古鵬，湯佳豪，趙慶慶，王磊磊，王加寧，盧媛，張聞*

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院），山東省科學(xué)院生態(tài)研究所，山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250103；2.南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，環(huán)境污染過程與基準(zhǔn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300350）

含氧多環(huán)芳烴（oxygenated polycyclic aromatic hy?drocarbon，OPAHs）是在化石燃料和生物質(zhì)燃燒過程中或通過母體多環(huán)芳烴（PAHs）的光、化學(xué)和生物反應(yīng)形成的一類新污染物，含有羰基、羥基或羧基等官能團(tuán)[1-3]。OPAHs 可通過其極性官能團(tuán)與土壤固相存在較強(qiáng)的相互作用，其穩(wěn)定性高于其他含有硝基或烷基等基團(tuán)取代的PAHs衍生物，因此OPAHs被稱為“持久性終端代謝物”[4]。OPAHs 是可直接作用的誘變劑和致癌物，其生物毒性大于其母體PAHs，在不同環(huán)境基質(zhì)均有檢出，在部分地區(qū)其濃度高于衍生它們的親代PAHs[1，4-5]。目前，人們在檢測PAHs 類污染物時(shí)常集中于母體PAHs，對于和其同時(shí)產(chǎn)生或代謝產(chǎn)生的OPAHs關(guān)注度較低，且國內(nèi)外對于OPAHs的研究主要集中于OPAHs的總量分析、源解析及毒性分析等[6]，其賦存形態(tài)及生物有效性分析的相關(guān)報(bào)道較少。

OPAHs 在土壤中的賦存狀態(tài)會(huì)影響其環(huán)境行為，進(jìn)而影響其生態(tài)效應(yīng)及環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，因此有必要對其賦存形態(tài)進(jìn)行研究。連續(xù)提取法[7-11]被報(bào)道用于研究土壤中PAHs、脂肪烴等有機(jī)污染物的賦存形態(tài)，該法通過依次采用不同的提取步驟和試劑將與不同土壤組分結(jié)合的有機(jī)污染物區(qū)分為不同賦存形態(tài)，其中較詳盡的分類包含生物有效態(tài)、難解吸態(tài)、富里酸結(jié)合態(tài)、胡敏酸態(tài)、粗胡敏素結(jié)合態(tài)、礦物結(jié)合態(tài)、干酪根結(jié)合態(tài)等7 種賦存形態(tài)，生物有效態(tài)與難解吸態(tài)的含量加和為有機(jī)溶劑提取態(tài)含量[10]。OPAHs 作為結(jié)構(gòu)與PAHs 相似的有機(jī)污染物，其賦存形態(tài)分析亦適用于該法。連續(xù)提取法涉及從土壤相、水相和羥丙基-β-環(huán)糊精（hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HPCD）相中提取目標(biāo)物的過程[7-9]，其中有機(jī)溶劑提取態(tài)、胡敏酸結(jié)合態(tài)、粗胡敏素結(jié)合態(tài)和干酪根結(jié)合態(tài)涉及從原始土壤或土壤組分（即土壤相）中提取的過程；富里酸結(jié)合態(tài)和礦物結(jié)合態(tài)涉及從不同試劑處理后含富里酸或礦物組分溶液（即水相）中提取的過程；生物有效態(tài)涉及從HPCD 溶液（即HPCD 相）中提取的過程。然而OPAHs 在以上各相中提取及測定方法尚不完備。Wietzoreck等[12]采用二氯甲烷-索式提取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測定土壤中的OPAHs，Chibwe等[13]采用加壓液體萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測定土壤中的OPAHs，Hua 等[14]采用固相萃取-超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測定尿液中的羥基化PAHs。但索氏提取時(shí)間較長、有機(jī)溶劑消耗較大，加壓液體萃取所采用的儀器昂貴，尚未普及，且測定采用氣質(zhì)或液質(zhì)等色質(zhì)聯(lián)用儀器成本較高。因此，建立一種簡便、高效、成本低廉的OPAHs提取及分析方法對研究OPAHs賦存形態(tài)具有重要意義。超聲提取法和液液萃取法因其簡便的操作和低廉的成本被廣泛用于PAHs 在土壤相和水相中的提取，高效液相色譜（high performance liq?uid chromatography，HPLC）法是我國環(huán)保部發(fā)布的PAHs 的標(biāo)準(zhǔn)測定方法[《土壤和沉積物多環(huán)芳烴的測定/高效液相色譜法》（HJ 784—2016）]。于田田等[15]針對土壤/沉積物中的1-羥基芘建立了超聲萃取-HPLC 測定方法。Martínez-Pérez-Cejuela 等[16]采用固相萃取-HPLC測定水相中硝化和氧化PAHs。曹笑語等[17]對OPAHs分析方法的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，認(rèn)為氣質(zhì)或液質(zhì)等色質(zhì)聯(lián)用法為目前主要的分析方法，關(guān)于HPLC分析方法的報(bào)道則比較有限，OPAHs儀器分析方法仍相對缺乏，更多種類的OPAHs在不同環(huán)境基質(zhì)中簡便且低成本的提取及測定方法有待建立和完善。

