蘇熠，程誠(chéng)，王琪，劉園園，徐彥森，馮兆忠

（南京信息工程大學(xué)應(yīng)用氣象學(xué)院，南京 210044）

植物的地上部分被大量微生物定殖，Partida-Martínez 等[1]認(rèn)為不存在沒(méi)有微生物的植物。據(jù)Vorholt[2]估計(jì)，全球葉表面積約6.4×108km2，能定殖1×1026個(gè)細(xì)菌細(xì)胞，每平方米約1×1016~1×1018個(gè)細(xì)菌細(xì)胞，數(shù)量遠(yuǎn)超植物本身細(xì)胞數(shù)量。已有的研究表明，植物葉際細(xì)菌群落對(duì)植物生長(zhǎng)與健康及生態(tài)系統(tǒng)功能有重要作用。這些細(xì)菌能通過(guò)產(chǎn)生吲哚乙酸、鐵載體等促生物質(zhì)來(lái)促進(jìn)植物對(duì)養(yǎng)分的吸收，提高植物生物量；通過(guò)產(chǎn)生抗氧化酶、抗生素等物質(zhì)來(lái)抑制病原菌對(duì)植物的侵襲，提高植物對(duì)多種環(huán)境脅迫的適應(yīng)性；甚至部分細(xì)菌還具有降解污染物的功能[3-5]。

臭氧（O3）作為最具植物毒性的空氣污染物之一，其環(huán)境效應(yīng)已經(jīng)成為公眾密切關(guān)注的問(wèn)題。盡管1995—2014 年間歐洲和北美洲的大部分地區(qū)地表O3濃度有所下降，但是近年來(lái)東亞地區(qū)地表O3濃度仍呈現(xiàn)出普遍上升趨勢(shì)，尤其是中國(guó)和印度[6-7]。O3濃度升高會(huì)對(duì)植物造成一系列損害，包括葉片肉眼可見(jiàn)受損、光合作用受抑制、產(chǎn)量和品質(zhì)下降等[8-9]，O3已成為全球作物生產(chǎn)和食品安全的主要威脅之一[10]。小麥較其他農(nóng)作物對(duì)O3濃度升高更為敏感[11]。2010—2012 年間O3污染對(duì)印度和中國(guó)的小麥產(chǎn)量影響最嚴(yán)重，印度北部和中國(guó)西北部的大片地區(qū)產(chǎn)量損失超過(guò)15%[12]。Feng等[11]基于最新的O3劑量反應(yīng)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)O3污染使中國(guó)小麥產(chǎn)量下降了28.2%~36.9%。長(zhǎng)三角作為農(nóng)作物主產(chǎn)區(qū)之一，也是我國(guó)O3主要污染區(qū)之一。2014—2019 年間O3濃度升高致使該區(qū)域冬小麥年減產(chǎn)20.4%，年經(jīng)濟(jì)損失約7億美元[13]。

O3主要通過(guò)引起氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)生損害[14]；植物通過(guò)氣孔將O3吸收到質(zhì)外體內(nèi)后，O3迅速降解并產(chǎn)生活性氧，進(jìn)而干擾各種生理和酶促過(guò)程[15]。迄今，科研工作者已從生理、產(chǎn)量與品質(zhì)等方面系統(tǒng)研究了O3濃度升高對(duì)小麥的影響[16]，但是鮮有研究關(guān)注O3濃度升高對(duì)小麥葉際微生物群落的影響。

