性和腎線粒體中ATP含量、Na+,K+-ATP活性升高,腎組織中MDA含量下降,表明這4種生物活性肽均對順鉑導致的骨髓抑制有明顯的緩解作用,而且可以提高小鼠的腎功能,改善腎小管損傷和腎臟線粒體損傷。

結合實驗結果可以推測,這4種生物活性肽緩解順鉑所致腎損傷和骨髓抑制毒性可能與以下機制有關。①自由基清除作用:肽鏈上的組氨酸殘基可作為氫的受體直接清除自由基,還能與Fe3+螯合減少活性氧自由基的生成[12];芳香族氨基酸如酪氨酸和苯丙氨酸往往通過向缺電子自由基提供質子來清除單線態(tài)氧,主要是氧自由基和超氧陰離子自由基[13];此外,還可能通過氧化應激通路促進組織中SOD活性的提高,加速ROS的清除,有效降低體內(nèi)的氧化水平[14]。②抗脂質過氧化作用:肽末端含有疏水性氨基酸,能提供疏水環(huán)境,增強肽與不飽和脂肪酸的作用,從而有效促進膜脂過氧化[8]。自由基被清除也可減弱生物膜的過氧化反應[15],進而減輕順鉑所致的腎損傷。③改善線粒體功能:氧化應激產(chǎn)生過多的氧自由基,可引發(fā)堿基配對錯誤和鏈斷裂等線粒體損傷,以及線粒體膜脂質過氧化導致的線粒體功能障礙[11]。4種生物活性肽可使小鼠腎臟線粒體中ATP含量和Na+,K+-ATP活性升高,維持其正常的膜通透性和膜電位。④增強機體免疫功能:4種生物活性肽緩解骨髓抑制毒性的作用機制可能與增加T淋巴細胞數(shù)量有關[5,8],還需要進一步深入的研究。

總之,本研究證實了白蛋白肽、小麥低聚肽、大豆肽和玉米低聚肽這4種生物活性肽均能明顯減輕順鉑所致的小鼠腎毒性和骨髓抑制毒性;同時,這4種生物活性肽可改善腎臟線粒體損傷,降低腎組織氧化應激水平。