路露，韓熒，劉梓桐，錢(qián)晶晶，閆妍，孫玉軍

(1. 安徽科技學(xué)院，安徽鳳陽(yáng) 233100；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081)

地膜具有增溫、保墑、防草、抗病等作用，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)際，自1978 年引入我國(guó)以來(lái)，對(duì)我國(guó)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式、區(qū)域種植結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了巨大影響。 預(yù)計(jì)到2025 年，我國(guó)地膜覆蓋面積將達(dá)到2340 萬(wàn)hm2[1]，但普通聚乙烯地膜由于長(zhǎng)期不科學(xué)的田間操作導(dǎo)致農(nóng)田土壤環(huán)境加劇惡化，殘膜污染問(wèn)題呈現(xiàn)加重趨勢(shì)[2]。 農(nóng)田殘膜會(huì)破壞土壤結(jié)構(gòu)、影響土壤水分運(yùn)輸和養(yǎng)分循環(huán)[3]，導(dǎo)致耕地質(zhì)量、作物產(chǎn)量和品質(zhì)下降，危害食品安全[4]。

生物降解地膜是解決地膜殘留污染的重要途徑之一[5]，其在自然環(huán)境中可以通過(guò)微生物降解成二氧化碳和水等[6]。 腐殖酸是一種抗菌、無(wú)毒無(wú)害、天然有機(jī)土壤改良劑[7]，可以與土壤中的礦物質(zhì)結(jié)合，增加土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)。 研究表明，番茄栽培時(shí)施用腐殖酸能夠促進(jìn)番茄生長(zhǎng)發(fā)育及光合效率，改良土壤理化性質(zhì)，還能對(duì)番茄起到壯苗作用[8，9]。

土壤微生物作為土壤的重要組成部分對(duì)于維持土壤生態(tài)具有重要作用，其對(duì)環(huán)境的變化較為敏感，是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量、肥力的重要指標(biāo)[10]。 已有研究顯示，覆蓋降解地膜可增加土壤酶活性和微生物數(shù)量，改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[11，12]；秋季覆蓋地膜在東北雨養(yǎng)區(qū)玉米種植中可以顯著增加土壤微生物的豐富度及多樣性[13]，在辣椒種植中覆蓋地膜可以提高土壤細(xì)菌豐度和均勻度指數(shù)[14]。 以往研究多數(shù)集中在地膜覆蓋對(duì)作物生長(zhǎng)、產(chǎn)量、土壤理化性質(zhì)的影響上，對(duì)土壤微生物、土壤酶活性的研究較少。

本試驗(yàn)通過(guò)研究在日光溫室番茄栽培中覆蓋普通聚乙烯地膜和PBAT/PLA 腐殖酸、PBAT/PLA 木質(zhì)素生物降解地膜對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、物種豐度、土壤酶活性及番茄植株生長(zhǎng)的影響差異，為評(píng)價(jià)覆蓋生物降解地膜對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2021 年9 月—2022 年1 月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院南口中試基地日光溫室進(jìn)行。 番茄品種為甜脆脆(北京富萬(wàn)家農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司)。FZS(PBAT/PLA 腐殖酸生物降解地膜)、MZS(PBAT/PLA 木質(zhì)素生物降解地膜)，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院協(xié)助提供生物降解地膜配方，由山東清田塑工有限公司生產(chǎn)；PE(聚乙烯地膜)，厚度10 μm，購(gòu)自山東清田塑工有限公司。MZS 配方:PBAT 90 wt%，PLA 5 wt%，木質(zhì)素5 wt%，厚度10 μm。 FZS 配方:PBAT 90 wt%，PLA 5 wt%，腐殖酸5 wt%，厚度10 μm。

整畦種植，畦寬120 cm，畦長(zhǎng)750 cm，每畦種植35 株，株距40 cm，小行距40 cm，大行距80 cm。 每666.7m2種植2600 株。 番茄苗于2021 年9 月4 日定植，期間供水與供肥量均相同。 每個(gè)處理3 次重復(fù)。

