◎宋佳盛，李 彤，李勝南，劉貴銘，?，摤摚瑒ⅧP海

（牡丹江醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011）

尼卡巴嗪屬于二硝基類抗球蟲藥，是4,4-二硝基均二苯脲（DNC）和α-羥基-4,6-二甲基嘧啶（HDP）復(fù)合物，主要用于預(yù)防雞柔嫩艾美耳球蟲和堆型、巨型、毒害、布氏艾美耳球蟲，尼卡巴嗪進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)HDP排泄迅速，DNC排泄緩慢起主要抗球蟲作用[1]。地克珠利和托曲珠利是均三嗪類的高效、廣譜、的抗球蟲藥，可有效預(yù)防和治療雞、兔、羊和豬等禽畜艾美耳寄生蟲病。其中，地克珠利進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)不易分解，主要以原體抑蟲，而托曲珠利在動(dòng)物體內(nèi)可快速磺化成為妥曲珠利砜，起到抗球蟲作用。二硝基類和均三嗪類抗球蟲藥具有較強(qiáng)的治療效果，但由于其半衰期較短，頻繁用藥導(dǎo)致食品中藥物代謝物殘留增加影響食品安全，危害人體健康。歐盟和中國(guó)均頒布食品安全標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)雞肌肉、皮和脂肪及肝、腎中這3種抗球蟲藥物代謝物最大殘留限量做了明確的規(guī)定[2]。因此，使用時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照用法用量，并遵守停藥期，以避免食品中超標(biāo)殘留。

抗球蟲藥代謝物殘留量的檢測(cè)方法有免疫法[3]、液相法[4]、液質(zhì)聯(lián)用法[5]法，其中，免疫分析法往往需要制作相應(yīng)復(fù)雜的抗體，存在準(zhǔn)確率不高等缺點(diǎn)。液相色譜法儀器操作簡(jiǎn)單，可以同時(shí)檢測(cè)多種抗球蟲藥物，但靈敏度僅能達(dá)到1 ug/kg。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法中推薦的首選方法，靈敏度高可達(dá)1 ng/kg，檢出限低，完全能夠滿足實(shí)際需要[6]。實(shí)驗(yàn)采集不同地區(qū)雞肌肉樣品，選用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)樣品中尼卡巴嗪、地克珠利、托曲珠利的代謝物殘留量分析，結(jié)果令人滿意。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

尼卡巴嗪（4,4-二硝基均二苯脲）、地克珠利、托曲珠利砜（北京TMstandard科技股份有限公司）、乙腈、甲醇，其余所用試劑均為分析純，水為超純水，現(xiàn)用現(xiàn)制。

AB SCIEX 4500型三重四極桿質(zhì)譜儀（AB SCIEX公司 美國(guó)）；UltiMate3000型高效液相色譜儀（Thermo公司 美國(guó)）；204E型電子天平（METTLER TOLEDO公司 德國(guó)）；QC10260超聲清洗儀（天津旗美公司）；4型渦旋混合器（IKA公司 德國(guó)）；3-18型高速冷凍離心機(jī)（Sigma公司 德國(guó)）；PureLab Classic超純水器（ELGA公司 英國(guó)）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

稱取尼卡巴嗪（以4,4二硝基均二苯脲計(jì)）、地克珠利、托曲珠利、托曲珠利砜標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg（精確至0.1 mg，按純度值折算）。用甲醇溶解并定容至10 mL，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液質(zhì)量銥度為1 000 mg/L。-20 ℃以下避光貯存，保存期為12個(gè)月。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)中間液

分別準(zhǔn)確量取100 μL尼卡巴嗪（4,4二硝基均二苯脲）、地克珠利、托曲珠利、托曲珠利砜標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋至10 ml ，質(zhì)量濃度為10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液，-20 ℃避光保存，180 d內(nèi)有效。

1.2.3 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液Ⅰ

分別準(zhǔn)確量取100 μL托曲珠利-d3溶液，用甲醇稀釋為10 mL,質(zhì)量濃度為1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液，-20 ℃避光保存，180 d內(nèi)有效。

1.2.4 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液Ⅱ

準(zhǔn)確內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液Ⅰ1 mL ，用乙腈定容至10 mL，標(biāo)準(zhǔn)使用液質(zhì)量濃度為0.1 mg/L，4 ℃貯存，保存期為30 d。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)使用液

配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，目標(biāo)化合物濃度分別為0.2 μg/L、0.5 μg/L、10 μg/L、50 μg/L 和100 μg/L，內(nèi)標(biāo)濃度為5 μg/L。

1.3 試樣制備

選取200 g用均質(zhì)器混合均勻，-4 ℃以下保存?zhèn)溆?。稱取均質(zhì)試樣2.00 g，置于50 mL聚丙烯離心管中，準(zhǔn)確加入50 uL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液Ⅰ，加入2 mL水渦旋混勻，再加入10 mL乙腈，旋渦混合30 s超聲提取20 min。10 000 r/min離心10 min（-5 ℃)。在15 mL離心管內(nèi)加入250 mg DSC-18和2 g無水硫酸鈉，再加上述上清6 mL，轉(zhuǎn)速9 000 r/min 離心時(shí)間5 min，最后取上清液1 mL用于HPLCMS/MS測(cè)定。

