方明智，唐思琪，孫煜璨，陳坦，張冰，劉翼飛，楊婷*

（1.中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081；2.生態(tài)環(huán)境部土壤與農(nóng)業(yè)農(nóng)村生態(tài)環(huán)境監(jiān)管技術(shù)中心，北京 100012）

隨著工業(yè)化和城市化進(jìn)程加快，我國土壤重金屬污染形式日益嚴(yán)峻并引發(fā)廣泛關(guān)注[1]。2014 年《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》指出，我國土壤總超標(biāo)率為16.1%，重金屬是引發(fā)土壤污染的典型污染物[2]。土壤中的重金屬不能生物降解，可對土壤理化性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生危害，還可以進(jìn)入食物鏈并最終在人體中積累，對人類健康和環(huán)境構(gòu)成巨大威脅[3-4]。

常用的土壤重金屬修復(fù)技術(shù)主要包括土壤淋洗、化學(xué)鈍化、植物修復(fù)和微生物修復(fù)等，其中土壤淋洗被認(rèn)為是最有效、快速且經(jīng)濟(jì)的技術(shù)之一[5]。土壤淋洗可通過溶解、絡(luò)合、離子交換等作用，將土壤中的重金屬污染物轉(zhuǎn)移到淋洗液中，從而降低土壤中重金屬污染物含量[6]。常用的淋洗劑主要有以下類型：無機(jī)酸（如鹽酸、硫酸、硝酸等）；合成有機(jī)螯合劑（如EDTA、DTPA、EDDS等）；天然螯合劑（如腐植酸、檸檬酸、酒石酸等）[7]。無機(jī)酸和合成有機(jī)螯合劑具有較高的金屬去除效率，但無機(jī)酸會酸化土壤，改變土壤結(jié)構(gòu)，降低土壤肥力和微生物活性；合成有機(jī)螯合劑具有較低的生物降解性，可能對地下水質(zhì)量和土壤微生物健康產(chǎn)生不利影響[8]。因此，使用環(huán)境友好型且淋洗效率高的淋洗劑對淋洗技術(shù)的工程實(shí)踐具有重要意義。

腐植酸是一種天然有機(jī)大分子，其富含多種活性官能團(tuán)，如羧基、酚羥基、羰基和酮基等，可以通過絡(luò)合、離子交換、氧化還原及靜電作用等與重金屬發(fā)生相互作用[9]。多位研究者已將腐植酸作為天然螯合劑用于重金屬污染土壤淋洗并取得了良好的淋洗效果，如Yang 等[10]發(fā)現(xiàn)人工合成腐植酸可以將土壤中的Cu、Zn、Ni 和Pb 分別去除45.2%、34.6%、42.2%和15.6%；Meng 等[11]用腐殖質(zhì)淋洗土壤后降低了36.8%的Cd 濃度。此外，腐植酸作為土壤有機(jī)質(zhì)的主要組成物質(zhì)，其作為淋洗劑施用被認(rèn)為不會引入二次污染，因此，腐植酸被認(rèn)為是一種環(huán)境友好型土壤淋洗劑[12]。

土壤微生物在陸地生態(tài)系統(tǒng)中的幾乎所有生物地球化學(xué)循環(huán)過程中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用[13]，其群落數(shù)量、結(jié)構(gòu)和多樣性易受到環(huán)境因素影響，被認(rèn)為是衡量土壤環(huán)境質(zhì)量與生態(tài)功能的重要指標(biāo)。土壤淋洗技術(shù)雖然可以去除部分重金屬，但是可能會帶來重金屬的活化、養(yǎng)分的流失、淋洗劑的殘留等一系列問題，進(jìn)而可能影響土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)[14]。但是目前針對淋洗技術(shù)的研究主要側(cè)重淋洗效果、重金屬形態(tài)變化與其對土壤理化性質(zhì)的影響，針對淋洗后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化及其對環(huán)境因子的響應(yīng)機(jī)制研究較少，無法在微觀尺度評價淋洗技術(shù)的環(huán)境效應(yīng)[15-16]?；诖?，本文研究了腐植酸淋洗Cd、Pb、Zn復(fù)合污染土壤后重金屬的形態(tài)和活性變化，探究了淋洗對土壤微生物群落多樣性和組成結(jié)構(gòu)的影響，闡明了微生物群落的變化對土壤環(huán)境因子的響應(yīng)機(jī)制，以期為化學(xué)淋洗修復(fù)重金屬污染土壤的生態(tài)安全性評價提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 供試土壤與試劑