9-芴酮和9，10-蒽醌被多篇文獻(xiàn)報(bào)道是土壤中豐 度 最 高 的OPAHs[1，18-20]，本 研 究 以 這2 種 物 質(zhì) 為OPAHs 代表物，建立其HPLC 分析方法及不同環(huán)境基質(zhì)中的提取方法，利用連續(xù)提取法分析土壤中9-芴酮和9，10-蒽醌的生物有效態(tài)、難解吸態(tài)、富里酸結(jié)合態(tài)、胡敏酸態(tài)、粗胡敏素結(jié)合態(tài)、礦物結(jié)合態(tài)、干酪根結(jié)合態(tài)等7 種賦存形態(tài)的含量，探究土壤中不同OPAHs 形態(tài)賦存特征和自然衰減規(guī)律，旨在為控制土壤OPAHs污染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

9-芴酮、9，10-蒽醌購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度>98.0%，其結(jié)構(gòu)式如圖1 所示。二者分子量分別為180.21 和208.22，辛醇-水分配系數(shù)分別為3.58 和3.39，在25 ℃時(shí)的蒸氣壓分別為5.72×10-5Pa 和1.16×10-7Pa[21]。供試土壤采自山東濟(jì)南（36°42'29″N，117°04'40″E），土地利用現(xiàn)狀為耕地，土壤質(zhì)地為壤土。其理化性質(zhì)：pH 為8.25，有機(jī)質(zhì)含量為5.2%，陽離子交換量為22.6 cmol·kg-1，總氮、總磷及總鉀含量分別為2.28、0.96 g·kg-1和13 g·kg-1。土壤在室內(nèi)自然陰干、磨碎過2 mm 篩后，向土壤中加入適量9-芴酮和9，10-蒽醌的混合丙酮儲(chǔ)備液制備污染土壤。根據(jù)參考文獻(xiàn)報(bào)道的實(shí)際污染土壤中[22]及相關(guān)方法學(xué)研究中[23]的OPAHs 含量，本實(shí)驗(yàn)9-芴酮和9，10-蒽醌在土壤中的含量都設(shè)置為20 mg·kg-1，即二者加和的OPAHs 污染水平為40 mg·kg-1。將污染土壤置于通風(fēng)櫥中2 d，每隔4 h 攪拌一次，使丙酮充分揮發(fā)后備用。

圖1 9-芴酮及9，10-蒽醌分子結(jié)構(gòu)式Figure 1 Molecular structure of 9-fluorenone and 9，10-anthraquinone

1.2 9-芴酮和9，10-蒽醌的HPLC分析方法構(gòu)建

分別配制20 mg·L-1的9-芴酮和9，10-蒽醌丙酮溶液，采用二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）進(jìn)行全波長掃描（掃描范圍190~400 nm）。全波長掃描使用的HPLC 條件為：流動(dòng)相為甲醇∶水=9∶1，流速1 mL·min-1，進(jìn)樣量2 μL，色譜柱為Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫25 ℃。根據(jù)信號響應(yīng)值，9-芴酮和9，10-蒽醌的最適檢測波長分別為258 nm 和252 nm。在以上檢測波長下，對HPLC 流動(dòng)相配比及流速進(jìn)行優(yōu)化，篩選使得目標(biāo)物的出峰時(shí)間合適，峰形尖銳、對稱且分離度較好的流動(dòng)相配比及流速。在此基礎(chǔ)上建立OPAHs 測定外標(biāo)曲線，配制1、2、5、10 mg·L-1和20 mg·L-1的9-芴酮和9，10-蒽醌系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 9-芴酮和9，10-蒽醌在不同基質(zhì)中的提取方法構(gòu)建

采用1.1 節(jié)制備的OPAHs 污染土進(jìn)行超聲提取實(shí)驗(yàn)，萃取劑選用二氯甲烷、甲醇和甲醇-二氯甲烷混合液（1∶1，V/V）。稱取2 g 土，向其中加入10 mL 萃取劑，混合均勻后，超聲10 min（功率500 W，頻率40 kHz，25 ℃），3 000 r·min-1離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 雞心瓶中。上述操作重復(fù)3 次，合并萃取液至雞心瓶中。將雞心瓶旋蒸至近干，加入2 mL 甲醇定容，超聲促溶后，溶液過0.45 μm 尼龍過濾器轉(zhuǎn)移至自動(dòng)進(jìn)樣小瓶中進(jìn)行HPLC 檢測，測定回收率，確定合適的萃取劑。