亞乙基二脲（N-[2-（2-氧代-1-咪唑烷基）乙基]-N'-苯基脲，EDU）作為一種抗O3劑被廣泛用于評(píng)價(jià)O3濃度升高對(duì)植被的影響[17]和篩選O3抗性品種[18-19]。EDU 常以葉面噴施、莖稈注射或土壤淋濕的方式施用于植物，其能有效增加植物光合色素含量、提高光合能力、改變抗氧化酶活性和抗氧化劑的濃度[20-24]?；贛eta 分析，F(xiàn)eng 等[25]發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，EDU 使O3引起的小麥葉片可見(jiàn)損傷降低76%，光合速率提高8%，地上生物量和小麥產(chǎn)量分別提高7%和15%。盡管大量研究表明EDU 可以保護(hù)植物免受O3傷害并抑制植物過(guò)早衰老，但其保護(hù)機(jī)制尚不清楚[26]。目前關(guān)于EDU 的作用機(jī)制主要包括：（1）可能通過(guò)降低氣孔導(dǎo)度來(lái)降低O3氣孔吸收通量[27]；（2）通過(guò)增加酶促或非酶促抗氧化劑去除葉片活性氧[20]；（3）作為氮肥[28]；（4）作為異生物質(zhì)，破壞激素穩(wěn)態(tài)[26]。然而EDU 對(duì)農(nóng)作物葉際微生物群落的調(diào)控研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

植物根系微生物組相關(guān)研究表明植物會(huì)召集“脅迫微生物”來(lái)應(yīng)對(duì)各種生物和非生物脅迫，且這種選擇性的富集受植物代謝和免疫相關(guān)性狀的差異驅(qū)動(dòng)[29-30]。以上發(fā)現(xiàn)表明小麥也可能通過(guò)召集葉際“脅迫微生物”來(lái)應(yīng)對(duì)O3脅迫。本研究利用完全開(kāi)放式O3熏蒸系統(tǒng)（O3-FACE）對(duì)長(zhǎng)三角地區(qū)廣泛種植的小麥品種（農(nóng)麥88）進(jìn)行O3熏蒸，同時(shí)配以EDU 葉面噴施處理，于灌漿后期采集小麥葉片樣品，利用細(xì)菌16S rRNA 基因高通量測(cè)序技術(shù)解析O3濃度升高和EDU 噴施處理對(duì)小麥葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性的影響。本研究假設(shè)：（1）O3熏蒸會(huì)改變小麥葉際細(xì)菌群落alpha和beta多樣性；（2）葉面噴施EDU也改變了葉際細(xì)菌群落alpha 和beta 多樣性，且提高葉際有益菌群豐度可能是其增強(qiáng)小麥O3耐受性的作用方式。預(yù)期結(jié)果能進(jìn)一步豐富小麥適應(yīng)O3濃度升高及EDU緩解小麥O3脅迫的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

本試驗(yàn)于2020年11月至2021年5月在江蘇省揚(yáng)州市江都區(qū)的南京信息工程大學(xué)揚(yáng)州綠色農(nóng)業(yè)研究與示范基地（32°44'N，119°25'E）開(kāi)展，該試驗(yàn)區(qū)地處長(zhǎng)江中下游平原，屬于典型的亞熱帶濕潤(rùn)氣候。2020 年，該地區(qū)年均氣溫和年均降水總量分別為16.6 ℃和1 337.8 mm，年日照時(shí)數(shù)為1 455.4 h。該地區(qū)長(zhǎng)期實(shí)行稻麥輪作，屬于典型的農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)[31]。0~15 cm 根層土壤的基本理化性質(zhì)為pH 6.8、有機(jī)質(zhì)2.06%、總氮1.1 g·kg-1、速效鉀61 mg·kg-1、有效態(tài)磷30 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)以農(nóng)麥88 作為供試植物，于2020 年11 月播種，2021年3月1日開(kāi)始利用O3-FACE 進(jìn)行兩個(gè)O3濃度的熏蒸處理，包括環(huán)境O3濃度（濃度約為40.9 mg·L-1·h-1，A 處理）和1.5 倍環(huán)境O3濃度[濃度為（59.9±2.5）mg·L-1·h-1，E 處理]，每個(gè)O3濃度設(shè)置4 個(gè)FACE圈重復(fù)，每個(gè)FACE 圈為直徑14 m 的正八邊形，各圈之間間隔大于50 m，以避免相互干擾。O3發(fā)生器（HY003，濟(jì)南創(chuàng)成科技有限公司）產(chǎn)生的O3與空氣混合后通過(guò)置于冠層上方的布?xì)夤茚尫诺紽ACE 圈內(nèi)，并利用自動(dòng)化控制中心對(duì)FACE 圈內(nèi)O3濃度進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，確保FACE 圈內(nèi)O3濃度維持在正常范圍內(nèi)。晴朗天氣每日熏蒸10 h（8：00—18：00），陰雨天則停止熏蒸，實(shí)際熏蒸49 d，O3濃度控制偏差率基本在15%以內(nèi)（圖1）。每個(gè)FACE圈設(shè)有3 m×3 m的亞區(qū)，熏蒸10 d 后開(kāi)始對(duì)小麥進(jìn)行葉面噴施450 mg·L-1EDU[32]，以澆等量的水作為對(duì)照（水）處理，在噴施時(shí)，每株小麥的葉片能掛住溶液即可。每隔10 d 葉面噴施EDU溶液一次，如果噴施后的第二天遇上雨天則需要進(jìn)行補(bǔ)噴，試驗(yàn)期間共噴施EDU 6次。