供試土壤取自石嘴山市某農(nóng)田的表層（0~20 cm）土壤，經(jīng)自然風(fēng)干后過2 mm 篩保存?zhèn)溆?。該土壤基本性質(zhì)如下：pH 為8.54±0.02，土壤有機(jī)碳（SOC）含量為6.10%±0.29%，土壤氨氮（NH+4-N）含量為5.69±0.36 mg·kg-1，總Cd含量為6.71±0.26 mg·kg-1，總Pb含量為265.44±4.77 mg·kg-1，總Zn 含量為856.81±5.49 mg·kg-1。依據(jù)《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險管控標(biāo)準(zhǔn)（試行）》（GB 15618—2018），供試土壤中Cd含量是風(fēng)險篩選值的11.18 倍，Zn 含量是風(fēng)險篩選值的2.86倍，Pb含量是風(fēng)險篩選值的1.56倍。

實(shí)驗(yàn)所用腐植酸購自廣東翁江化學(xué)試劑有限公司（該腐植酸為煤基腐植酸，純度為98%，C、H、N、O含量分別為37.13%±0.47%、2.40%±0.04%、1.07%±0.01%、59.40%±0.52%），其余試劑購自上海麥克林生化科技股份有限公司，均為分析純。

1.2 土壤淋洗與培養(yǎng)

基于課題組前期研究，淋洗條件設(shè)置為液固比為40∶1，淋洗劑濃度為1 500 mg·L-1，腐植酸用0.5 mol·L-1NaOH 充分溶解后將其pH 調(diào)節(jié)為9，淋洗溫度為25 ℃，淋洗時間為6 h[10]。淋洗結(jié)束后，將離心后土壤放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱（25 ℃）中培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為30 d，期間每3 d 向土壤中添加適量高純水，使土壤含水率保持在田間持水量的70%左右（土壤田間持水量為16.7%±1.7%）。對照組土壤為不進(jìn)行淋洗操作的原始土壤。在淋洗結(jié)束當(dāng)天、培養(yǎng)期第3、7、15、30 天采集土壤鮮樣進(jìn)行DNA 提取用于微生物群落結(jié)構(gòu)信息分析，其余土壤自然風(fēng)干并通過2 mm 篩用于測定重金屬形態(tài)與土壤理化性質(zhì)。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 土壤重金屬形態(tài)與基本理化性質(zhì)

采用改進(jìn)BCR 連續(xù)提取法提取對照組，土壤淋洗當(dāng)天及其淋洗后第3、7、15、30 天測定土壤重金屬不同形態(tài)含量。提取順序?yàn)樗崽崛B(tài)（F1）、可還原態(tài)（F2）、可氧化態(tài)（F3）與殘?jiān)鼞B(tài)（F4）[17]，各形態(tài)重金屬含量采用ICP-OES（Prodigy7，LeemanLabs，美國）測定；土壤pH 依據(jù)HJ 962—2018 測定；SOC 依據(jù)HJ 615—2011測定；土壤NH+4-N 含量依據(jù)HJ 634—2012測定。根據(jù)土壤淋洗后時間不同，分別記為淋洗后當(dāng)天（AW 0），淋洗后3 d（AW3），淋洗后7 d（AW7），淋洗后15 d（AW15），淋洗后30 d（AW30）。