制備含有20 mg·L-1OPAHs 的水溶液及HPCD 溶液，其中9-芴酮和9，10-蒽醌質(zhì)量比例為1∶1。萃取劑選用二氯甲烷和甲醇-二氯甲烷混合液（1∶1，V/V）。分別量取20 mL OPAHs 水溶液和HPCD 溶液于分液漏斗中，加入10 mL 萃取劑，進(jìn)行液液萃取，然后將萃取液轉(zhuǎn)移至50 mL 雞心瓶中。上述操作重復(fù)3 次，合并萃取液至雞心瓶中。其余操作同上。

1.4 土壤中9-芴酮和9，10-蒽醌賦存形態(tài)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別稱取10 g 1.1 節(jié)制備的OPAHs 污染土壤于多個(gè)40 mL 棕色玻璃瓶中，加入無菌水使其含水率為20.0%，用封瓶膜封口后置于生化培養(yǎng)箱中，25 ℃培養(yǎng)，每6 d 稱量補(bǔ)水。在0、15 d 和30 d 進(jìn)行有機(jī)溶劑提取態(tài)和生物有效態(tài)的提取與分析，并在30 d時(shí)進(jìn)行全賦存形態(tài)的提取與分析。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.5 土壤中不同賦存形態(tài)9-芴酮和9，10-蒽醌的提取方法

土壤中OPAHs 賦存形態(tài)包括生物有效態(tài)（F1）、難解吸態(tài)（F2）、富里酸結(jié)合態(tài)（F3）、胡敏酸結(jié)合態(tài)（F4）、粗胡敏素結(jié)合態(tài)（F5）、礦物結(jié)合態(tài)（F6）和干酪根結(jié)合態(tài)（F7）。常報(bào)道的有機(jī)溶劑提取態(tài)（FDCM）包含F(xiàn)1和F2，本實(shí)驗(yàn)F1和FDCM分別單獨(dú)提取，通過FDCM與F1 差減得到F2，F(xiàn)3~F7 在FDCM提取結(jié)束后的土樣基礎(chǔ)上連續(xù)分步提取獲得。各態(tài)提取方法參照PAHs連續(xù)提取方法[7-8]，并基于1.3 節(jié)9-芴酮和9，10-蒽醌在不同基質(zhì)中提取方法的最優(yōu)結(jié)果對其進(jìn)行改進(jìn)，具體如下：

生物有效態(tài)（F1）：稱取1 g凍干土樣于玻璃瓶中，加入20 mL 用去離子水配制的50 mmol·L-1的HPCD水溶液，密封振蕩（25 ℃，150 r·min-1）提取20 h，離心10 min（3 000 r·min-1，4 ℃）。收集上清液，用10 mL的二氯甲烷液液萃取3次，合并萃取液至雞心瓶中。

有機(jī)溶劑提取態(tài)（FDCM）：稱取2 g 凍干土樣于玻璃瓶中，加入10 mL 甲醇-二氯甲烷混合液（1∶1，V/V），混勻，超聲10 min（功率500 W，頻率40 kHz，25 ℃），離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 雞心瓶中。重復(fù)3次，合并萃取液至雞心瓶中。

富里酸結(jié)合態(tài)（F3）：將上一步有機(jī)溶劑提取結(jié)束后的土樣37 ℃干燥2 h，添加10 mL 2 mol·L-1的NaOH 溶液，混勻，水解2 h（100 ℃）。水解結(jié)束冷卻至室溫，離心10 min，沉淀用于提取粗胡敏素結(jié)合態(tài)（F5），上清液用于提取富里酸（F3）和胡敏酸結(jié)合態(tài)（F4）。收集上清液，并用少量NaOH 溶液潤洗土壤，離心后潤洗液與上清液合并。用6 mol·L-1的鹽酸溶液酸化上清液至pH<1，離心10 min，上清液為富里酸，沉淀為胡敏酸。將上清液轉(zhuǎn)移至分液漏斗用10 mL 二氯甲烷液液萃取，重復(fù)3 次，合并萃取液至雞心瓶中。

胡敏酸結(jié)合態(tài)（F4）：向上一步得到的胡敏酸樣品中加入無水硫酸鈉除水，加10 mL 甲醇-二氯甲烷混合液（1∶1，V/V）超聲提取10 min，重復(fù)3 次，合并萃取液至雞心瓶中。

粗胡敏素結(jié)合態(tài)（F5）：向富里酸結(jié)合態(tài)（F3）提取步驟中水解后的土樣中加入10 mL 甲醇，振蕩30 min，超聲10 min，離心收集上清液；然后依次用10 mL甲醇-二氯甲烷混合液（1∶1，V/V）、二氯甲烷和二氯甲烷提取，步驟同上。將所有提取物合并，用20 mL 蒸餾水液液萃取，重復(fù)4 次，合并有機(jī)相至雞心瓶中。提取后的土樣用于礦物結(jié)合態(tài)（F6）的提取。

