苗淑斐, 李路怡, 錢 樂, 徐建強, 姜 佳, 劉圣明

(河南科技大學 園藝與植物保護學院 植物保護系，河南 洛陽 471023)

由核盤菌Sclerotinia sclerotiorum引起的菌核病是油菜生產(chǎn)上的重要病害，在我國各地區(qū)均有發(fā)生，以長江中下游和東南沿海最為嚴重，發(fā)病率在10%～80%之間，產(chǎn)量損失在5%～30%之間[1-2]。菌核病在油菜幼苗至成株期間均可發(fā)生，其中在花期發(fā)生較為嚴重，可危害植株上部各部位，尤以莖稈受害最嚴重[3-5]。由于目前尚未發(fā)現(xiàn)高抗菌核病的油菜品種，每年都會因菌核病而遭受巨大的經(jīng)濟損失[6-7]。油菜菌核病在生產(chǎn)中的防治主要采用在油菜主莖開花95%時，噴施苯并咪唑類殺菌劑多菌靈、二甲酰亞胺類殺菌劑菌核凈和三唑類殺菌劑戊唑醇等化學藥劑[8-11]，但是由于長期使用單一化學藥劑，容易導致病原菌對其產(chǎn)生抗藥性，使其田間防治效果下降[12-13]。因此，迫切需要不同作用機制的新型殺菌劑用來防控油菜菌核病。

氟吡菌酰胺 (fluopyram) 是拜耳作物科學公司開發(fā)的一種吡啶-乙基-苯甲酰胺琥珀酸脫氫酶抑制劑類 (SDHI) 殺菌劑，2009 年上市，具有廣泛的殺菌譜，對菌核病菌、灰霉病菌、白粉病菌和靶斑病菌等多種病原真菌具有較好的抑菌活性[14-15]。而2010 年至今，氟吡菌酰胺在我國僅登記用于黃瓜等作物白粉病、灰霉病、靶斑病和根結線蟲的防治。目前，其尚未在油菜上獲得登記 (http://www.chinapesticide.org.cn/)，關于河南省油菜菌核病菌對氟吡菌酰胺的敏感性也未見報道。因此，本研究采用菌絲生長速率法測定了2015 年和2016 年從河南省5 個地市采集的127 株油菜菌核病菌對氟吡菌酰胺的敏感性，建立了油菜菌核病菌對氟吡菌酰胺的敏感性基線；同時，采用菌絲生長速率法測定了氟吡菌酰胺、丙硫菌唑、葉菌唑、多菌靈、咯菌腈和菌核凈6 種殺菌劑及其復配劑對油菜菌核病菌的聯(lián)合毒力，旨在為河南省油菜菌核病菌對氟吡菌酰胺的抗藥性監(jiān)測和油菜菌核病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 2015—2016 年從河南省平頂山、漯河、周口、鄭州和駐馬店5 個地市采集并單菌核分離得到127 株油菜菌核病菌菌株，由河南科技大學殺菌劑生物學實驗室保存。

1.1.2 供試藥劑 供試殺菌劑均為原藥，96%氟吡菌酰胺 (fluopyram)，拜耳作物科學 (中國) 有限公司；97%丙硫菌唑 (prothioconazole)，山東海利爾化工有限公司；95%葉菌唑 (metconazole)，江蘇輝豐生物農(nóng)業(yè)股份有限公司；98% 多菌靈(carbendazim)，江蘇龍燈化學有限公司；98%咯菌腈 (fludioxonil)，先正達農(nóng)作物保護股份公司；95%菌核凈 (dimethachlone)，江西禾益化工股份有限公司。將多菌靈原藥預溶于0.1 mol/L 稀鹽酸，氟吡菌酰胺、丙硫菌唑、葉菌唑、咯菌腈和菌核凈原藥分別預溶于丙酮，配制成至質(zhì)量濃度為104μg/mL 的母液，置于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15～20 g，蒸餾水1 L。

