劉 暢,杜羽晨,李寧輝,陸霄光,趙 烈,付連雙,劉 鑫,劉 君,王曉楠

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

低溫是限制冬小麥生長的主要逆境脅迫因素之一[1]。冬小麥的抗寒性是遺傳與環(huán)境因子相互作用的結(jié)果,不同品種的抗寒能力有所差異。中國高寒地區(qū)冬季寒冷漫長,導(dǎo)致冬小麥無法安全越冬。東農(nóng)系列小麥品種的育成,為高寒地區(qū)開展冬小麥高產(chǎn)育種提供了優(yōu)良的抗寒材料[2]。篩選抗寒性強的冬小麥品種,可豐富高寒地區(qū)抗寒種質(zhì)資源。

小麥生理指標(biāo)的變化更能直觀地反映小麥品種的抗寒性。劉艷陽等[3]采用室內(nèi)低溫冷凍法處理雙單倍體群體的133個株系,發(fā)現(xiàn)幼苗葉片中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性可作為小麥抗寒性鑒定的理化指標(biāo)。姜麗娜等[4]通過測定小麥拔節(jié)期低溫脅迫下葉片的生理指標(biāo),發(fā)現(xiàn)可溶性糖、脯氨酸和MDA含量以及過氧化物酶(POD)活性可作為小麥拔節(jié)期抗寒性鑒定的評價指標(biāo)。小麥的生長點分化狀態(tài)影響其抗寒性,小麥生長點分化包括營養(yǎng)生長階段和生殖生長階段。生長點伸長是小麥通過春化階段的標(biāo)志[5-6]。黃淮麥區(qū)冬小麥生長點在越冬階段的分化進(jìn)程一般在二棱期[7],但寒地冬小麥在越冬過程中生長點的分化狀態(tài)尚不清楚,且抗寒性不同的小麥品種之間生長點分化進(jìn)程和生理指標(biāo)的差異也有待探索。

本研究在大田條件下種植抗寒性不同的3個小麥品種,調(diào)查越冬期小麥生長點的分化進(jìn)程,并檢測相對電導(dǎo)率、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、MDA含量以及SOD、POD和過氧化氫酶(CAT)活性的變化,以期明確小麥生長點分化進(jìn)程對其抗寒性的影響,為抗寒性小麥品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為抗寒性不同的3個小麥品種,分別為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥研究所育成的強抗寒性冬小麥品種東農(nóng)冬麥1號(在高寒地區(qū)越冬返青率高于80%)、山東省農(nóng)科院育成的在黃淮麥區(qū)主推的弱抗寒性冬小麥品種濟麥22號(在高寒地區(qū)越冬返青率低于40%)和不抗寒性春小麥品種中國春(在高寒地區(qū)越冬返青率低于20%)。

1.2 試驗設(shè)計

試驗材料于2019年9月10日種植在黑龍江省哈爾濱市東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)試驗基地。試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計,3次重復(fù),小麥行長3 m,行距30 cm,5行區(qū),種植密度均為200萬株·hm-2。鄭 維等[8]提出,白天溫度在0 ℃以上,晚間溫度在-2 ℃以下,日平均溫度低于10 ℃,土壤表面成晝消夜凍的狀態(tài),即為低溫馴化階段;環(huán)境最高溫度在0 ℃以下,則為封凍階段。根據(jù)本試驗期間哈爾濱市的氣溫變化情況,分別于2019年10月10日(生長期)、11月1日(馴化期)、11月20日(封凍期)取樣,進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定,封凍前記錄每個品種的植株數(shù),于次年4月下旬記錄每個品種的返青成活植株數(shù)并計算返青率。返青率=返青成活植株數(shù)/封凍前植株數(shù)×100%。2020年種植時間、種植方式及返青率調(diào)查同2019年。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 植株外部形態(tài)特征及生長點分化進(jìn)程的觀察

于2019和2020年生長期、馴化期和封凍期,隨機從大田中選取5株小麥樣品,水洗后用濾紙吸干水分,取主莖分蘗節(jié),參照Guo等[9]的方法剝?nèi)∩L點后,利用Olympus-DP電子顯微鏡進(jìn)行觀察,拍照記錄生長點的分化狀態(tài)。

1.3.2 相對電導(dǎo)率的測定

參照高京草等[10]和鄒 琦[11]的方法測定相對電導(dǎo)率,略作改動。具體方法:于2019和2020年生長期、馴化期和封凍期,選取長勢一致的5株小麥,水洗后用濾紙吸干水分,用打孔器取0.2 g小麥葉片樣品,置于去離子水中,真空泵抽15 min,用電導(dǎo)率儀測定其電導(dǎo)率值(S1)。然后放入沸水浴中20 min,樣品冷卻后再次測量其電導(dǎo)率(S2)。相對電導(dǎo)率=S1/S2×100%。