礦物結(jié)合態(tài)（F6）：上一步得到的土樣37 ℃干燥2 h，轉(zhuǎn)移至50 mL 塑料離心管中，加入10 mL 6 mol·L-1鹽酸溶液，振蕩12 h，離心收集上清液；加入10 mL 40.0%氫氟酸-鹽酸（1∶1，V/V），步驟同上。殘?jiān)? mol·L-1鹽酸溶液潤洗，離心后與上清液合并。收集的上清液用10 mL二氯甲烷液液萃取，重復(fù)3次，合并萃取液至雞心瓶中。

干酪根結(jié)合態(tài)（F7）：對礦物結(jié)合態(tài)（F6）提取后的土樣，使用與提取粗胡敏素結(jié)合態(tài)（F5）相同的步驟進(jìn)行處理，合并有機(jī)相至雞心瓶中。

將雞心瓶旋蒸至近干，加入2 mL 甲醇，超聲促溶后，溶液過0.45 μm 尼龍過濾器轉(zhuǎn)移至自動(dòng)進(jìn)樣小瓶中待測。

1.6 9-芴酮和9，10-蒽醌分析

9-芴酮和9，10-蒽醌分析基于1.2 節(jié)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，具體為：通過HPLC 測定（安捷倫1260）。檢測條件為：流動(dòng)相為甲醇∶水=9∶1，流速1 mL·min-1，進(jìn)樣量2 μL，色譜柱為Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫25 ℃，DAD 檢測器，檢測波長252 nm（9，10-蒽醌）和258 nm（9-芴酮），檢測時(shí)間6 min。

1.7 數(shù)據(jù)分析

通過SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和單因素方差分析；使用Origin 2022制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 9-芴酮和9，10-蒽醌的分析方法

通過反復(fù)試驗(yàn)流動(dòng)相比例及流速，選擇等度流動(dòng)相甲醇∶水=9∶1，流速為1.0 mL·min-1，可在6 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)2種OPAHs完全分離。在此條件下，得到的色譜峰窄而尖，峰型均良好，無雜質(zhì)峰干擾，如圖2 所示?；谝陨螲PLC 測定條件，建立了9-芴酮和9，10-蒽醌的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在1.00~20.00 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.999及以上，可滿足測試需求。

圖2 9-芴酮和9，10-蒽醌的高效液相色譜圖（檢測波長258 nm）Figure 2 High performance liquid chromatography chromatogram of 9-fluorenone and 9，10-anthraquinone（detection wavelength 258 nm）

2.2 9-芴酮和9，10-蒽醌的提取方法

土壤相中的9-芴酮和9，10-蒽醌通過超聲法進(jìn)行提取，對比了3種萃取劑二氯甲烷、甲醇及甲醇-二氯甲烷混合溶液的萃取效率。土壤與萃取劑比例、超聲時(shí)間及超聲次數(shù)參考前期實(shí)驗(yàn)室從土壤中提取PAHs 的方法[24]。水相及HPCD 相中的9-芴酮和9，10-蒽醌通過液液萃取法進(jìn)行提取，對比了2 種萃取劑二氯甲烷和甲醇-二氯甲烷混合溶液的萃取效率。液液萃取的比例、次數(shù)等參照從水相提取PAHs 的方法[25]。各基質(zhì)中9-芴酮和9，10-蒽醌的提取回收率如圖3 所示，對于土壤中這2 種OPAHs，使用混合萃取劑的提取效率最高，回收率為102.4%±0.8%（9-芴酮）和104.2%±3.4%（9，10-蒽醌），顯著高于以二氯甲烷及甲醇為萃取劑的回收率。對于水相和HPCD 相中的這2種OPAHs，使用二氯甲烷作為萃取劑回收率最高，9-芴酮的回收率分別為87.8%±0.7%和86.3%±3.8%，9，10-蒽醌的回收率分別為87.2%±0.3%和78.7%±2.4%。

圖3 土壤、水及HPCD相中的9-芴酮和9，10-蒽醌回收率Figure 3 Recovery of 9-fluorenone and 9，10-anthraquinone in the soil，water and HPCD

基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終確定土壤中9-芴酮和9，10-蒽醌最佳的提取條件為：以甲醇-二氯甲烷（1∶1，V/V）為萃取劑，土壤與萃取劑比例為2 g∶10 mL，超聲時(shí)間10 min，超聲次數(shù)3 次。水相及HPCD 相中9-芴酮和9，10-蒽醌的提取條件為：以二氯甲烷作為萃取劑，待提取液與萃取劑比例為20 mL∶10 mL，液液萃取3次。