1.3.2 樣品16S rRNA基因高通量測序

提取原始土壤和淋洗后第3、7、15、30 天的土壤微生物DNA，擴(kuò)增區(qū)為16S rRNA 基因的V4 區(qū)。PCR擴(kuò)增使用的前引物為515F（5'-GTGCCAGCMGCCGC?GGTAA-3'），反 向引 物為806R（5'-GGACTACH?VGGGTWTCTAAT-3'）。完成PCR 擴(kuò)增后，對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化，純化后的產(chǎn)物通過Illumina MiSeq平臺完成16S rRNA 基因測序。通過Galaxy 平臺對獲得測序的原始數(shù)據(jù)完成數(shù)據(jù)的預(yù)處理。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 26 進(jìn)行單因素方差（ANOVA）分析，比較各處理間的顯著性差異。群落組成和聚類分析、主坐標(biāo)分析（PCoA）通過R語言“vegan”包實(shí)現(xiàn)。共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析基于Pearson 相關(guān)性分析（設(shè)置閾值R>0.6，P<0.05），通過R 語言“igraph”包，構(gòu)建連接矩陣，并得到網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)、邊數(shù)據(jù)和部分拓?fù)鋮?shù)，將“igraph”包得到的graphml 格式文件導(dǎo)入Gephi 0.9.2 軟件進(jìn)行可視化，圖片中不同顏色代表不同微生物網(wǎng)絡(luò)模塊。Mantel test 分析通過R 語言“l(fā)inkET”包實(shí)現(xiàn)，用原始微生物OTU代表群落組成，微生物α多樣性代表群落多樣性。

2 結(jié)果與討論

2.1 腐植酸淋洗前后土壤重金屬總量與形態(tài)分布變化

腐植酸淋洗前后土壤中Cd、Pb 和Zn 總量和形態(tài)分布變化如圖1 所示。腐植酸淋洗后土壤中的Cd 和Zn 含量顯著降低（P<0.05），分別降低了40.5%和26.5%，說明腐植酸淋洗可以有效去除土壤中Cd 和Zn；淋洗后Pb 含量未顯著降低（P>0.05），主要因?yàn)樵林蠵b主要以殘?jiān)鼞B(tài)（F4）存在（圖1a），可遷移性差，因此較難被淋洗去除。

圖1 腐植酸淋洗前后土壤中Cd、Pb、Zn的總量（圖a）和形態(tài)分布（圖b）變化Figure 1 Changes of the total concentration（a）and speciation distribution（b）of Cd，Pb，and Zn in the soil before and after humic acid washing and during incubation

陽離子型重金屬主要以4 種形態(tài)存在于土壤中，以酸提取態(tài)（F1）存在的重金屬遷移性強(qiáng)且易被植物吸收利用[18]；重金屬可還原態(tài)（F2）主要結(jié)合在Fe-Mn氧化物上，在厭氧或缺氧環(huán)境中不穩(wěn)定，因此可還原態(tài)有潛在的生物可利用風(fēng)險[19]；可氧化態(tài)（F3）比可還原態(tài)穩(wěn)定；殘?jiān)鼞B(tài)（F4）化學(xué)性質(zhì)最穩(wěn)定，被固定在土壤中難以遷移、轉(zhuǎn)化和被吸收。因此，土壤中重金屬的可氧化態(tài)和殘?jiān)鼞B(tài)含量越高，重金屬越穩(wěn)定。由圖1b 可知，淋洗前Cd、Pb 和Zn 主要以殘?jiān)鼞B(tài)存在于土壤中。腐植酸淋洗后當(dāng)天土壤中酸提取態(tài)Cd 和Zn所占比例分別提高了7個和12個百分點(diǎn)，說明腐植酸淋洗過程可以活化土壤中Cd 和Zn，提高其可遷移性，且腐植酸淋洗對Cd的活化效果更顯著，這可能是因?yàn)楦菜岷卸喾N活性官能團(tuán)（如羧基、酚羥基等），可與重金屬離子結(jié)合形成可溶態(tài)的有機(jī)-金屬復(fù)合物，進(jìn)而提高了其可遷移性[20]。淋洗結(jié)束后，隨著時間推移，可氧化態(tài)和殘?jiān)鼞B(tài)Cd 和Zn 的百分比逐漸提高，與淋洗結(jié)束當(dāng)天相比，第30 天時分別提高了9 個和8 個百分點(diǎn)，說明其可遷移性與生物可利用性逐漸降低。淋洗后有部分腐植酸留存于土壤中，Cd可以與腐植酸中的酚羥基、羧基形成Cd2+-腐植酸配合物，使其具有類似金屬-氧絡(luò)合物的穩(wěn)定性[21]；Zn主要通過離子交換與腐植酸結(jié)合降低可遷移性[22]。對于Pb，與對照相比，腐植酸淋洗當(dāng)天酸提取態(tài)和可還原態(tài)降低了4 個百分點(diǎn)，第30 天時降低了6 個百分點(diǎn)。Pb 不僅可以與殘存的腐植酸絡(luò)合，還可以與腐植酸-礦物復(fù)合體形成共沉淀，因此可氧化態(tài)和殘?jiān)鼞B(tài)Pb含量顯著提高[23]。