1.3.3 MDA含量及抗氧化酶活性的測定

取2020年生長期、馴化期和封凍期的小麥葉片和分蘗節(jié),采用硫代巴比妥酸(TBA)法[12]測定MDA含量;采用NBT還原法[13]測定SOD活性;參考Wei等[14]的方法測定POD活性,參考豆昕桐等[15]的方法測定CAT活性。

1.3.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

于2020年生長期、馴化期和封凍期,使用便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨xPAM-2500進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定,每次測定均選取植株完全展開的新葉中間部位,葉片經(jīng)暗適應(yīng)30 min后進(jìn)行初始熒光(Fo)測定,打開飽和脈沖進(jìn)行最大熒光(Fm)測定,根據(jù)所測數(shù)據(jù)計算可變熒光(Fv=Fm-Fo)和PSⅡ最大量子產(chǎn)額(Fv/Fm)。每個處理3次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用Excel 2016和Adobe Photoshop制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗寒性小麥品種的返青率

從表1可以看出,中國春和濟麥22在2020年的返青率均為0,在2021年的返青率分別為15.28%和35.62%;而強抗寒品種東農(nóng)冬麥1號在2020和2021年的返青率均在98%以上。說明3個品種的抗寒性差異明顯。

表1 抗寒性不同的3個小麥品種的越冬返青率Table 1 Overwintering survival rate of the three varieties with different cold resistance

2.2 不同抗寒性小麥品種的分蘗節(jié)生長點分化進(jìn)程

從圖1可以看出,2019年中國春和濟麥22在生長期時,其生長點均已分化進(jìn)入二棱期,而東農(nóng)冬麥1號的生長點在封凍期仍處于單棱期。2020年三個品種在生長期時,生長點均處于單棱期,但中國春和濟麥22的生長點在封凍期已進(jìn)入二棱期,而東農(nóng)冬麥1號的生長點在封凍期仍處于單棱期,說明越冬過程中,東農(nóng)冬麥1號的生長點分化明顯滯后于濟麥22和中國春。

DM1:東農(nóng)冬麥1號;JM22:濟麥22;CS:中國春。圖2～7同。DM1: Dongnongdongmai 1; JM22: Jimai 22; CS: Chinese Spring. The same in figures 2-7.圖1 3個小麥品種的分蘗節(jié)生長點分化進(jìn)程Fig. 1 Growth point differentiation process of the three varieties with different cold resistance

2.3 不同抗寒性小麥品種葉片的相對電導(dǎo)率

相對電導(dǎo)率可衡量細(xì)胞電解質(zhì)的外滲狀況,反映細(xì)胞膜受傷害的程度[16]。從圖2可以看出,2019和2020年田間小麥葉片的相對電導(dǎo)率趨勢一致,從生長期至封凍期,葉片的相對電導(dǎo)率均呈現(xiàn)出逐漸上升的變化趨勢。2019年在生長期和馴化期,3個品種的相對電導(dǎo)率差異均不顯著;而在封凍期,東農(nóng)冬麥1號的相對電導(dǎo)率均顯著低于中國春和濟麥22(圖2A)。2020年在生長期和馴化期,東農(nóng)冬麥1號的相對電導(dǎo)率顯著低于中國春和濟麥22;而在封凍期,3個品種的相對電導(dǎo)率差異不顯著(圖2B)。

同一時期圖柱上不同字母表示不同品種間在0.05水平上差異顯著。圖3～7同。Different letters above the columns at the same stage indicate significant differences among different varieties at 0.05 level. The same in figures 3-7.圖2 不同時期3個小麥品種的相對電導(dǎo)率Fig. 2 Relative electrical conductivity of the three wheat varieties at different stage

2.4 不同抗寒性小麥品種的MDA含量

MDA是膜脂過氧化產(chǎn)物,可反映植物受逆境傷害的程度[17]。從圖3可以看出,東農(nóng)冬麥1號葉片中MDA含量從生長期至封凍期無明顯變化,而其分蘗節(jié)中MDA含量以及中國春和濟麥22葉片和分蘗節(jié)中MDA含量從生長期至封凍期均呈逐漸升高的變化趨勢。葉片中,3個時期中國春的MDA含量均顯著高于濟麥22和東農(nóng)冬麥1號,且生長期、馴化期濟麥22和東農(nóng)冬麥1號之間的MDA含量差異均不顯著,封凍期東農(nóng)冬麥1號的MDA含量顯著低于濟麥22(圖3A)。分蘗節(jié)中,生長期和馴化期3個品種的MDA含量差異均不顯著,封凍期東農(nóng)冬麥1號的MDA含量顯著低于中國春和濟麥22(圖3B)。