2.3 9-芴酮和9，10-蒽醌在土壤中的賦存形態(tài)

圖4為土壤被9-芴酮和9，10-蒽醌污染1個(gè)月后的各賦存形態(tài)含量，圖5 為各賦存形態(tài)占總殘留量的比例。二者反映了這2 種OPAHs 賦存形態(tài)的分布特征。同一種賦存形態(tài)下2 種OPAHs 污染物9-芴酮和9，10-蒽醌的含量之和用∑OPAHs表示。

圖4 土壤中9-芴酮和9，10-蒽醌及∑OPAHs各賦存形態(tài)含量Figure 4 Contents of 9-fluorenone，9，10-anthraquinone and∑OPAHs in soil

圖5 土壤中9-芴酮和9，10-蒽醌及∑OPAHs各賦存形態(tài)含量占比Figure 5 Fractions of each speciation of 9-fluorenone，9，10-anthraquinone and ∑OPAHs in soil

9-芴酮的F1~F7 各態(tài)殘留量分別為0.05、0.83、0、0.10、0.44、0 mg·kg-1和0.13 mg·kg-1，分別占其總殘留量的3.2%、53.5%、0、6.5%、28.4%、0 和8.4%。9，10-蒽醌的F1~F7 各態(tài)殘留量分別為0.36、2.53、0.14、0.13、1.06、0.06 mg·kg-1和0.67 mg·kg-1，分別占其總殘留 量 的7.3%、51.1%、2.8%、2.6%、21.4%、1.2% 和13.5%?！芆PAHs 的F1~F7 各態(tài)殘留量分別為0.41、3.36、0.14、0.23、1.50、0.06 mg·kg-1和0.80 mg·kg-1，分別占其總殘留量的6.3%、51.7%、2.2%、3.5%、23.1%、0.9%和12.3%。綜上可見，9-芴酮和9，10-蒽醌復(fù)合污染土壤中，9-芴酮各賦存形態(tài)殘留量排序：F2>F5>F7>F4>F1>F3 和F6（F3 和F6 未檢出）；9，10-蒽醌排序：F2>F5>F7>F1>F3>F4>F6；∑OPAHs排序：F2>F5>F7>F1>F4>F3>F6。培養(yǎng)1 個(gè)月后，9-芴酮的各態(tài)殘留量均低于9，10-蒽醌，9-芴酮、9，10-蒽醌、∑OPAHs的總殘留量分別為1.55、4.95 mg·kg-1和6.50 mg·kg-1，分別占初始投加量的7.8%、24.8%和16.3%。

F1 及F2 態(tài)OPAHs 分別易于或較易于被生物利用，可直接或間接反映其在土壤中的有效性。二者之和為有機(jī)溶劑提取態(tài)，亦稱為可提取態(tài)，9-芴酮和9，10-蒽醌可提取態(tài)含量之和為3.77 mg·kg-1，占這2 種OPAHs 在土壤中殘留總量的58.0%，為土壤中存在的主要形態(tài)。F3 至F7 各態(tài)之和為結(jié)合態(tài)，是殘留在土壤中不易被生物利用的部分，2種OPAHs結(jié)合態(tài)含量之和為2.73 mg·kg-1，占土壤中殘留總量的42.0%。其中，F(xiàn)3、F4、F5 和F7 分別對應(yīng)與土壤有機(jī)質(zhì)組分富里酸、胡敏酸、胡敏素和干酪根緊密結(jié)合無法被有機(jī)溶劑直接萃取的OPAHs，這4 種形態(tài)OPAHs 之和為2.67 mg·kg-1，占結(jié)合態(tài)含量的97.8%。

2.4 9-芴酮和9，10-蒽醌生物有效性的變化

近些年來國內(nèi)外十分關(guān)注土壤中有機(jī)污染物的生物有效性[26-27]。本研究中F1 直接反映9-芴酮和9，10-蒽醌在土壤中的生物有效性，F(xiàn)DCM是以往污染土壤調(diào)查中常用來表征污染物量的指標(biāo)，因此對二者在30 d內(nèi)的變化進(jìn)行對比分析。

由圖6 可知，9-芴酮和9，10-蒽醌的F1 和FDCM態(tài)在0 d 到30 d 的過程中均呈降低趨勢，9-芴酮在0、15 d 和30 d 時(shí)F1 和FDCM態(tài)含量分別為9.56、0.08、0.05 mg·kg-1和14.85、1.86、0.88 mg·kg-1。9，10-蒽醌的相應(yīng)含量分別為8.50、0.61、0.36 mg·kg-1和16.91、5.78、2.89 mg·kg-1?！芆PAHs相應(yīng)含量分別為18.06、0.69、0.41 mg·kg-1和31.76、7.64、3.77 mg·kg-1。F1和FDCM在前15 d 降低極快，9-芴酮較0 d 分別降低99.2%和87.5%，9，10-蒽醌分別降低92.8%和65.8%，∑OPAHs分別降低96.2%和75.9%。F1 和FDCM在后15 d 降低趨勢減緩，9-芴酮較0 d 分別降低0.3%和6.6%，9，10-蒽醌分別降低2.9%和17.1%，∑OPAHs 分別降低1.5%和12.2%。