1.2 試驗方法

1.2.1 油菜菌核病菌對氟吡菌酰胺的敏感性 采用菌絲生長速率法測定[16]。將氟吡菌酰胺母液系列稀釋，按照一定的比例分別加入到經(jīng)滅菌熱熔冷卻至50～55 ℃的PDA 培養(yǎng)基中，制成含氟吡菌酰胺0.0016、0.0063、0.025、0.10 和0.40 μg/mL系列質(zhì)量濃度的PDA 平板，以加入等體積丙酮、不加藥劑的PDA 平板作為對照。將供試菌株在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)2 d，在菌落邊緣打取直徑為5 mm 的菌餅，轉移至PDA 平板上。將PDA平板置于恒溫培養(yǎng)箱中，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)2 d，采用“十”字交叉法測量菌落直徑，記錄各菌落平均直徑。各處理3 次重復，試驗重復3 次。按公式 (1) 計算各濃度處理下藥劑對菌絲的生長抑制率(I)[17]。

式中：Dck為對照菌落直徑，cm；Dt為處理菌落直徑，cm。利用DPS 軟件，通過抑制率幾率值 (y)與藥劑質(zhì)量濃度對數(shù)值 (x) 之間的線性回歸關系，求出毒力回歸方程、有效抑制中濃度(EC50值) 及相關系數(shù)。

1.2.2 敏感性分布圖繪制 將供試的油菜菌核病菌群體對氟吡菌酰胺的敏感性由高到低分成不同的區(qū)間，統(tǒng)計各菌株EC50值在每個區(qū)間的分布頻率 (%)。以EC50值的區(qū)間范圍為橫坐標，對應區(qū)間EC50值的頻率為縱坐標，繪制油菜菌核病菌對氟吡菌酰胺的敏感性頻率分布圖，建立其敏感性基線。

1.2.3 殺菌劑單劑及其復配劑對油菜菌核病菌對的毒力測定 采用菌絲生長速率法[16]，測定氟吡菌酰胺、丙硫菌唑、葉菌唑、多菌靈、咯菌腈、菌核凈6 種單劑以及氟吡菌酰胺與其他5 種藥劑分別按照母液體積比為1 : 5、1 : 3、1 : 1、3 : 1、5 : 1 的復配劑對油菜菌核病菌菌株ZZ1606 的毒力。將各單劑和復配劑進行系列稀釋，按照一定的比例分別加入到經(jīng)滅菌熱熔后冷卻至50～55 ℃的PDA 培養(yǎng)基中，制成含氟吡菌酰胺、丙硫菌唑、葉菌唑、多菌靈、咯菌腈、菌核凈單劑及其各復配劑系列質(zhì)量濃度的PDA 平板(表1)。以加入等體積對應溶劑、不加藥劑的PDA 平板為對照。按照1.2.1 節(jié)敏感性測定和計算方法，求出各單劑及其復配劑的EC50值。利用公式 (2) 求出各復配劑理論抑制中濃度[EC50(Exp)]，利用公式 (3) 求出增效系數(shù) (SR) 值，當SR 值大于1.5 時為增效作用，在0.5 和1.5 之間為相加作用，小于0.5 時為拮抗作用[18]。

表1 供試殺菌劑及其復配劑對油菜菌核病菌毒力測定使用的濃度梯度Table 1 The concentration of the fungicide and their mixtures was used to determine the toxicity to Sclerotinia sclerotiorum

式中：A，B 為復配的藥劑；a，b為藥劑在配方中所占的比例；EC50(Exp)為理論抑制中濃度，μg/mL；EC50(Obs)為實際測量抑制中濃度，μg/mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)分析利用Excel 2013 和DPS v7.05統(tǒng)計軟件，得出藥劑抑制菌絲生長的毒力回歸方程、相關系數(shù)r和EC50值，采用顯著性最小差異法 (Least-Significant Difference, LSD,P＜ 0.05) 進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 油菜菌核病菌對氟吡菌酰胺的敏感性

