李 英,張貽楊,岳林濤,戴明珠,沈佳琪,郭 杰,李春?jiǎn)?/p>

(1.山西振東制藥股份有限公司,山西 長(zhǎng)治 046000;2.杭州環(huán)特生物科技股份有限公司,浙江 杭州 310051)

中國(guó)歷代醫(yī)書中均有以茶入藥的記載,最早對(duì)茶的藥用價(jià)值記載見(jiàn)首部官修藥典《新修本草》。“藥茶”概念的形成與流傳主要與唐代茶文化和食療文化的發(fā)展有關(guān)。目前,藥茶已逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂休o助功效的飲品[1-3]。靈芝參芪茶由靈芝、黨參、黃芪、黃精和陳皮共五味中藥材配伍而成。享有“仙草”美譽(yù)的靈芝,味甘、性平,主治虛勞癥[4-6],除了補(bǔ)益功效外,現(xiàn)代藥理作用還表現(xiàn)為鎮(zhèn)靜安定、抗衰老和調(diào)節(jié)免疫等[7-9]?！侗静菡x》曾論述黨參“本與人參不甚相遠(yuǎn)”,味甘、性平,主治脾胃虛弱、氣血兩虧、體倦無(wú)力,具有增強(qiáng)免疫、抗疲勞、調(diào)節(jié)糖脂代謝和改善心血管系統(tǒng)功能等藥理作用[10-11]。黃精可抗疲勞、抗病原微生物和抗氧化;黃芪補(bǔ)氣固表,拔毒排膿,利尿[12]。而陳皮味苦、辛,性溫,用于脘腹脹滿、食少吐瀉、咳嗽痰多。五味藥材按照傳統(tǒng)中醫(yī)藥“君臣佐使”理論,適用于抗疲勞和肺虛咳嗽。

葛根枳椇茶由葛根、枳椇子、蒲公英和山藥四味中藥材組成。葛根含黃酮、葛根素和大豆黃酮等,味甘、辛,性涼,用于表證發(fā)熱、麻疹不透、熱病口渴;枳椇子含有三萜類、黃酮類等,味甘、性平,主治醉酒、煩渴、嘔吐和二便不利;蒲公英可利尿、緩瀉、利膽;山藥改善脾虛泄瀉、久痢、虛勞咳嗽。葛根枳椇茶適用于熬夜傷肝、慢性肝病和解酒。目前針對(duì)兩種藥茶生物效應(yīng)的研究甚少。斑馬魚(yú)與人類基因的同源性可以達(dá)到87%,具有發(fā)育周期短、身體透明和高通量等優(yōu)點(diǎn),且在神經(jīng)、免疫等系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物具有相似的發(fā)育機(jī)制與特點(diǎn),其肝臟、腸道的結(jié)構(gòu)和功能與哺乳動(dòng)物也具有高度的相似性[13-14],利于進(jìn)行基因編輯等分子操作得到突變體用于機(jī)制研究。筆者利用斑馬魚(yú)模型快速評(píng)價(jià)靈芝參芪茶和葛根枳椇茶生物效應(yīng),為這兩味藥茶的機(jī)制研究以及實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 斑 馬 魚(yú)

轉(zhuǎn)基因巨噬細(xì)胞綠色熒光Tg(mpeg1:EGFP)斑馬魚(yú)、野生型AB品系斑馬魚(yú)、黑色素等位基因突變半透明Albino品系斑馬魚(yú)、轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞綠色熒光Tg(mpx:EGFP)斑馬魚(yú)。以上實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(浙)2012-0171,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)號(hào)為001458,國(guó)際AAALAC認(rèn)證(001458),均來(lái)源于杭州環(huán)特生物科技股份有限公司。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后按美國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)(American veterinary medical association,AVMA)條例對(duì)斑馬魚(yú)實(shí)施麻醉安樂(lè)死。

1.1.2 試 劑

酒石酸長(zhǎng)春瑞濱注射液(批號(hào)140501,江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司);酒石酸長(zhǎng)春瑞濱(批號(hào)C10946321,上海麥克林生化科技有限公司);破壁靈芝孢子粉膠囊(金日制藥有限公司);無(wú)水亞硫酸鈉(批號(hào)l1428128,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);六水合氯化鈷(批號(hào)WXBB8070V,Sigma-Aldrich,美國(guó));中華跌打丸(批號(hào)191112,廣西梧州制藥股份有限公司);潑尼松(批號(hào)28778,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);三硝基苯磺酸(TNBS,5%水溶液,批號(hào)WXBB8070V,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);RU21(批號(hào)25747,美國(guó)精神科學(xué)有限公司)。