圖6 不同時(shí)間點(diǎn)土壤中9-芴酮和9，10-蒽醌的F1和FDCM含量Figure 6 Contents of F1 and FDCM of 9-fluorenone and 9，10-anthraquinone in the soil at different time

3 討論

3.1 不同基質(zhì)中9-芴酮和9，10-蒽醌的萃取劑選擇

OPAHs 萃取劑需與OPAHs 具有較大的親和力，使其從土壤相或水相或HPCD 相進(jìn)入萃取劑中，通過離心實(shí)現(xiàn)固液分離或靜置實(shí)現(xiàn)液液分層。由于羰基的存在，9-芴酮和9，10-蒽醌的極性大于母體PAHs[28]，提取時(shí)應(yīng)選擇具有一定極性且能形成氫鍵的溶劑。二氯甲烷作為萃取劑對PAHs 有較好的提取效果，但二氯甲烷為弱極性溶劑，無法與OPAHs 形成氫鍵，單獨(dú)使用時(shí)回收率較低[15]。甲醇雖能與9-芴酮和9，10-蒽醌形成氫鍵，但是極性較強(qiáng)，對極性弱于甲醇的OPAHs 萃取率低；且甲醇黏度較大，擴(kuò)散率較低，不易滲透至基質(zhì)中與目標(biāo)物結(jié)合，使目標(biāo)物從基質(zhì)中脫附，因而回收率較低。將甲醇與二氯甲烷混合之后，可以同時(shí)降低溶劑的極性和黏度，回收率明顯提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對于土壤中的9-芴酮和9，10-蒽醌選用甲醇-二氯甲烷（1∶1，V/V）效果最好，回收率較二氯甲烷作為萃取劑分別高出17.0% 和17.3%，較甲醇作為萃取劑分別高出11.7%和11.5%。但是混合溶劑用于水相和HPCD 相中提取9-芴酮和9，10-蒽醌的提取效率低于二氯甲烷，可能是由于甲醇與水互溶，導(dǎo)致部分目標(biāo)物殘存于水相中，使其回收率較低。

3.2 9-芴酮和9，10-蒽醌在土壤中的賦存特征

土壤是高度不均勻的復(fù)雜體系，各組分間的疏水、靜電相互作用、化學(xué)鍵的形成以及分子結(jié)構(gòu)不同，使得污染物進(jìn)入土壤后分化成不同的形態(tài)。污染物在土壤中的賦存形態(tài)直接影響其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。目前，土壤中PAHs 賦存形態(tài)的研究較多，OPAHs 的賦存形態(tài)未見相關(guān)報(bào)道。聶婧等[29]研究了土壤中四環(huán)芳烴芘的賦存形態(tài)，各形態(tài)芘含量大小順序?yàn)橛袡C(jī)溶劑提取態(tài)>可脫附態(tài)>結(jié)合態(tài)，根據(jù)其提取方法，這三態(tài)分別對應(yīng)本研究中的F2、F1、F3+F4，即F2>F1>F3+F4，F(xiàn)2和F1 是芘殘留的主要存在形態(tài)，該規(guī)律與本研究9-芴酮和9，10-蒽醌的研究結(jié)果一致。Zhang 等[9]研究發(fā)現(xiàn)黃綿土中PAHs 的賦存形態(tài)為有機(jī)溶劑可提取態(tài)PAHs（59.1%）>胡敏素結(jié)合態(tài)PAHs（26.2%）>富里酸結(jié)合態(tài)PAHs（10.0%）>胡敏酸結(jié)合態(tài)PAHs（4.7%），對應(yīng)本研究的賦存形態(tài)即為FDCM>F5>F3>F4。隋紅等[30]研究發(fā)現(xiàn)PAHs在土壤有機(jī)質(zhì)胡敏素組分中含量占比大，在富里酸和胡敏酸中占比相當(dāng)少，即F5>F3 和F4。本研究中9-芴酮和9，10-蒽醌相應(yīng)賦存形態(tài)含量順序?yàn)镕DCM>F5>F3或F4，與PAHs 研究結(jié)果一致。