圖1 O3-FACE平臺(tái)10 h（8：00—18：00）O3濃度平均值的動(dòng)態(tài)變化Figure 1 Variations of mean O3 concentrations in 10 h（8：00—18：00）

各圈播種時(shí)間、種植密度和日常管理均與周?chē)筇锵嗤?。其中，肥料按氮?20 kg·hm-2，磷肥（P2O5）和鉀肥（K2O）均75 kg·hm-2的標(biāo)準(zhǔn)分別施入各圈，氮肥為尿素，磷肥和鉀肥均為復(fù)合肥。

1.3 葉片樣品收集與葉際微生物提取

于2021 年5 月13 日（即小麥灌漿期）采集葉片樣品，用卷尺測(cè)定株高。雙手用75%酒精消毒后，用表面消毒過(guò)的剪刀取各FACE 圈內(nèi)小麥倒二葉（每個(gè)FACE 圈內(nèi)每個(gè)小麥品種各取兩穴，20 株左右），每穴葉片樣品混合后放入無(wú)菌的牛皮紙袋帶回實(shí)驗(yàn)室備用。參考Wang等[33]的方法收集葉際微生物，取5片小麥葉片，浸入裝有300 mL無(wú)菌PBS緩沖液（0.02 mmol·L-1，pH 7.0，0.1%Tween 80）的1 L 三角瓶中，搖床28 ℃振蕩1 h后，再超聲振蕩20 min。利用孔徑為0.22 μm的濾膜抽真空富集葉際微生物，然后置于-80 ℃?zhèn)溆?。按Fast DNA spin 試劑盒（MP Biomedicals LLC，美國(guó)）的使用說(shuō)明書(shū)提取葉際微生物基因組總DNA，DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，采用NanoDrop?2000分光光度計(jì)（Thermo Scientific，美國(guó)）測(cè)定其濃度。

1.4 PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

利用引物799R/1993F 對(duì)葉際細(xì)菌16S rRNA 基因序列進(jìn)行擴(kuò)增[34]。每個(gè)引物上都連接了12 bp的獨(dú)特的barcode 以區(qū)分不同樣品。PCR 在50 μL 擴(kuò)增體系中進(jìn)行，包括25 μL PrimeSTAR Max Premix（2×）（TAKARA，大連）、正反向引物（Invitrogen，上海）各0.5 μL、1 μL DNA 模板（含DNA 10 ng）和23 μL 雙蒸水。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min 后，擴(kuò)增20 個(gè)循環(huán)（95 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s），最后72 ℃延伸3 min[35]。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，使用AxyPre PCR 清潔系統(tǒng)（Axygen，杭州）對(duì)其進(jìn)行純化。將純化后的PCR 產(chǎn)物等摩爾質(zhì)量混合后，利用Illumina MiSeq 測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序。原始數(shù)據(jù)已于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得登錄號(hào)（SRP375487）。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