1.4 儀器工作條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱Kinetex F5 C18（Phenomenex 美國(guó)），50 mmx3 mm、2.6 μm；柱溫設(shè)置20 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流動(dòng)相：A 水，B 乙腈。液相色譜梯度洗脫條件表見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件表

1.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源：離子源溫度為500 ℃；毛細(xì)管電壓為5.5 kV；脫溶劑氣溫度為550 ℃；脫溶劑氣流量為40 psi ；掃描模式：多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM )。其它質(zhì)譜參數(shù)表見表2。

表2 目標(biāo)化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)表

2 結(jié)果

2.1 提取過程的優(yōu)化

2.1.1 選取提取溶劑

選擇正己烷、乙腈、三氯甲烷、二甲基亞砜和丙酮等5種有機(jī)溶劑對(duì)雞肉和雞蛋中地克珠利進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)提取效率分別為98.4%、80.9%、76.3%、69.6%、57.7%。因此，選擇乙腈作為提取溶劑。

2.1.2 提取溫度的選擇

選擇5、0、-5 ℃低溫冷凍條件下樣品提取，提取效率分別為99.2%、97.4%和92.3%，選擇-5 ℃作為提取溫度。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相的選擇

使用甲醇-水和乙腈-水2種流動(dòng)相，對(duì)托曲珠利和內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行分離。由圖1可以看到，使用乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)物的信號(hào)強(qiáng)度更高，干擾信號(hào)更低。因此，選擇乙腈-水作為最佳流動(dòng)相。

圖1 乙腈-水位流動(dòng)相時(shí)托曲珠利和內(nèi)標(biāo)物的色譜圖

2.2.2 流動(dòng)相組成比例的影響

對(duì)比流動(dòng)相乙腈-水中乙腈比例分別為60%、80%、100%時(shí)分離效果，發(fā)現(xiàn)乙腈比例增大，目標(biāo)色譜峰出峰變快，響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)。見圖2。

圖2 流動(dòng)相中不同比例乙腈-水對(duì)保留時(shí)間的影響結(jié)果圖

2.2.3 流速的影響

為了研究流速對(duì)分離效果的影響，比較了300、350、400 μL/min 3種不同流速下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)表明，在流速降低時(shí)，保留時(shí)間延長(zhǎng)，峰高和峰面積增加，分離效果更好。因此，選擇了300 μL/min作為最佳流速。

2.2.4 柱溫的影響

在20、30、40 ℃三種不同的柱溫下，對(duì)50 mg/L的尼卡巴嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行了分離。結(jié)果顯示，在溫度升高的情況下，峰面積沒有明顯變化，但是出峰時(shí)間具有顯著差異。在30 ℃和40 ℃時(shí)，尼卡巴嗪的出峰時(shí)間都比20 ℃時(shí)快很多。因此，選擇了30 ℃作為最佳柱溫。

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

將濃度均為100 μg/L尼卡巴嗪、地克珠利、托曲珠利、托曲珠利砜標(biāo)準(zhǔn)品直接進(jìn)樣，通過碰撞能量、去簇電壓等條件優(yōu)化，建立質(zhì)譜參數(shù)。尼卡巴嗪選擇136和107作為定量和定性離子，地克珠利選擇333和222.9作為定量和定性離子，托曲珠利砜選擇399和147.8作為定量和定性離子，托曲珠利母離子不易形成碎片，分子離子選擇424.2。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

以目標(biāo)組分峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比為縱軸，標(biāo)準(zhǔn)工作液的質(zhì)量濃度ρ（μg/L）為橫軸，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表3。

表3 3種抗球蟲藥主要代謝物殘留量的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限表

2.5 精密度和準(zhǔn)確度

對(duì)地產(chǎn)雞肉、雞蛋樣品進(jìn)行采樣后進(jìn)行精密度、回收率實(shí)驗(yàn)。稱取雞肉或雞蛋 200 g，按上述制樣方法制取待測(cè)溶液6份，計(jì)算出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）并對(duì)精密度評(píng)價(jià)。結(jié)果如下：尼卡巴嗪RSD為2.04%，回收率87.5%~109%；地克珠利RSD為1.93%，回收率95.7%~107%；托曲珠利RSD為1.39%，回收率97.2%~106%；托曲珠利砜RSD為1.63%，回收率92.6%~101%。

2.6 實(shí)際樣品分析

在黑龍江省6個(gè)城市采集雞肉66份、雞蛋66份，使用該方法檢測(cè)其中抗球蟲類藥物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雞肉和雞蛋樣品中尼卡巴嗪、地克珠利含量均＜0.1 μg/L，托曲珠利、托曲珠利砜均＜1.0 μg/L，表明，黑龍江省的雞肉和雞蛋中3種抗球蟲藥物的食品風(fēng)險(xiǎn)很低。

3 結(jié)語

通過對(duì)黑龍江省部分城市的雞肉和雞蛋樣品中抗球蟲類藥物殘留量的檢測(cè)，結(jié)果樣品中均未檢出，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量的要求。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件和性能評(píng)價(jià)后，超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜法可對(duì)雞肉和雞蛋中3種抗球蟲藥殘留量進(jìn)行有效測(cè)定，方法靈敏、準(zhǔn)確、可靠，可以作為食品中尼卡巴嗪、地克珠利、托曲珠利和托曲珠利砜的檢測(cè)方法。