測定結果 (表2) 顯示：氟吡菌酰胺對河南省127 株油菜菌核病菌的EC50值范圍為0.0100～0.0989 μg/mL，平均值為 (0.0546 ± 0.0228) μg/mL。不同地市間的菌株對氟吡菌酰胺的敏感性差異不顯著：平均EC50值變化范圍在 (0.0482 ± 0.0240)～(0.0609 ± 0.0138) μg/mL 之間，其中從鄭州分離鑒定到的菌株對氟吡菌酰胺最敏感，從駐馬店分離鑒定到的菌株對氟吡菌酰胺最不敏感。氟吡菌酰胺對各市菌株的平均EC50值與其對127 株菌株的平均EC50值無顯著差異。

表2 2015—2016 年河南省油菜菌核病菌對氟吡菌酰胺的敏感性Table 2 The sensitivity of S. sclerotiorum to fluopyram in Henan Province from 2015 to 2016

2.2 油菜菌核病菌對氟吡菌酰胺的敏感性基線分析

從頻率分布直方圖可以看出，供試油菜菌核病菌菌株對氟吡菌酰胺的敏感性呈連續(xù)單峰曲線(圖1)，EC50最大值為最小值的9.89 倍，70%以上菌株的EC50值小于0.07 μg/mL，未發(fā)現(xiàn)敏感性下降的亞群體，表明氟吡菌酰胺對油菜菌核病菌菌絲生長具有較強的抑制作用，可將 (0.0546 ±0.0228) μg/mL 作為河南省油菜菌核病菌對氟吡菌酰胺的敏感性基線。

圖1 河南省127 株油菜菌核病菌對氟吡菌酰胺的EC50 值分布曲線Fig.1 The distributed curve of EC50 value of fluopyram to 127 S. sclerotiorum isolates in Henan Province

2.3 殺菌劑及其復配劑對油菜菌核病菌的毒力

采用菌絲生長速率法測定 結果 (表3) 顯示：氟吡菌酰胺、丙硫菌唑、葉菌唑、多菌靈、咯菌腈和菌核凈6 種殺菌劑對菌株ZZ1606 的EC50值范圍在0.0175～0.8978 μg/mL 之間，表明6 種藥劑對油菜菌核病菌的菌絲生長均具有較好的抑制效果。

表3 氟吡菌酰胺及其復配劑對油菜菌核病菌的毒力Table 3 Toxicity of fluopyram and its mixtures to S. sclerotiorum

將氟吡菌酰胺與丙硫菌唑、葉菌唑、多菌靈、咯菌腈和菌核凈分別按照1 : 5、1 : 3、1 : 1、3 : 1、5 : 1 體積比進行兩元復配，測定復配劑對油菜菌核病菌的聯(lián)合毒力。結果 (表3) 表明，不同組合、不同配比的復配劑對油菜菌核病菌的毒力不同，SR 值范圍在0.51～5.86 之間，表現(xiàn)為相加作用或增效作用，其中V(氟吡菌酰胺) :V(咯菌腈) = 1 : 1 時，SR 值最大，增效作用最強。