1.1.3 儀 器

V3.11行為分析儀(Viewpoint life sciences,法國(guó));電動(dòng)聚焦連續(xù)變倍熒光AZ100顯微鏡(Nikon,日本);PCO-1500顯微注射儀(Zgenebio,中國(guó)臺(tái)灣);體視SZX7顯微鏡(Olympus,日本)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藥茶前處理方式

靈芝參芪茶和葛根枳椇茶,均為精細(xì)炮制后組合型沖泡即飲型藥茶包,由山西振東制藥股份有限公司提供,陰涼干燥儲(chǔ)存。臨用前采用料液比m(茶葉)∶m(水)=3∶600,95 ℃水沖泡2次,每次10 min(具體操作:稱量3 g藥茶于燒杯中,加入300 mL 95 ℃水沖泡10 min后,用0.45 μm濾膜過(guò)濾后收集上清備用;繼續(xù)向燒杯中加300 mL 95 ℃水沖泡10 min過(guò)濾后收集上清),合并兩次上清液作為5 mg/mL質(zhì)量濃度母液,現(xiàn)配現(xiàn)用[15]。

1.2.2 增強(qiáng)免疫力(巨噬細(xì)胞數(shù)量、中性粒細(xì)胞數(shù)量)評(píng)價(jià)

將受精后2 d(2 dpf)Tg(mpeg1:EGFP)斑馬魚(yú)任意分配于6孔板中,每孔(即每實(shí)驗(yàn)組)30尾。分別水溶給予靈芝參芪茶質(zhì)量濃度78.1,156.3,312.5,625,1 250,2 500,5 000 μg/mL,陽(yáng)性對(duì)照組質(zhì)量濃度為350 μg/mL的破壁靈芝孢子粉膠囊,同時(shí)設(shè)置模型對(duì)照組、正常對(duì)照組,每孔定容3 mL。平行設(shè)置兩次實(shí)驗(yàn)。除正常對(duì)照組外,一批實(shí)驗(yàn)各組均水溶給予質(zhì)量濃度400 μg/mL的酒石酸長(zhǎng)春瑞濱誘導(dǎo)建立巨噬細(xì)胞減少癥模型[16-17];另一批各組均靜脈注射2 ng每尾(母液質(zhì)量濃度0.2 mg/mL,每尾10 nL)酒石春瑞濱建立中性粒細(xì)胞減少癥模型[18]。酒石酸長(zhǎng)春瑞濱與靈芝參芪茶共同處理24 h后實(shí)驗(yàn)結(jié)束:1)根據(jù)死亡率確定靈芝參芪茶最大檢測(cè)質(zhì)量濃度(The maximum tested concentration,MTC);2)取MTC及3個(gè)質(zhì)量濃度組,分別為陽(yáng)性對(duì)照組、正常對(duì)照組和模型對(duì)照組,每組任意吸取10尾置于熒光顯微鏡下拍照、保存圖片;3)用高級(jí)圖像NIS D 3.10處理軟件分析并采集每尾斑馬魚(yú)尾靜脈巨噬細(xì)胞熒光強(qiáng)度,用Image J分析并采集斑馬魚(yú)尾靜脈中性粒細(xì)胞數(shù)量。

1.2.3 抗疲勞和提高缺氧耐受力作用評(píng)價(jià)

取4 dpf AB斑馬魚(yú),6孔板/30尾/3 mL體系,分別水溶給予靈芝參芪茶質(zhì)量濃度78.1,156.3,312.5,625,1 250,2 500,5 000 μg/mL,以質(zhì)量濃度1 000 μg/mL的中華跌打丸為陽(yáng)性藥,同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組和模型對(duì)照組。平行設(shè)置兩次實(shí)驗(yàn)。各組處理24 h后,除正常對(duì)照組外,一批實(shí)驗(yàn)各組均水溶給予8 mg/mL無(wú)水亞硫酸鈉1.5 h建立低氧/缺氧疲勞模型[19-20];另一批各組均水溶給與1 mg/mL六水合氯化鈷2.5 h建立耐缺氧模型[21],實(shí)驗(yàn)結(jié)束。根據(jù)死亡率確定MTC;取MTC及3個(gè)質(zhì)量濃度組,分別為陽(yáng)性對(duì)照組、正常對(duì)照組和模型對(duì)照組,每組任意吸取10尾斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)移至96孔板中,1尾每孔,200 μL每孔,利用行為學(xué)分析儀檢測(cè)每尾斑馬魚(yú)1 h總運(yùn)動(dòng)距離(無(wú)水亞硫酸鈉模型S1,六水合氯化鈷模型S2)。