本研究表明，9-芴酮和9，10-蒽醌進(jìn)入土壤后會(huì)形成各種賦存形態(tài)，各賦存形態(tài)含量差異較大?！芆PAHs排序?yàn)镕2（51.7%）>F5（23.1%）>F7（12.3%）>F1（6.3%）>F4（3.5%）>F3（2.2%）>F6（0.9%）。F1 與F2合并為可提取態(tài)，是9-芴酮和9，10-蒽醌在土壤中的主要賦存形態(tài)，可反映二者在土壤中的生物有效性，其中F2 是可提取態(tài)的主要組成部分。F3~F7 是9-芴酮和9，10-蒽醌與土壤有機(jī)質(zhì)及礦物結(jié)合的部分。土壤有機(jī)質(zhì)被報(bào)道是影響土壤中PAHs 賦存形態(tài)的重要因素[31-32]。本研究中土壤經(jīng)有機(jī)溶劑提取后，殘留的與有機(jī)質(zhì)組分相關(guān)的OPAHs 賦存形態(tài)為F3、F4、F5 和F7，即富里酸、胡敏酸、胡敏素和干酪根結(jié)合態(tài)，其含量占比之和為41.1%；與礦物組分相關(guān)的賦存形態(tài)為F6，即礦物結(jié)合態(tài)，其含量占比為0.9%，有機(jī)質(zhì)組分相關(guān)賦存形態(tài)含量遠(yuǎn)高于礦物結(jié)合態(tài)。因此，與PAHs 相似，2 種OPAHs 9-芴酮和9，10-蒽醌與土壤組分結(jié)合時(shí)，有機(jī)質(zhì)組分較礦物組分發(fā)揮了更重要的作用。

土壤有機(jī)質(zhì)根據(jù)其在不同pH值溶液中溶解度的差異，分為溶于任意pH值溶液的富里酸、溶于堿但不溶于酸的胡敏酸和既不溶于酸也不溶于堿的胡敏素[33]。富里酸和胡敏酸是溶解性有機(jī)質(zhì)的主要組成部分[34]，與其結(jié)合的9-芴酮和9，10-蒽醌即F3 和F4可遷移性較其他形態(tài)更強(qiáng)。2 種OPAHs 9-芴酮和9，10-蒽醌在富里酸和胡敏酸中含量分布表現(xiàn)不同，對于9-芴酮，F(xiàn)3F4（P>0.05）。該現(xiàn)象與富里酸和胡敏酸的性質(zhì)相關(guān)。富里酸以含有大量羧基為主要結(jié)構(gòu)特征，極性較高；胡敏酸含有大量的芳香族不飽和結(jié)構(gòu)及烷基鏈烴，極性相對較低[35-37]。9-芴酮和9，10-蒽醌相比缺少1 個(gè)羰基，其辛醇-水分配系數(shù)更大，疏水性更強(qiáng)，因此更傾向于與極性較低的胡敏酸相結(jié)合。胡敏素結(jié)合態(tài)9-芴酮和9，10-蒽醌的含量高于富里酸和胡敏酸結(jié)合態(tài)，即F5>F3 和F4。胡敏素與富里酸和胡敏酸相比較，具有相對較高的分子量和較大的脂族性[38]，其脂肪族成分對含有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的OPAHs 具有很強(qiáng)的親和力[39]，因此與胡敏素結(jié)合的9-芴酮和9，10-蒽醌含量（F5）高于富里酸和胡敏酸（F3 和F4）；且有文獻(xiàn)報(bào)道隨著老化時(shí)間的增加，富里酸和胡敏酸所吸附的污染物有向胡敏素中轉(zhuǎn)移的趨勢[30]，這可能進(jìn)一步增加F5 的含量。干酪根是沉積巖中主要的有機(jī)質(zhì)，當(dāng)巖石暴露于地表時(shí)，干酪根經(jīng)日曬雨淋和風(fēng)化后，進(jìn)入到表層土壤中[40]。干酪根不溶于酸堿也不溶于有機(jī)溶劑，與胡敏素相比，其分子結(jié)構(gòu)更加稠密、具有更多的橋連和芳環(huán)結(jié)構(gòu)[35]。干酪根被礦物組分包裹，本研究中通過去礦的方法獲得該形態(tài)OPAHs（F7），其含量低于胡敏素結(jié)合態(tài)F5，高于富里酸和胡敏酸結(jié)合態(tài)F3 和F4。一方面可能是由于這4 種有機(jī)質(zhì)組分對OPAHs 吸附能力強(qiáng)弱不同；另一方面，干酪根因與土壤的礦物部分牢固結(jié)合，在FDCM的提取過程中干酪根結(jié)合態(tài)OPAHs 不易被有機(jī)溶劑萃取出來，因而具有較大的殘留量。