除腐植酸外，研究者目前也利用其他天然化合物（如檸檬酸、酒石酸等）進(jìn)行土壤淋洗研究，Wuana等[24]使用檸檬酸和酒石酸淋洗土壤后Cd 分別降低了38.4%和19.3%，Wang 等[25]使用亞氨基二琥珀酸淋洗土壤后Cd 和Zn 的含量分別降低了24.1%和25.4%，通過對比可發(fā)現(xiàn)腐植酸用作土壤淋洗劑時對Cd有較好的去除效果。此外，為了避免二次污染，在實(shí)際應(yīng)用中需重點(diǎn)考慮如何進(jìn)一步處理含有高濃度重金屬的淋洗液。近期學(xué)者的研究證明可以使用硫化鈉（Na2S）、乙基黃原酸鉀（PEX）、二甲基二硫代氨基甲酸鈉（DTC）等作為重金屬沉淀劑處理土壤淋洗液，同步去除土壤淋洗液中絡(luò)合態(tài)重金屬且實(shí)現(xiàn)淋洗液的回收[26]。如Na2S 中的S2-可以與淋洗液中的Cd2+和Pb2+生成圓餅片狀結(jié)構(gòu)沉淀，其中包含CdS 和PbS 等物質(zhì)[26]。在淋洗成本方面，Zhang 等[27]總結(jié)了常用的土壤淋洗劑在去除Cd 時的淋洗成本，發(fā)現(xiàn)使用腐植酸的成本遠(yuǎn)低于EDTA、EDDS 和皂素等淋洗劑，因此腐植酸可被用作綠色、高效和低成本的土壤淋洗劑。

2.2 腐植酸淋洗前后土壤理化性質(zhì)的變化

腐植酸淋洗前后土壤pH，SOC 和NH+4-N 的含量變化見表1。土壤pH 值除了在淋洗后第7 天顯著降低外（P<0.05），其他時間與對照相比均無顯著差異（P>0.05），這是因?yàn)楦菜崤c土壤中各種陽離子結(jié)合形成腐植酸-腐植酸鹽相互轉(zhuǎn)化的緩沖系統(tǒng)，對土壤的酸堿度起到調(diào)節(jié)作用[28]。與原土壤相比，土壤SOC 含量在淋洗當(dāng)天顯著提高了15.0%（P<0.05），說明腐植酸殘留可以提升土壤有機(jī)質(zhì)含量；淋洗后一直到培養(yǎng)結(jié)束土壤SOC均無顯著變化，這是由于腐植酸相比其他常被用作淋洗劑的天然小分子酸（如檸檬酸、酒石酸、草酸等）性質(zhì)穩(wěn)定、不易分解，具有良好的生物穩(wěn)定性，可以將SOC 含量穩(wěn)定在一定水平上[29]。淋洗過程會導(dǎo)致大量NH+4-N 被洗脫，土壤中NH+4-N 含量在淋洗當(dāng)天與原土壤相比下降了85.4%[30]。淋洗后，NH+4-N含量隨培養(yǎng)時間增加而逐漸增大，淋洗后第30天NH+4-N含量是淋洗后當(dāng)天的3.01 倍。這是由于腐植酸中含量較高的N元素可在土壤中溶解為NH+4-N，使土壤中NH+4-N含量逐漸提高[31]。

表1 腐植酸淋洗前后與培養(yǎng)期間土壤化學(xué)性質(zhì)變化Table 1 Changes of soil chemical properties before and after humic acid washing and during incubation