1.2.4 酒精性脂肪肝保護(hù)作用評(píng)價(jià)

取5 dpf AL斑馬魚(yú),6孔板/30尾/3 mL體系,分別水溶給予葛根枳椇茶質(zhì)量濃度78.1,156.3,312.5,625,1 250,2 500,5 000 μg/mL,同時(shí)設(shè)置模型對(duì)照組和正常對(duì)照組。除正常對(duì)照組外,各組均用1.5%乙醇建立斑馬魚(yú)酒精性脂肪肝模型[22]。乙醇與葛根枳椇茶共同處理30 h后實(shí)驗(yàn)結(jié)束,在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)根據(jù)死亡率確定MTC。取MTC及3個(gè)質(zhì)量濃度組,分別為正常對(duì)照組和模型對(duì)照組斑馬魚(yú),立即用4%多聚甲醛固定,經(jīng)PBS-丙二醇梯度脫水后,利用油紅O對(duì)肝臟甘油三酯進(jìn)行染色,染色后每組任意吸取10尾斑馬魚(yú)在解剖顯微鏡下拍照,用NIS D 3.10處理軟件分析并采集每尾斑馬魚(yú)肝臟脂肪染色強(qiáng)度。

1.2.5 解酒作用評(píng)價(jià)

取5 dpf AB斑馬魚(yú),6孔板/30尾/3 mL體系,分別水溶給予葛根枳椇茶質(zhì)量濃度625,1 250,2 500 μg/mL,陽(yáng)性對(duì)照組RU21(RU-21安體普天然植物提取物復(fù)合片)質(zhì)量濃度100 μg/mL,同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組和模型對(duì)照組。葛根枳椇茶處理24 h后,每組任意吸取12尾斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)移至96孔板中,1尾每孔,200 μL每孔,除正常對(duì)照組外,其余各組均給予1.5%乙醇建立興奮期醉酒模型[23],立即用行為學(xué)分析儀檢測(cè)每尾斑馬魚(yú)1 h內(nèi)總運(yùn)動(dòng)距離。

1.2.6 葛根枳椇茶胃腸道炎癥保護(hù)作用評(píng)價(jià)

取3 dpf Tg(mpx:EGFP)斑馬魚(yú),6孔板/30尾/3 mL體系,分別水溶給予葛根枳椇茶質(zhì)量濃度625,1 250,2 500 μg/mL,用質(zhì)量濃度15 μg/mL的潑尼松作為陽(yáng)性對(duì)照,同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組和模型對(duì)照組。各組處理48 h后,除正常對(duì)照組外,其余組別均水溶給予0.125% TBNS建立胃腸道炎癥模型[24]。葛根枳椇茶與TBNS繼續(xù)共同處理48 h后實(shí)驗(yàn)結(jié)束。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn),每組隨機(jī)選取10尾斑馬魚(yú)置于熒光顯微鏡下拍照,用NIS-Elements D 3.10軟件分析并采集每尾斑馬魚(yú)胃腸道中性粒細(xì)胞數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用軟件GraphPad Prim5.0進(jìn)行分析和統(tǒng)計(jì),統(tǒng)計(jì)結(jié)果用mean±SE表示;計(jì)量資料用方差分析和Dunnett’s T-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,以P<0.05作為差異具有顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1 增強(qiáng)免疫力評(píng)價(jià)

2.1.1 確定MTC

在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn),當(dāng)靈芝參芪茶質(zhì)量濃度為78.1～2 500 μg/mL時(shí),斑馬魚(yú)未見(jiàn)明顯異常;當(dāng)質(zhì)量濃度為5 000 μg/mL時(shí),誘發(fā)16.7%(5/30)斑馬魚(yú)死亡。提示靈芝參芪茶對(duì)免疫低下模型斑馬魚(yú)的MTC為2 500 μg/mL。