參照Wang等[36]的方法，利用i-Sanger（http：//www.i-sanger.com）云數(shù)據(jù)分析平臺(tái)處理高通量測(cè)序獲得的細(xì)菌16S rRNA 基因序列。原始數(shù)據(jù)質(zhì)控處理后，利用UCLST 將高質(zhì)量序列聚類成OTU（相似性不低于97%）[37]。利用RDP 數(shù)據(jù)對(duì)每個(gè)OTU 進(jìn)行鑒定，置信閾值為0.80[38]。為避免不同測(cè)序深度對(duì)結(jié)果分析產(chǎn)生干擾，從每份樣本中隨機(jī)抽取15 000條序列進(jìn)行后續(xù)alpha和beta多樣性分析。

以香農(nóng)指數(shù)（Shannon）[39]和辛普森指數(shù)（Simp?son）[40]來(lái)表征細(xì)菌群落的alpha 多樣性?；贐ray-Curtis 距離計(jì)算方法，采用非度量多維尺度（NMDS）和主坐標(biāo)分析（PCoA）對(duì)不同處理樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行聚類分析。利用Shapiro-Wilk 和Levene 檢驗(yàn)檢查數(shù)據(jù)的正態(tài)分布和方差齊性后，用JMP 10.0軟件中的雙因素方差分析（ANOVA）來(lái)解析O3、EDU 及其相互作用對(duì)株高、葉際細(xì)菌群落alpha 多樣性及優(yōu)勢(shì)種群相對(duì)豐度的影響。利用Tukey-Kramer HSD 檢驗(yàn)不同處理間的顯著差異性[31]。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)小麥生長(zhǎng)的影響

如圖2所示，在對(duì)照處理?xiàng)l件下，E處理顯著降低了小麥株高（較A處理降低了9.4%）。A處理?xiàng)l件下，噴施EDU對(duì)小麥株高沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響。E處理?xiàng)l件下，噴施EDU 使小麥株高提高了11.0%（P<0.05）。O3和EDU的交互作用對(duì)小麥株高沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響。

圖2 O3濃度升高和EDU葉面噴施對(duì)灌漿期小麥株高的影響Figure 2 Effects of O3 and EDU leaf spraying on plant height

2.2 對(duì)小麥葉際細(xì)菌群落alpha多樣性的影響

如表1 所示，不同處理樣品細(xì)菌群落的覆蓋度（在序列97%的相似度的水平上）均高于0.97，表明本試驗(yàn)的測(cè)序深度包含了大多數(shù)細(xì)菌群落，能滿足后續(xù)序列分析的需要。不同處理?xiàng)l件下Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)沒(méi)有發(fā)生顯著變化，說(shuō)明O3濃度升高、EDU 噴施及其交互作用均對(duì)小麥葉際細(xì)菌群落alpha多樣性沒(méi)有顯著影響。

表1 不同試驗(yàn)處理?xiàng)l件下小麥葉際細(xì)菌群落alpha多樣性指數(shù)Table 1 Alpha-diversity indices of phyllosphere bacterial community of NM88 under different treatments

2.3 對(duì)小麥葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

基于不同樣品間的Braye-Curtis 相似距離計(jì)算，采用NMDS和PCoA 對(duì)不同樣品葉際細(xì)菌群落進(jìn)行聚類分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在NMDS圖和PCoA圖上A-水、AEDU、E-水、E-EDU 4 種處理的試驗(yàn)樣品分別聚成了不同的圈（圖3），這表明O3濃度升高和EDU噴施均改變了小麥葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

圖3 不同處理?xiàng)l件下細(xì)菌群落的非度量多維尺度分析（NMDS）和主坐標(biāo)分析（PCoA）Figure 3 Nonmetric multidimensional scaling（NMDS）analysis and principal coordinates analysis（PCoA）plot depicts the Bray–Curtis distance of bacterial communities in different treatments