2.3 腐植酸淋洗前后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化

2.3.1 土壤微生物群落多樣性變化特征

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，相較于植物和動物，土壤微生物群落數(shù)量、結(jié)構(gòu)和多樣性易受到環(huán)境因素影響，被認(rèn)為是衡量土壤環(huán)境質(zhì)量與生態(tài)功能的重要指標(biāo)，可用于預(yù)測土壤生態(tài)系統(tǒng)及環(huán)境質(zhì)量的變化，實(shí)時反映土壤污染狀況[32-33]。在OTU 水 平上，本 研 究選 取Chao1 指 數(shù)、ACE 指 數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)來評價腐植酸淋洗前后土壤微生物的α 多樣性。Chao1 指數(shù)和ACE 指數(shù)可反映微生物群落的豐富度，Shannon 指數(shù)和Simpson指數(shù)用于衡量微生物群落的多樣性。與對照組相比，ACE和Chao1指數(shù)在淋洗后的土壤第3、7天均顯著降低（表2，P<0.05），淋洗后第7 天分別降低了9.15%和9.66%；隨后ACE和Chao1指數(shù)均顯著回升，淋洗后第30天時恢復(fù)到與對照相比無顯著差異水平（P>0.05）。這可能是因?yàn)榱芟催^程導(dǎo)致部分細(xì)菌被洗脫，進(jìn)而細(xì)菌豐富度水平降低；淋洗后淋洗液殘留物中的微量不穩(wěn)定組分會在短期內(nèi)迅速降解，作為細(xì)菌群落的能量來源，促進(jìn)其生長，因此ACE 和Chao1 指數(shù)在第30 天時恢復(fù)到原來水平[34]。Shannon 和Simpson 指數(shù)在淋洗后培養(yǎng)期間顯著提高（P<0.05），但是數(shù)值波動很小。以上結(jié)果表明土壤淋洗會洗脫微生物，但是土壤中殘留的腐植酸可以為微生物生長提供養(yǎng)分，提高細(xì)菌群落的豐富度和多樣性。

表2 腐植酸淋洗前后與培養(yǎng)期間土壤中細(xì)菌的α多樣性指數(shù)變化Table 2 Change of α diversity index of soil bacteria before and after humic acid washing and during incubation

主坐標(biāo)分析（PCoA）樣本間的空間距離可以表示細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異程度，進(jìn)而可衡量群落的β多樣性?；贐ray-Curtis 距離矩陣的PCoA 分析的前兩軸解釋度分別為64.5%和16.2%，與對照相比，腐植酸淋洗對土壤細(xì)菌群落有明顯的影響，微生物群落的β多樣性隨著淋洗后培養(yǎng)時間的不同而不同（圖2）。因此，土壤細(xì)菌群落的差異取決于腐植酸是否淋洗以及淋洗后培養(yǎng)時間的長短。

圖2 不同條件下細(xì)菌群落的主坐標(biāo)分析（PCoA）圖Figure 2 Principal coordinate analysis（PCoA）analysis of the bacteria community for different treatments

2.3.2 土壤微生物群落組成與聚類分析

圖3 為淋洗前后土壤細(xì)菌門和屬水平上的組成與聚類圖。在門分類水平上（圖3a），土壤中微生物群落以Proteobacteria（37.8%~46.6%）、Bacteroidetes（12.2%~20.2%）、Actinobacteria（9.1%~24.1%）、Chlo?roflexi（4.6%~15.1%）和Acidobacteria（1.9%~8.0%）等為主，與前人對土壤優(yōu)勢菌門的研究一致[35]。研究表明相對豐度最高的Proteobacteria 對土壤多種環(huán)境功能有重大影響，如研究者已經(jīng)證實(shí)大部分的α-Pro?teobacteria 有利于土壤的固氮、有機(jī)質(zhì)分解和植物生長[16]，Proteobacteria 菌門中還具有多種擁有涉及重金屬抗性或固定化的重金屬氧化酶基因的成員[36]。在腐植酸淋洗后的培養(yǎng)過程中，不同培養(yǎng)時間下各個門的相對豐度均存在差異（圖3b）。淋洗后，土壤中Chloroflexi、Acidobacteria、Gemmatimonadetes、Fibro?bacteres、Armatimonadetes 等菌群的相對豐度增加；Actinobacteria、Firmicutes 等菌群的相對豐度降低。Chloroflexi 在有機(jī)物降解和有效Cd 沉淀中具有重要意義，它們可以與甲烷代謝微生物群進(jìn)行共養(yǎng)相互作用[35]。Acidobacteria 對高濃度Cd 耐受性較強(qiáng)，也是土壤中重要的細(xì)菌群落，可以降解植物殘體，參與光合作用和單碳化合物代謝等多種生化行為[37-38]。Fir?micutes 攜帶許多金屬抗性基因，腐植酸淋洗降低了土壤中重金屬的污染水平，導(dǎo)致特征微生物群Fir?micutes 的相對豐度下降[39]。此外，將相對豐度前15的屬水平細(xì)菌進(jìn)行聚類分析（圖3c），發(fā)現(xiàn)Pseudar?throbacter、Planococcus、Brevundimonas、Pontibacter等屬的相對豐度在淋洗過程中均有所降低，而Thioba?cillus、OLB13、Flavisolibacter的相對豐度淋洗后逐漸上升。研究發(fā)現(xiàn)Brevundimonas可以用于重金屬的生物修復(fù)，淋洗后土壤重金屬含量下降導(dǎo)致Brevun?dimonas豐 度降低[40]。Thiobacillus和OLB13均可參 與土壤的反硝化作用，其相對豐度的提高可以促進(jìn)土壤的氮循環(huán)[41-42]。Flavisolibacte可以催化過氧化氫，以保護(hù)自身和宿主植物免受重金屬的氧化[43]。