2.1.2 對(duì)巨噬細(xì)胞數(shù)量、中性粒細(xì)胞數(shù)量的影響

徐麗華[25]采用小鼠碳粒廓清實(shí)驗(yàn)證實(shí),靈芝飲料濃縮液可顯著升高免疫功能低下小鼠吞噬指數(shù);任娟等[26]通過(guò)大鼠碳粒廓清和小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)也發(fā)現(xiàn),黨參黃芪聯(lián)合提取的多糖具有增強(qiáng)小鼠特異性和非特異性免疫功能、提高大鼠免疫力作用。

斑馬魚(yú)尾靜脈巨噬細(xì)胞熒光強(qiáng)度、中性粒細(xì)胞數(shù)量如表1所示。由表1可知:模型斑馬魚(yú)尾部靜脈巨噬細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著降低,與正常斑馬魚(yú)比較P<0.001,提示免疫低下模型構(gòu)建成功。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照破壁靈芝孢子粉膠囊質(zhì)量濃度為350 μg/mL和靈芝參芪茶質(zhì)量濃度為625,1 250,2 500 μg/mL時(shí),巨噬細(xì)胞熒光強(qiáng)度均顯著增強(qiáng),與模型對(duì)照組比較均為P<0.001,提示靈芝參芪茶可通過(guò)增加巨噬細(xì)胞數(shù)量從而表現(xiàn)出增強(qiáng)免疫力作用。

表1 斑馬魚(yú)尾靜脈巨噬細(xì)胞熒光強(qiáng)度、中性粒細(xì)胞數(shù)量(n=10)

斑馬魚(yú)尾靜脈中性粒細(xì)胞數(shù)量典型圖如圖1所示。圖1中熒光顆粒為中性粒細(xì)胞,虛線框內(nèi)為分析區(qū)域。

圖1 斑馬魚(yú)尾靜脈中性粒細(xì)胞數(shù)量典型圖

由表1和圖1可知:模型斑馬魚(yú)尾部靜脈中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著減少,與正常斑馬魚(yú)比較比較P<0.001,提示免疫低下模型構(gòu)建成功。破壁靈芝孢子粉膠囊350 μg/mL和靈芝參芪茶625,1 250,2 500 μg/mL質(zhì)量濃度組中性粒細(xì)胞數(shù)量均顯著增加,幾乎恢復(fù)到正常水平,與模型對(duì)照組比較均P<0.001。因此,提示靈芝參芪茶可通過(guò)增加中性粒細(xì)胞數(shù)量從而表現(xiàn)出增強(qiáng)免疫力作用。

2.2 抗疲勞和提高缺氧耐受力作用評(píng)價(jià)

2.2.1 MTC

在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn),當(dāng)靈芝參芪茶質(zhì)量濃度為78.1～5 000 μg/mL時(shí),斑馬魚(yú)均未見(jiàn)明顯異常,提示靈芝參芪茶對(duì)疲勞模型斑馬魚(yú)的MTC為5 000 μg/mL。

2.2.2 抗低氧/缺氧疲勞、提高缺氧耐受力

Xu等[27]、劉曉薇等[28]和Feng等[29]采用小鼠負(fù)重游泳、常壓缺氧、缺氧瓶急性缺氧實(shí)驗(yàn)證實(shí),靈芝茶、靈芝飲料濃縮液具有明顯延長(zhǎng)負(fù)重游泳時(shí)間、延長(zhǎng)缺氧狀態(tài)下小鼠生存時(shí)間和增加耗氧率作用。實(shí)驗(yàn)利用無(wú)水亞硫酸鈉消耗水中的氧氣模擬建立低氧/缺氧環(huán)境,從而誘導(dǎo)斑馬魚(yú)出現(xiàn)低氧疲勞的運(yùn)動(dòng)狀態(tài),表現(xiàn)為總運(yùn)動(dòng)距離(S1)顯著減少。另外利用氯化鈷中的鈷離子(Co2+)可通過(guò)取代氧感受器血紅素蛋白卟啉環(huán)中的鐵離子(Fe2+),使血紅素蛋白不能與氧結(jié)合的機(jī)制,利用從氯化鈷建立缺氧耐受模型,模型斑馬魚(yú)也表現(xiàn)出總運(yùn)動(dòng)距離(S2)顯著減少的行為。在這2個(gè)模型上,用靈芝參芪茶進(jìn)行干預(yù),無(wú)水亞硫酸鈉誘導(dǎo)低氧/缺氧實(shí)驗(yàn)每尾斑馬魚(yú)總運(yùn)動(dòng)距離軌跡如圖2所示,其中每個(gè)圓圈代表1尾斑馬魚(yú)1 h累積運(yùn)動(dòng)軌跡。