2.4 對(duì)小麥葉際細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的影響

門(mén)水平上，小麥葉際細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為Proteobac?teria（84.7%~94.8%）、Bacteroidota（1.3%~13.1%）、Fir?micutes（1.6%~5.4%）。其中，Proteobacteria 中最優(yōu)勢(shì)綱為Gammaproteobacteria，占總細(xì)菌群落的75.2%~94.3%。如圖4所示，水處理?xiàng)l件下，O3濃度升高提高了Gammaproteobacteria 和Alphaproteobacteria 的相對(duì)豐度，但是未達(dá)到顯著水平。EDU 處理?xiàng)l件下，O3濃度升高使葉際Gammaproteobacteria 的相對(duì)豐度降低了14.3%（P<0.05），同時(shí)顯著提高了Alphaproteobacte?ria 和Bacteroidetes 的相對(duì)豐度（與對(duì)照相比分別提高了1.4倍和8.7倍）。

圖4 O3濃度升高、EDU噴施及其交互作用對(duì)小麥葉際優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)相對(duì)豐度的影響Figure 4 Effects of O3，EDU and their interaction on the relative abundance of dominant bacterial phyla inhabiting phyllosphere and endosphere of rice leaves

A 處理中，EDU 噴施使Gammaproteobacteria 的相對(duì)豐度增加了9.7%（P<0.05），并使Bacteroidetes 的相對(duì)豐度降低了65.8%（P<0.05）。E 處理中，EDU 噴施卻使Gammaproteobacteria 的相對(duì)豐度降低了12.3%，使Bacteroidetes 的相對(duì)豐度增加了1.9 倍。O3和EDU的交互作用對(duì)Gammaproteobacteria 和Bacteroidetes 的相對(duì)豐度產(chǎn)生了顯著影響（P<0.001）。

2.5 對(duì)小麥葉際細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種屬的影響

將總的葉際細(xì)菌群落中相對(duì)豐度高于1%的屬定義為優(yōu)勢(shì)屬，發(fā)現(xiàn)所有樣品中農(nóng)麥88 的優(yōu)勢(shì)屬相對(duì)豐度由高到低依次為Pseudomonas（21.8%）、Pan?toea（17.1%）、Duganella（9.7%）、Serratia（7.2%）、Er?winia（5.0%）、Sphingomonas（3.5%）、Paenibacillus（3.0%）、Massilia（2.6%）。

如 表2 所示，O3濃 度升高 對(duì)Massilia、Pantoea、Pseudomonas和Serratia的相對(duì)豐度產(chǎn)生了顯著影響。水和EDU 處理?xiàng)l件下，O3濃度升高使Pseudomonas和Serratia相對(duì)豐度均較A 處理分別顯著下降了50.6%~57.2%和41.4%~65.5%。EDU 處理?xiàng)l件下，O3濃度升高使Massilia相對(duì)豐度顯著下降了25.8%，而水處理下O3濃度升高對(duì)其相對(duì)豐度則無(wú)顯著影響。O3濃度升高僅在水處理?xiàng)l件下使Pantoea相對(duì)豐度顯著提高了5.7倍。

表2 O3濃度升高、EDU葉片噴施及其相互作用對(duì)葉際優(yōu)勢(shì)屬（占比1%以上）相對(duì)豐度的影響Table 2 Main effects of elevated O3，EDU leaf spraying，and their interaction on the relative abundance of abundant genus（more than 1%）