2.3.3 土壤微生物群落網(wǎng)絡(luò)分析

微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)已被廣泛應(yīng)用于土壤中關(guān)鍵模塊和物種的識別。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩钥捎糜诿枋霾煌锓N或物種與環(huán)境因素之間相互作用的強(qiáng)度和復(fù)雜性[35]。例如，生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的模塊生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵物種（keystone）所執(zhí)行的特殊代謝功能不僅可以驅(qū)動微生物群落的形成過程，還能維持微生物群落的穩(wěn)定性[44]。本研究采用Gephi軟件對淋洗前后土壤微生物網(wǎng)絡(luò)做可視化處理（圖4a~圖b），并計算微生物網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)涮卣鳎ū?）。在腐植酸淋洗后，土壤微生物網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)數(shù)量和邊數(shù)量提高，平均路徑距離降低，這表明淋洗提高了微生物網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，同時使網(wǎng)絡(luò)中的物種聯(lián)系更加密切[13]；網(wǎng)絡(luò)模塊量增加表明淋洗后的土壤微生物結(jié)構(gòu)更有組織性。

表3 土壤淋洗前后微生物網(wǎng)絡(luò)的主要拓?fù)涮卣鱐able 3 Main topological properties of microbial communities in soil before and after washing

圖4 淋洗前（a）與淋洗后（b）土壤微生物群落OTU水平上的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)和網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的分類（c）Figure 4 Co-occurrence network of microbial communities before（a）and after washing（b）and classification of nodes within networks（c）in soils（OTU levels）

進(jìn)一步通過模塊內(nèi)連通度（Zi）和模塊間連通度（Pi）兩個拓?fù)鋮?shù)來評估共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中每個節(jié)點(diǎn)的作用（圖4c）。Zi或Pi值較高的節(jié)點(diǎn)被定義為關(guān)鍵分類單元，包括模塊樞紐（Zi≥2.5，Pi<0.62）、連接器（Zi<2.5，Pi≥0.62）和網(wǎng)絡(luò)樞紐（Zi≥2.5，Pi≥0.62）[45]。在對照土壤的微生物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中僅識別到兩個模塊樞紐，而在淋洗后土壤的微生物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中識別到1 個起關(guān)鍵作用的網(wǎng)絡(luò)樞紐、4個模塊樞紐和16個連接器。對網(wǎng)絡(luò)樞紐進(jìn)行種屬分析后鑒定為Rubellimicrobium，該細(xì)菌作為土壤功能微生物可以分泌碳水化合物來抵抗重金屬脅迫[46]。此外，模塊樞紐中的Gemmatimonas可以轉(zhuǎn)化和分解土壤有機(jī)質(zhì)[47]。連接器包括Plano?coccus、Ohtaekwangia、Ellin6067、Caenimonas、Alter?erythrobacter等細(xì)菌。其中，Pseudomonas產(chǎn)生的生物表面活性劑可以與重金屬形成絡(luò)合物[48]，Altererythro?bacter對土壤中的Cd 具有較高的耐受性[49]，Caenimo?nas可以產(chǎn)生尿素酶，為植物生長固氮[50]。