圖3 不同時期3個小麥品種的MDA含量(2020)Fig. 3 MDA content of the three wheat varieties at different stages (2020)

2.5 不同抗寒性小麥品種的抗氧化酶活性

植物在遭受低溫脅迫時體內(nèi)會產(chǎn)生并積累活性氧,從而破壞植物結(jié)構(gòu)與功能。SOD、POD、CAT是植物體內(nèi)重要的活性氧清除酶[18]。從圖4 可以看出,3個小麥品種葉片和分蘗節(jié)中SOD活性從生長期至封凍期均呈逐漸降低的變化趨勢。葉片中,生長期和封凍期3個小麥品種的SOD活性均無顯著差異;馴化期東農(nóng)冬麥1號的SOD活性顯著高于濟麥22和中國春,且濟麥22與中國春差異不顯著(圖4A)。分蘗節(jié)中,生長期3個品種的SOD活性差異不顯著;馴化期東農(nóng)冬麥1號的SOD活性顯著低于中國春和濟麥22,且中國春和濟麥22差異不顯著;封凍期東農(nóng)冬麥1號的SOD活性顯著高于濟麥22,但與中國春差異不顯著(圖4B)。

圖4 不同時期3個小麥品種的SOD活性(2020)Fig.4 SOD activity of the three wheat varieties at different stages (2020)

從圖5可以看出,3個小麥品種葉片中POD活性從生長期至封凍期總體上均呈逐漸升高的變化趨勢;分蘗節(jié)中POD活性變化趨勢則表現(xiàn)不一致,中國春呈先升高后降低的變化趨勢,而濟麥22和東農(nóng)冬麥1號呈先降低后升高的變化趨勢。

圖5 不同時期3個小麥品種的POD活性(2020)Fig.5 POD activity of the three wheat varieties at different stages (2020)

葉片中,3個時期東農(nóng)冬麥1號的POD活性均顯著高于中國春和濟麥22,在生長期和封凍期濟麥22的POD活性顯著高于中國春,而在馴化期兩個品種間差異不顯著(圖5A)。分蘗節(jié)中,生長期和馴化期東農(nóng)冬麥1號的POD活性顯著低于中國春,但與濟麥22差異不顯著;封凍期東農(nóng)冬麥1號的POD活性顯著高于中國春和濟麥22,且中國春的POD活性顯著高于濟麥22(圖5B)。

從圖6可以看出,3個小麥品種葉片和分蘗節(jié)中CAT活性從生長期至封凍期均呈逐漸升高的變化趨勢。葉片中,生長期和馴化期3個小麥品種的CAT活性差異均不顯著;封凍期東農(nóng)冬麥1號的CAT活性顯著高于中國春和濟麥22,且濟麥22顯著高于中國春(圖6A)。分蘗節(jié)中,生長期東農(nóng)冬麥1號的CAT活性顯著高于中國春,但與濟麥22差異不顯著;馴化期和封凍期東農(nóng)冬麥1號的CAT活性均顯著高于中國春和濟麥22,且封凍期濟麥22的CAT活性顯著高于中國春,而馴化期兩品種間差異不顯著(圖6B)。

圖6 不同時期3個小麥品種的CAT活性(2020)Fig. 6 CAT activity of the three wheat varieties at different stages (2020)

2.6 不同抗寒性小麥品種的葉綠素?zé)晒鈪?shù)

葉綠素?zé)晒鈪?shù)是衡量非生物脅迫下植物光合生理狀態(tài)的有效指標(biāo)[19-20]。從圖7A可以看出,中國春和濟麥22葉片的F0從生長期至封凍期均呈先降低后升高的變化趨勢,而東農(nóng)冬麥1號則呈先升高后降低的變化趨勢。生長期和封凍期濟麥22的F0顯著高于中國春和東農(nóng)冬麥1號,且中國春和東農(nóng)冬麥1號之間無顯著差異;馴化期東農(nóng)冬麥1號的F0顯著高于中國春和濟麥22,且中國春和濟麥22之間差異不顯著。從圖7B可以看出,中國春和濟麥22葉片的Fm從生長期至封凍期均呈逐漸降低的變化趨勢,而東農(nóng)冬麥1號則呈先升高后降低的變化趨勢。生長期和封凍期濟麥22的Fm顯著高于中國春和東農(nóng)冬麥1號,且生長期中國春顯著高于濟麥22,而封凍期兩個品種間差異不顯著;馴化期東農(nóng)冬麥1號的Fm顯著高于中國春和濟麥22,且濟麥22顯著高于中國春。從圖7C可以看出,3個小麥品種葉片的Fv/Fm從生長期至馴化期總體上均呈逐漸降低的變化趨勢。生長期3個品種的Fv/Fm差異不顯著;馴化期東農(nóng)冬麥1號的Fv/Fm顯著低于中國春和濟麥22,且中國春和濟麥22之間差異不顯著;封凍期東農(nóng)冬麥1號的Fv/Fm顯著高于中國春,但與濟麥22之間差異不顯著。