EDU噴施對(duì)Erwinia、Massilia和Pseudomonas的相對(duì)豐度產(chǎn)生了顯著影響。如表2 所示，E 處理下EDU使Erwinia相對(duì)豐度顯著下降了73.0%，而A 處理下EDU 對(duì)其相對(duì)豐度則無(wú)顯著影響。EDU 在A 處理?xiàng)l件下使Massilia和Pantoea相對(duì)豐度分別顯著提高了46.7%和274.0%。A 和E 處理下EDU 均降低了Pseu?domonas的相對(duì)豐度，但未達(dá)到顯著水平。O3和EDU的 交 互 作 用 對(duì)Duganella、Paenibacillus、Pantoea和Sphingomonas的相對(duì)豐度產(chǎn)生了顯著影響。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境O3濃度由40.9 mg·L-1·h-1升高至（59.9±2.5）mg·L-1·h-1對(duì)小麥的生長(zhǎng)有抑制作用，具體表現(xiàn)為降低了小麥的株高（圖2）。之前的研究通過(guò)盆栽和田間試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)O3濃度升高顯著降低了小麥的生物量[41-42]。其主要作用機(jī)制為具有強(qiáng)氧化性的O3通過(guò)氣孔進(jìn)入植物體內(nèi)后經(jīng)一系列生化反應(yīng)產(chǎn)生活性氧自由基（ROS），ROS 進(jìn)一步破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，造成植物生理代謝混亂，進(jìn)而減弱光合作用并抑制生長(zhǎng)[43]。而EDU 處理能使小麥保持較高的抗氧化酶活性和較高濃度的抗氧化劑，以保護(hù)細(xì)胞免受O3誘導(dǎo)的ROS 的傷害，維持葉片中較高的光合色素和蛋白質(zhì)水平[27]，并將更多的光合作用物質(zhì)轉(zhuǎn)移到生殖部位，從而提高產(chǎn)量。Tiwari 等[44]發(fā)現(xiàn)葉面噴施300 mg·L-1EDU 顯著提高了印度小麥（品種M533）的株高；本研究也發(fā)現(xiàn)在環(huán)境O3濃度和1.5 倍環(huán)境O3濃度條件下噴施EDU 均提高了小麥株高，尤其是1.5 倍環(huán)境O3濃度條件下噴施EDU 對(duì)小麥的促生作用更明顯（圖2）。Shang 等[45]利用開(kāi)頂箱式O3熏蒸系統(tǒng)（OTC）通過(guò)盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在環(huán)境O3濃度[（39.6±1.9）mg·L-1·h-1]下葉面噴施EDU 能完全緩解水稻的O3脅迫，而在高濃度O3[（87.3±0.9）mg·L-1·h-1]下葉面噴施EDU 則部分緩解了O3脅迫。由此可知，葉面噴施EDU 對(duì)O3脅迫的緩解效果可能因品種和試驗(yàn)條件的不同而異。

生態(tài)系統(tǒng)多樣性越豐富，其對(duì)環(huán)境變化的耐受性也越高[46]。Wang 等[47]利用OTC 熏蒸系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，較之于炭過(guò)濾大氣，環(huán)境O3濃度升高40 mg·L-1·h-1時(shí)顯著提高了雜交稻南粳5055 葉際細(xì)菌生物多樣性，這可能是南粳5055對(duì)O3脅迫的一種積極應(yīng)對(duì)策略。本研究中1.5 倍環(huán)境O3濃度與葉片EDU 噴施處理及其相互作用，均沒(méi)有顯著影響葉際細(xì)菌群落的alpha 多樣性（表1）。研究結(jié)論的不一致可能與作物品種、O3熏蒸濃度及熏蒸方式相關(guān)。