斑馬魚(yú)總運(yùn)動(dòng)距離如表2所示。由表2可以看出:靈芝參芪茶不僅可以改善低氧/缺氧疲勞斑馬魚(yú)的行為,而且可以提高缺氧耐受力,增加斑馬魚(yú)總運(yùn)動(dòng)距離。與哺乳動(dòng)物結(jié)果相一致。

表2 斑馬魚(yú)總運(yùn)動(dòng)距離(n=10)

2.3 對(duì)酒精性脂肪肝預(yù)防作用評(píng)價(jià)

2.3.1 MTC

在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn),當(dāng)葛根枳椇茶質(zhì)量濃度為78.1～2 500 μg/mL時(shí),斑馬魚(yú)均未見(jiàn)明顯異常;當(dāng)質(zhì)量濃度為5 000 μg/mL時(shí),誘發(fā)100%(30/30)斑馬魚(yú)死亡。提示葛根枳椇茶對(duì)酒精性脂肪肝模型斑馬魚(yú)的MTC為2 500 μg/mL。

2.3.2 酒精性脂肪肝預(yù)防作用評(píng)價(jià)

葛根解酒護(hù)肝作用在國(guó)際上已經(jīng)取得了廣泛認(rèn)可,并有大量哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)佐證[30-32]。枳椇子水提物可通過(guò)降低乙醇引起的血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST),改善肝臟脂肪變性及炎癥而預(yù)防酒精性脂肪肝[33-35]?，F(xiàn)代中醫(yī)藥研究證明,葛根與枳椇子之間沒(méi)有配伍禁忌,都屬于藥食同源類,聯(lián)合使用具有解酒護(hù)肝[23]和清濕熱的功效[36]。

斑馬魚(yú)肝臟脂肪染色結(jié)果典型圖以及肝臟脂肪染色強(qiáng)度分別如圖3和表3所示。圖3中虛線框內(nèi)為分析區(qū)域,即斑馬魚(yú)肝臟。由圖3和表3可知:模型斑馬魚(yú)肝臟甘油三酯經(jīng)油紅O染色后呈現(xiàn)出深紅色,而正常斑馬魚(yú)肝臟呈無(wú)色(或僅背景色),表明酒精誘發(fā)斑馬魚(yú)脂肪肝模型建立成功。葛根枳椇茶干預(yù)后,僅625 μg/mL質(zhì)量濃度具有明顯預(yù)防酒精性脂肪肝作用,與模型對(duì)照組比較P<0.001。

圖3 斑馬魚(yú)肝臟脂肪染色強(qiáng)度典型圖

表3 斑馬魚(yú)肝臟脂肪染色強(qiáng)度(n=10)

2.4 解酒作用評(píng)價(jià)

RU21經(jīng)美國(guó)藥品監(jiān)督管理局(Food and drug administration,FDA)鑒定和俄羅斯科學(xué)院臨床試驗(yàn)結(jié)果證實(shí),具有減緩乙醇氧化,加速毒性物質(zhì)分解成乙酸、二氧化碳和水的作用,是公認(rèn)解酒劑。

葛根枳椇茶處理后,各濃度組斑馬魚(yú)總運(yùn)動(dòng)距離如表4所示。由表4可知:給予1.5%乙醇后,斑馬魚(yú)立刻進(jìn)入興奮期醉酒狀態(tài),對(duì)每尾斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行捕捉和分析,可見(jiàn)與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組總運(yùn)動(dòng)距離顯著增加(P<0.001),提示模型建立成功。RU21可顯著降低模型斑馬魚(yú)總運(yùn)動(dòng)距離(P<0.01)。對(duì)葛根枳椇茶質(zhì)量濃度分別為625,1 250,2 500 μg/mL干預(yù)后,總運(yùn)動(dòng)距離顯著降低,逐漸恢復(fù)至正常水平,且具有劑量依賴性,提示葛根枳椇茶具有解酒功效。這與哺乳動(dòng)物結(jié)果相一致,有研究表明:葛根異黃酮可通過(guò)提高肝臟乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的活性,清除乙醇及代謝產(chǎn)物[37-39]。