1:生長期; 2:馴化; 3:封凍封。1:Growing stage; 2:Domestication stage; 3:Freeezing stage.圖7 不同時期3個小麥品種的葉綠素?zé)晒鈪?shù)(2020)Fig. 7 Chlorophyll fluorescence parameter of the three wheat varieties at different stages (2020)

3 討論

越冬期和返青期是冬小麥能否安全越冬和產(chǎn)量形成的關(guān)鍵時期,對該時期小麥的生長點分化進(jìn)程和生理指標(biāo)進(jìn)行檢測,可為小麥的抗寒性鑒定提供一定的理論基礎(chǔ)[21]。低溫可導(dǎo)致小麥體內(nèi)相對電導(dǎo)率、生長點分化進(jìn)程、抗氧化酶活性以及葉綠素?zé)晒鈪?shù)發(fā)生變化,進(jìn)而影響翌年的返青率。本研究發(fā)現(xiàn),2020年濟麥22和中國春的返青率比2019年有所提高,且濟麥22的返青率增幅較大。2019年濟麥22和中國春的生長點分化進(jìn)程較快,生長期時其生長點已分化至二棱期;在2020年其生長點分化進(jìn)程較慢,在封凍期時仍處于二棱期,而2019和2020年封凍期時東農(nóng)冬麥1號的生長點仍處于單棱期。說明東農(nóng)冬麥1號的生長點分化進(jìn)程較慢,能夠安全度過越冬期,從而保證翌年的返青率。

相對電導(dǎo)率是反映植物組織受凍后細(xì)胞原生質(zhì)膜透性的重要指標(biāo),且電導(dǎo)率越高植株受損越嚴(yán)重[22]。本研究中2019和2020年3個品種的相對電導(dǎo)率從生長期至封凍期均呈逐漸升高的變化趨勢。但2020年變化幅度較2019年小,推測這與2020年雪層覆蓋較厚有關(guān),且研究結(jié)果也顯示,連續(xù)2年抗寒品種東農(nóng)冬麥1號的相對電導(dǎo)率增幅均低于中國春和濟麥22。前人研究發(fā)現(xiàn),低溫脅迫下,植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧自由基,引發(fā)膜脂過氧化[23],產(chǎn)生膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA),且膜脂過氧化的程度隨溫度降低和脅迫時間延長而加重[24]。本研究中,封凍期東農(nóng)冬麥1號的MDA含量均顯著低于濟麥22和中國春,表明抗寒品種的膜脂過氧化程度較低。隨著負(fù)積溫的不斷增加,MDA的含量整體表現(xiàn)為上升趨勢,即超氧陰離子的含量超出抗氧化保護(hù)系統(tǒng)的清除能力,細(xì)胞膜不能夠修復(fù)低溫對細(xì)胞膜的損害,細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多[25]。為了保護(hù)細(xì)胞免受活性氧自由基的毒害,植株形成了酶保護(hù)機制[26],抗氧化酶活性的增加可以減輕低溫對生物膜的損傷[27]。分蘗節(jié)是冬小麥安全越冬的關(guān)鍵部位,本研究中,封凍期小麥POD、CAT的活性均明顯高于生長期,且東農(nóng)冬麥1號的增幅大于濟麥22和中國春,分蘗節(jié)的增幅也大于葉片。這進(jìn)一步證明東農(nóng)冬麥1號的抗寒性優(yōu)于濟麥22和中國春。這與前人對東農(nóng)冬麥1號的抗寒生理特性研究結(jié)果一致[28-29]。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)也是抗寒性鑒定的重要指標(biāo)之一,被稱為測定葉片光合功能快速、無損傷的探針,能較好地反映植株生長以及受脅迫時的生理狀況[30]。Fv/Fm是指沒有遭受環(huán)境脅迫并經(jīng)過暗適應(yīng)的植物葉片PSⅡ最大光化學(xué)效率,是植物潛在的最大光合能力[31]。高等植物的Fv/Fm在0.75～0.85之間,在逆境條件下迅速下降[31]。本研究中,生長期3個品種的Fv/Fm值均在0.70～0.75之間,馴化期Fv/Fm值均有所下降,表明此時葉片已經(jīng)遭受低溫脅迫,但下降趨勢不明顯;進(jìn)入封凍期后Fv/Fm迅速降低,濟麥22和東農(nóng)冬麥1號分別是0.45和0.42,顯著高于中國春(0.35)。說明封凍期東農(nóng)冬麥1號和濟麥22的Fv/Fm仍能保持較高水平。這與張 婭等[32]的研究結(jié)果一致。