本研究中葉際細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)按相對(duì)豐度由高到低排列依次是Proteobacteria、Bacteroidota 和Firmicutes，根據(jù)已有的報(bào)道可知這3個(gè)菌門(mén)為植物葉際優(yōu)勢(shì)菌門(mén)[2，8，48]，與韓筱璇[49]和Xu等[50]的研究結(jié)果一致，本研究也發(fā)現(xiàn)Gammaproteobacteria 是小麥葉際最優(yōu)勢(shì)的種群?；诤昊蚪M研究，Sessitsch 等[51]發(fā)現(xiàn)在植物葉際占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的Gammaproteobacteria 參與了氮循環(huán)。氮是所有活細(xì)胞中尿素、氨基酸（蛋白質(zhì)）、核酸（DNA和RNA）、三磷酸腺苷（ATP）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的基本成分[52]，另外氮也是植物光合作用所必需的葉綠素的重要成分[53]。由微生物介導(dǎo)的氨化作用、硝化作用等氮循環(huán)過(guò)程能為植物提供速效和豐富的氮源，因此對(duì)植物生長(zhǎng)與產(chǎn)量具有重要意義。由此可知Gammaproteobacteria 可能在維持植物生長(zhǎng)與健康中起重要作用。另外Gammapro?teobacteria 也被報(bào)道能幫助植物抵御外部生物、非生物因子的干擾[54]。

PCoA 結(jié)果表明O3濃度升高和葉面噴施EDU 均顯著改變了小麥葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)（圖3）。本研究發(fā)現(xiàn)水處理?xiàng)l件下O3濃度升高對(duì)Gammaproteobacte?ria 沒(méi)有顯著影響（圖4），這表明Gammaproteobacteria在維持小麥葉際細(xì)菌群落穩(wěn)定性中扮演了重要角色。另外在環(huán)境O3濃度條件下EDU 的噴施顯著提高了Gammaproteobacteria 的相對(duì)豐度，這可能是由于EDU為葉際細(xì)菌提供了豐富的氮源，而Gammaproteobacte?ria 是葉際氮循環(huán)的重要參與者。另外在本研究中，在O3濃度升高條件下葉面噴施EDU 顯著提高了Bac?teroidetes 的相對(duì)豐度，而在環(huán)境O3濃度下EDU 反而降低了Bacteroidetes的相對(duì)豐度（圖4）。Bacteroidetes從人類腸道到海洋水環(huán)境等各種環(huán)境都有著較高的豐度，盡管數(shù)據(jù)庫(kù)中儲(chǔ)存的屬于Bacteroidetes 的菌株序列并不多[55]。長(zhǎng)期以來(lái)，滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)被認(rèn)為是Bacte?roidetes 的一個(gè)標(biāo)志性特征，它允許菌株主動(dòng)運(yùn)動(dòng)到葉片表面具有更多水分和養(yǎng)分的有利位置，并可能通過(guò)對(duì)養(yǎng)分或植物信號(hào)分子的趨化作用來(lái)輔助完成該過(guò)程[56]。Bacteroidetes 在進(jìn)化過(guò)程中還保留了高效節(jié)能的ACIIIcaa3COX 呼吸超復(fù)合體，這提高了它們競(jìng)爭(zhēng)高分子量碳水化合物的適應(yīng)性[56]。另外，Bacte?roidetes 可以利用柔紅素家族色素作為紫外線保護(hù)劑[57]。綜上說(shuō)明Bacteroidetes 對(duì)脅迫環(huán)境具有更強(qiáng)的適應(yīng)性。因此，環(huán)境O3濃度下噴施EDU 為葉際細(xì)菌提供了豐富的氮源，從而降低了Bacteroidetes 的相對(duì)豐度；而1.5 倍環(huán)境O3濃度下小麥生長(zhǎng)受到脅迫，葉面噴施EDU 可能通過(guò)提高Bacteroidetes 的相對(duì)豐度來(lái)增強(qiáng)小麥對(duì)O3脅迫的適應(yīng)性；但該結(jié)論仍需要后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