3 結果與討論

氟吡菌酰胺是一種新型的琥珀酸脫氫酶抑制劑類 (SDHI) 殺菌劑，是廣譜高效內(nèi)吸性殺菌劑，具有保護和治療作用，通過作用于線粒體呼吸鏈的蛋白復合物Ⅱ，抑制琥珀酸脫氫酶的活性，從而抑制了病原菌的呼吸作用，使其能量代謝受阻礙，最終使病原菌的生長受到抑制[19-20]。本研究通過菌絲生長速率法測定了油菜菌核病菌對氟吡菌酰胺及其復配劑的敏感性，結果表明，氟吡菌酰胺對油菜菌核病菌菌絲生長具有較好的抑制作用。黃學屏等采用菌絲生長速率法測定了2016—2017年山東省不同蔬菜產(chǎn)區(qū)173 株來自黃瓜、番茄、茄子、西葫蘆、蕓豆和辣椒6 種作物上的菌核病病菌對氟吡菌酰胺的敏感性，結果顯示，氟吡菌酰胺對173 株菌核病菌的EC50值分布范圍為0.02～0.30 μg/mL，平均值為 (0.11 ± 0.01) μg/mL，EC50頻率分布呈單峰曲線[21]。本研究的敏感性測定結果顯示，氟吡菌酰胺對供試的127 株油菜菌核病菌的EC50值范圍在0.0100～0.0989 μg/mL 之間，平均值為 (0.0546 ± 0.0228) μg/mL，EC50頻率分布也是呈單峰曲線。同時，兩地均未發(fā)現(xiàn)敏感性下降的亞群體。與山東省菌株相比，EC50頻率分布范圍更窄，菌株對氟吡菌酰胺的敏感性更高，這可能與菌株的寄主不同或者菌株的群體多樣性有關。目前，氟吡菌酰胺尚未登記在油菜菌核病的防控上，本研究采集的油菜田塊從未有使用過氟吡菌酰胺，因此，此平均EC50值 (0.0546 ± 0.0228)μg/mL 可以作為河南省油菜菌核病菌對氟吡菌酰胺的敏感性基線，為河南省油菜菌核病菌對氟吡菌酰胺的抗藥性監(jiān)測提供理論依據(jù)。

SDHI 類殺菌劑的作用位點單一，長期使用單一藥劑，易導致病原菌抗藥性群體的出現(xiàn)[21-23]。目前，田間已經(jīng)檢測到了抗SDHI 類殺菌劑啶酰菌胺的灰葡萄孢菌Botrytis cinerea、茄絲核菌Rhizoctonia solani、鏈格孢菌Alternaria alternata和茄鏈格孢菌A.solani等病原菌亞群體[24-26]。但是，關于油菜菌核病菌對SDHI 類殺菌劑的田間抗藥性群體報道較少[27-28]。毛玉帥采用菌絲生長抑制法測定了2018 和2019 年江蘇省油菜菌核病菌對啶酰菌胺的抗藥性，結果未檢測到啶酰菌胺抗性菌株[27]。但是，Li 等對2014 年從四川省采集的399 株油菜菌核病菌進行抗藥性檢測，結果檢測到1 株抗啶酰菌胺的田間菌株[28]。由于本研究的供試菌株采集分離較早，且目前氟吡菌酰胺尚未在油菜上登記，未發(fā)現(xiàn)抗藥性菌株，后續(xù)將增加菌株的采集，監(jiān)測油菜菌核病菌對氟吡菌酰胺的抗藥性發(fā)展。采用不同作用機制的殺菌劑復配使用，是阻止或延緩病原菌抗藥性發(fā)生的主要策略。本研究測定了SDHI 類殺菌劑氟吡菌酰胺、三唑類殺菌劑丙硫菌唑和葉菌唑、苯并咪唑類殺菌劑多菌靈、苯吡咯殺菌劑咯菌腈和二甲酰亞胺類殺菌劑菌核凈單劑及其復配劑對油菜菌核病菌的毒力。結果顯示，各殺菌劑及其復配劑對油菜菌核病菌均具有較高的毒力，且各復配劑表現(xiàn)相加或增效作用。這可能是由于SDHI 類殺菌劑氟吡菌酰胺與這些殺菌劑具有不同作用機制，且各組合復配劑之間作用機理互不影響[22]。

綜上所述，氟吡菌酰胺對油菜菌核病菌的生長具有較強的抑制作用，未發(fā)現(xiàn)敏感性下降的亞群體，平均EC50值 (0.0546 ± 0.0228) μg/mL 可以作為河南省油菜菌核病菌對氟吡菌酰胺的敏感性基線。氟吡菌酰胺與5 種殺菌劑復配劑對油菜菌核病菌均為相加或增效作用，在生產(chǎn)中可以將其與丙硫菌唑、葉菌唑、多菌靈、咯菌腈和菌核凈兩兩復配使用。本論文的研究結果為油菜菌核病菌對氟吡菌酰胺的抗藥性監(jiān)測和油菜菌核病的防控提供理論。