微生物的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)需要依靠一些十分活躍的物種進(jìn)行信息交換或者產(chǎn)生中間代謝產(chǎn)物以維持龐大而復(fù)雜的模塊結(jié)構(gòu)，較多的模塊樞紐可以提高微生物群落的交換效率，較多的連接器可以提高群落的穩(wěn)定性[51]。腐植酸淋洗后土壤微生物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的模塊樞紐和連接器增加，表明淋洗后土壤微生物將會更高效地進(jìn)行物質(zhì)傳輸和利用，同時抵御環(huán)境擾動的能力也更強(qiáng)。

2.4 土壤中細(xì)菌群落與環(huán)境因子的相關(guān)性分析

本研究基于Mantel test 分析（圖5），進(jìn)一步探究了生物可利用態(tài)重金屬、土壤理化性質(zhì)與微生物群落之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，土壤中酸提取態(tài)Pb 含量與SOC 和NH+4-N 含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），酸提取態(tài)Zn 含量與SOC 含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。土壤中NH+4-N、酸提取態(tài)Pb 和酸提取態(tài)Zn 與細(xì)菌群落組成存在顯著相關(guān)性（P<0.05），酸提取態(tài)Zn 與細(xì)菌群落多樣性存在顯著相關(guān)性（P<0.05）。腐植酸淋洗顯著提高了酸提取態(tài)Zn 含量，說明腐植酸淋洗引起的土壤生境變化與細(xì)菌群落的組成和多樣性密切相關(guān)[52]，已有研究表明土壤中重金屬的脅迫增強(qiáng)會對土壤微生物群落的生長、存活、多樣性、生物量等生態(tài)功能產(chǎn)生不利影響[53]。本研究進(jìn)一步對門水平上細(xì)菌優(yōu)勢類群與環(huán)境因子的關(guān)系進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析（表4）。結(jié)果表明，細(xì)菌中Acidobacteria、Chloroflexi和Armatimonadetes 與土壤的酸提取態(tài)Pb 和酸提取態(tài)Zn 呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。Gemmatimonadetes 和Deinococcus-Thermus 與土壤NH+4-N 呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。先前研究證實(shí)Gemmatimonadetes 與土壤養(yǎng)分呈顯著正相關(guān)，因此Gemmatimonadetes 的相對豐度提高可能與腐植酸淋洗期間土壤SOC 與NH+4-N含量的提高有關(guān)[54]。

表4 門水平優(yōu)勢菌群與土壤化學(xué)性質(zhì)的Pearson相關(guān)性分析Table 4 Pearson correlations of dominated species at the phylum level to chemical properties in soil

圖5 土壤化學(xué)性質(zhì)與微生物群落組成和多樣性的Mantel test 分析Figure 5 Mantel test analysis of soil chemical properties and microbial community composition and diversity

綜上，腐植酸淋洗后改變土壤中酸提取態(tài)Pb、酸提取態(tài)Zn 和NH+4-N 含量等環(huán)境因子，環(huán)境因子改變會驅(qū)動土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)變化。

3 結(jié)論

（1）腐植酸淋洗可去除土壤中的Cd 和Zn，對Pb的去除效果較差。淋洗后土壤中的Cd 和Zn 被活化，可遷移性提高；Pb 的可氧化態(tài)和殘?jiān)鼞B(tài)比例升高，可遷移性降低。

（2）腐植酸淋洗與殘留能顯著改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。淋洗后培養(yǎng)期間，細(xì)菌群落豐富度先降低后升高，群落多樣性提高；Chloroflexi、Acidobacteria、Gemmatimonadetes、Fibrobacteres、Armatimonadetes 等菌群的相對豐度增加，Actinobacteria、Firmicutes 等菌群的相對豐度降低。

（3）腐植酸淋洗后土壤微生物的相互作用和網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性提高；淋洗后土壤微生物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的模塊樞紐和連接器增加，土壤微生物將會更高效地進(jìn)行物質(zhì)傳輸和利用，同時強(qiáng)化了抵御環(huán)境擾動的能力。

（4）腐植酸淋洗會改變土壤中酸提取態(tài)Pb、Zn的含量和NH+4-N 含量等環(huán)境因子，其變化可驅(qū)動微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。