表4 葛根枳椇茶處理后斑馬魚(yú)總運(yùn)動(dòng)距離(n=12)

2.5 腸道炎癥預(yù)防作用評(píng)價(jià)

葛根和枳椇子在抗炎方面臨床應(yīng)用也比較成熟,如葛根提取物通過(guò)下調(diào)p38/MAPK、NF-κB/p65和上調(diào)PPARγ蛋白表達(dá)而改善潰瘍性結(jié)腸炎(UC)模型大鼠一般狀況及黏膜保護(hù)作用[34];葛根芩連湯在治療病毒性腸炎的應(yīng)用也頗為廣泛[40-41]。

斑馬魚(yú)胃腸道中性粒細(xì)胞數(shù)目典型圖及統(tǒng)計(jì)結(jié)果分別如圖4和表5所示。圖4中:熒光顆粒為中性粒細(xì)胞,虛線框內(nèi)為分析區(qū)域。由圖4和表5可知:模型斑馬魚(yú)腸道中性粒細(xì)胞數(shù)量明顯升高,與正常斑馬魚(yú)比較P<0.001,提示腸炎模型構(gòu)建成功。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照潑尼松質(zhì)量濃度為15 μg/mL和葛根枳椇茶質(zhì)量濃度為625,1 250,2 500 μg/mL時(shí),腸道中性粒細(xì)胞數(shù)量均明顯減少,恢復(fù)至正常水平。因此,提示葛根枳椇茶可通過(guò)降低中性粒細(xì)胞數(shù)量從而表現(xiàn)出預(yù)防腸道炎癥作用。

圖4 斑馬魚(yú)胃腸道中性粒細(xì)胞數(shù)目典型圖

表5 斑馬魚(yú)胃腸道中性粒細(xì)胞數(shù)目(n=10)

3 結(jié) 論

首先,利用可視化的轉(zhuǎn)基因巨噬細(xì)胞(Tg(mpeg1:EGFP))、中性粒細(xì)胞(Tg(mpx:EGFP))發(fā)熒光斑馬魚(yú),結(jié)合可量化的統(tǒng)計(jì)分析方法,快速、直觀和科學(xué)地評(píng)價(jià)了靈芝參芪茶增強(qiáng)免疫力作用;然后,利用行為分析儀對(duì)每尾斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行高通量(96孔)追蹤,評(píng)價(jià)了在無(wú)水亞硫酸鈉、氯化鈷兩種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的低氧/缺氧模型下靈芝參芪茶抗疲勞和提高缺氧耐受能力;最后,利用油紅O染色法對(duì)肝臟甘油三酯進(jìn)行染色,將肝臟表型結(jié)合圖片數(shù)據(jù)采集分析評(píng)價(jià)葛根枳椇茶對(duì)酒精性脂肪肝的預(yù)防作用,并評(píng)價(jià)了葛根枳椇茶對(duì)興奮期醉酒模型斑馬魚(yú)行為學(xué)的改善作用和對(duì)TNBS誘導(dǎo)的胃腸道炎癥預(yù)防功效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:靈芝參芪茶不僅可通過(guò)增加巨噬細(xì)胞數(shù)量和中性粒細(xì)胞數(shù)量從而表現(xiàn)出增強(qiáng)免疫力作用,而且可通過(guò)改善不同作用機(jī)制導(dǎo)致的低氧/缺氧疲勞斑馬魚(yú)的行為,增加運(yùn)動(dòng)能力,提高缺氧耐受力;葛根枳椇茶不僅可通過(guò)降低肝臟甘油三酯含量起到具有酒精性脂肪肝作用,顯著降低興奮期醉酒模型斑馬魚(yú)的行為,而且可通過(guò)降低中性粒細(xì)胞數(shù)量從而表現(xiàn)出預(yù)防胃腸道炎癥功效。研究為靈芝參芪茶和葛根枳椇茶的生物效應(yīng)及理論研究提供了依據(jù)。