本文研究了9-芴酮和9，10-蒽醌2 種污染物在1種土壤中的賦存形態(tài)。OPAHs 除包含9-芴酮和9，10-蒽醌等含羰基的PAHs 衍生物以外，還包含PAHs分子中氫原子被1 個(gè)或多個(gè)羥基、羧基等官能團(tuán)取代形成的羥基化及羧基化衍生物。這些OPAHs 既有芳香結(jié)構(gòu)的相似性，又有含氧官能團(tuán)的差異性，未來的研究應(yīng)關(guān)注更多種類OPAHs 在更多不同性質(zhì)土壤中的賦存形態(tài)，以評估其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，支撐PAHs污染場地修復(fù)過程中OPAHs衍生物的監(jiān)測、量化及風(fēng)險(xiǎn)管控。

3.3 9-芴酮和9，10-蒽醌生物有效性在自然衰減中的變化

土壤中的污染物通?？赏ㄟ^自然衰減實(shí)現(xiàn)土壤自凈。Wei 等[41]研究表明，在未抑菌的芘污染土壤中，自然衰減初期，芘可提取率快速降低，后期則維持緩慢下降趨勢。本研究發(fā)現(xiàn)，9-芴酮和9，10-蒽醌的F1 和FDCM含量在前15 d 降幅較大，后15 d 降幅趨緩，表明這2種OPAHs在自然衰減的不同進(jìn)程，其生物有效性降低程度不同。Zhang等[11]的研究表明，PAHs及其硝基和羰基衍生物進(jìn)入土壤30 d 后的可提取率及生物有效性明顯下降。9-芴酮和9，10-蒽醌生物有效性降低的主要原因可能是：一方面，自然揮發(fā)和微生物降解等作用可導(dǎo)致土壤中這2 種OPAHs 含量降低；另一方面，隨著9-芴酮和9，10-蒽醌與土壤接觸時(shí)間的增加，這2種OPAHs逐漸老化進(jìn)入土壤有機(jī)質(zhì)和礦物質(zhì)等組分中形成結(jié)合態(tài)殘留。

0 d 時(shí)，土壤中9-芴酮的F1 態(tài)含量高于9，10-蒽醌，15 d 和30 d 時(shí)反之，且在30 d 時(shí)9-芴酮的各賦存形態(tài)含量均低于9，10-蒽醌，即9-芴酮較9，10-蒽醌在土壤中自然衰減得更快，這與兩者的性質(zhì)密切相關(guān)。9-芴酮的蒸氣壓高于9，10-蒽醌，更傾向于從土壤相向氣相中逸散；此外，9-芴酮的水溶解度高于9，10-蒽醌，更易被土壤微生物利用，使得土壤中9-芴酮的殘留量更低。Idowu 等[42]研究了極性PAHs 的環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)，指出高分子量化合物比低分子量化合物通常表現(xiàn)出更大的毒性，且具有氧和氮雜原子的化合物由于更高的反應(yīng)性，其毒性比同環(huán)烴更大。Trine等[43]研究發(fā)現(xiàn)雜酚油污染土壤蒸汽強(qiáng)化萃取修復(fù)過程中形成了PAHs衍生物，分子量較低的OPAHs 1，4-萘醌會(huì)比分子量較高的OPAHs 9，10-蒽醌降解得更快，即其生物有效性更強(qiáng)。本研究中9-芴酮的分子量小于9，10-蒽醌，推測9-芴酮具有更快的降解速率。Qiao 等[44]總結(jié)了OPAHs 的生物降解半衰期，9-芴酮和9，10-蒽醌的生物降解半衰期分別為8.98 d和16.7 d，9-芴酮的半衰期小于9，10-蒽醌，說明9-芴酮更易被生物降解。

4 結(jié)論

本文針對2 種含氧多環(huán)芳烴（OPAHs）9-芴酮和9，10-蒽醌，建立了HPLC-DAD 測定方法及其在不同基質(zhì)中的提取方法。土壤中這2 種OPAHs 提取使用超聲提取法，萃取劑選用甲醇-二氯甲烷（1∶1，V/V）混合液；水和HPCD 溶液中這2 種OPAHs 提取使用液液萃取法，萃取劑選用二氯甲烷。

進(jìn)入土壤30 d后，各賦存形態(tài)9-芴酮和9，10-蒽醌含量之和大小順序?yàn)殡y解吸態(tài)>粗胡敏素結(jié)合態(tài)>干酪根結(jié)合態(tài)>生物有效態(tài)>胡敏酸結(jié)合態(tài)>富里酸結(jié)合態(tài)>礦物結(jié)合態(tài)，可提取態(tài)和結(jié)合態(tài)占總殘留量的比例大致相當(dāng)，有機(jī)質(zhì)結(jié)合態(tài)較礦物結(jié)合態(tài)含量占比更高。隨著自然衰減進(jìn)行，9-芴酮和9，10-蒽醌的生物有效性降低，9-芴酮較9，10-蒽醌在土壤中生物有效性降低得更快。