相對(duì)于棲息在植物地下部的微生物，葉際微生物在更開(kāi)放的生境中面臨更多環(huán)境壓力[2]，葉際微生物勢(shì)必需要采取不同的策略應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力以便在小麥葉片定殖。研究表明，Pantoea作為葉際細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)屬，在固氮、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和抵御病原菌侵害中起重要作用[5]。本研究中水處理?xiàng)l件下O3濃度升高顯著提高了葉際Pantoea的相對(duì)豐度（表2），這可能是小麥自主適應(yīng)O3脅迫而提高葉際細(xì)菌氮素利用效率的一種適應(yīng)性策略。另外，葉際的優(yōu)勢(shì)菌屬Pseu?domonas和Sphingomonas也具有通過(guò)色素沉著來(lái)避免紫外線輻射的功能。優(yōu)勢(shì)屬M(fèi)assilia在植物表面的定殖能力很強(qiáng)，能通過(guò)產(chǎn)生吲哚乙酸、鐵載體有效促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，且其對(duì)微生境中養(yǎng)分的可用性與競(jìng)爭(zhēng)也非常敏感，能通過(guò)產(chǎn)鐵載體和纖維素酶等途徑有效抵御包括Pythium等在內(nèi)的植物病原菌的侵襲[58]。綜上可知，葉際細(xì)菌從葉片表面獲得穩(wěn)定的微生境的同時(shí)也對(duì)植物生長(zhǎng)有利。

了解葉際微生物的驅(qū)動(dòng)因素是制定植物管理策略的第一步，能促進(jìn)形成健康的葉際微生物群落結(jié)構(gòu)，從而有利于植物的健康和生態(tài)功能[59]。一般來(lái)說(shuō)，植物微生物群落結(jié)構(gòu)由植物基因型、土壤、植物發(fā)育階段、植物組織、氣候和人類活動(dòng)等因素決定[60-61]。作為一個(gè)開(kāi)放的生境，葉際微生物比內(nèi)生菌對(duì)非生物因素（包括輻射、干旱、風(fēng)速等）更為敏感[2]。Ueda等[62]認(rèn)為O3脅迫下不同程度的碳源有效性（如揮發(fā)性有機(jī)物VOCs 利用率）可能會(huì)影響水稻葉際微生物養(yǎng)分的有效性，從而影響微生物群落的組成。植物VOCs 排放對(duì)植物表面微生物群落的形成起重要作用[63]，然而這一觀點(diǎn)仍需通過(guò)進(jìn)一步的試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。Yan 等[64]發(fā)現(xiàn)葉片的形貌特征在葉際細(xì)菌群落的形成過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。此外，電解質(zhì)滲漏、葉片表面脂質(zhì)轉(zhuǎn)化和蠟質(zhì)也可能對(duì)葉際微生物產(chǎn)生影響。這些生理參數(shù)將在今后的研究中進(jìn)一步探討。

另外，盡管本試驗(yàn)為O3濃度升高、EDU 噴施及其交互作用對(duì)小麥葉際微生物群落的影響提供了新的見(jiàn)解和重要視角，但還需要更多的試驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)闡明O3濃度升高和EDU 噴施對(duì)不同小麥品種的不同生長(zhǎng)階段葉際微生物菌群的持續(xù)影響與重演性。特別是葉際微生物群落alpha多樣性和群落結(jié)構(gòu)與小麥產(chǎn)量之間的關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

（1）O3濃度升高降低了農(nóng)麥88 的株高，葉面噴施EDU能有效緩解O3脅迫對(duì)小麥生長(zhǎng)的抑制。

（2）O3濃度升高、EDU葉面噴施顯著改變了農(nóng)麥88葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，但對(duì)alpha多樣性沒(méi)有顯著影響。

（3）農(nóng)麥88 葉際優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)相對(duì)豐度由高到低依次為Proteobacteria、Bacteroidotes 和Firmicutes，其中Gammaproteobacteria 為最優(yōu)勢(shì)綱；O3濃度升高條件下EDU 顯著降低了Gammaproteobacteria 的相對(duì)豐度，同時(shí)提高了Bacteroidetes 的相對(duì)豐度；EDU 可能通過(guò)提高逆境適應(yīng)性強(qiáng)的Bacteroidetes 的相對(duì)豐度來(lái)增強(qiáng)小麥對(duì)O3脅迫的適應(yīng)性。