1.2 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.2.1 土壤微生物測(cè)序 種植結(jié)束時(shí)采用“S”形取樣法，對(duì)0 ～20 cm 耕層土壤進(jìn)行樣品采集，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，編號(hào)封裝帶回實(shí)驗(yàn)室-80℃保存。 使用TGuide S96 磁珠法土壤/糞便基因組DNA 提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，型號(hào):DP812]提取土壤DNA。 使用引物27F_(16S-F)(5＇- AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3＇)、1492R_(16S-R) (5＇-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3＇)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA 序列。 其反應(yīng)體系(30 μL):基因組DNA 1.5 μL，nuclease-free water 10.5 μL，KOD ONE MM 15 μL，正反引物各1.5 μL。 反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，循環(huán)25 次；72℃延伸2 min。 使用引物ITS1F:5＇-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA - 3＇、 ITS4: 5＇ - TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇擴(kuò)增真菌ITS 序列。 其反應(yīng)體系(30 μL):基因組DNA 1.5 μL，nucleasefree water 11.7 μL，KOD ONE MM 15 μL，正反引物各0.9 μL。 反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環(huán)8次；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環(huán)24 次；72℃延伸5 min。 測(cè)序方法:使用PacBio Binding kit(Pacbio，USA)對(duì)上機(jī)文庫(kù)進(jìn)行上機(jī)前的結(jié)合，使文庫(kù)結(jié)合上Primer(Pacbio，USA)及Polymerase(Pacbio，USA)；將最終反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行AMpure PB Beads(Pacbio，USA)純化后置于Sequel Ⅱ(Pacbio，USA)測(cè)序儀上進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，測(cè)序工作由北京百邁客生物科技有限公司完成。

使用FUNGuild(Fungi Functional Guild)進(jìn)行真菌功能預(yù)測(cè)，使用PICRUSt2 軟件進(jìn)行細(xì)菌功能預(yù)測(cè)。

1.2.2 土壤酶活性測(cè)定 種植結(jié)束時(shí)，采用“S”形取樣法，對(duì)0 ～20 cm 耕層土壤進(jìn)行樣品采集，每個(gè)處理重復(fù)3 次。 過(guò)氧化氫酶和蔗糖酶活性采用北京盒子生工科技有限公司試劑盒測(cè)定。

1.2.3 番茄生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 株高、莖粗:番茄植株打頂前采用卷尺測(cè)量株高、游標(biāo)卡尺測(cè)量莖粗，每個(gè)處理選取6 株番茄進(jìn)行測(cè)定。

節(jié)間距:采用卷尺測(cè)量番茄植株三穗花下的平均節(jié)間長(zhǎng)度，每個(gè)處理選取6 株番茄進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2010 軟件處理數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 8.4.2 作圖，DPS 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物群落OTU 水平的主成分分析

土壤真菌群落PCA 分析顯示，第一、第二軸對(duì)各樣本的解釋度分別為76.02%和17.66%。 處理前土壤(CK)和PE、MZS、FZS 地膜的土壤樣本各自聚為一類，說(shuō)明各地膜處理重復(fù)間差異較小(圖1A)。 土壤細(xì)菌群落PCA 分析顯示，第一、第二軸對(duì)各樣本的解釋度分別為35.82%和19.28%。CK 和PE、MZS、FZS 地膜的土壤樣本各自聚為一類，說(shuō)明各地膜處理重復(fù)間差異較小(圖1B)。

圖1 土壤微生物群落OTU 水平主成分分析

2.2 覆蓋聚乙烯和不同生物降解地膜對(duì)土壤真菌、細(xì)菌門(mén)水平物種豐度的影響

土壤真菌門(mén)水平物種豐度排名前10 的主要有Ascomycota(子囊菌門(mén))、Chytridiomycota(壺菌門(mén))、Mortierellomycota(被孢霉門(mén))、Basidiomycota(擔(dān)子菌門(mén))、unclassified Fungi(未分類真菌)、Rozellomycota(羅茲菌門(mén))、Glomeromycota(球囊菌門(mén))、Calcarisporiellomycota、Olpidiomycota(油壺菌門(mén))、Zoopagomycota(捕蟲(chóng)霉門(mén))。 覆蓋MZS 地膜Chytridiomycota 的相對(duì)豐度高于覆蓋PE 和FZS地膜；覆蓋FZS 地膜的Ascomycota 相對(duì)豐度高于覆蓋PE 和MZS 地膜(圖2A)。

圖2 覆蓋聚乙烯和不同生物降解地膜土壤真菌、細(xì)菌門(mén)水平相對(duì)豐度

土壤細(xì)菌門(mén)水平物種豐度排名前10 的為Proteobacteria(變形菌門(mén))、Acidobacteriota(酸桿菌門(mén))、Bacteroidota(擬桿菌門(mén))、unclassified Bacteria(未分類細(xì)菌)、Nitrospirota(硝化螺旋菌門(mén))、Gemmatimonadota(芽單胞菌門(mén))、Verrucomicrobiota(疣微菌門(mén))、Planctomycetota(浮霉菌門(mén))、Chloroflexi(綠彎菌門(mén))、Actinobacteriota(放線菌門(mén))。覆蓋FZS 地膜的Verrucomicrobiota 和Bacteroidota相對(duì)豐度高于覆蓋PE 和MZS 地膜(圖2B)。

2.3 覆蓋聚乙烯和不同生物降解地膜對(duì)土壤真菌、細(xì)菌群落門(mén)類的影響

處理前土壤(CK)和覆蓋PE、MZS、FZS 地膜土壤擁有8 個(gè)共有真菌門(mén)類，覆蓋PE 地膜擁有1個(gè)特有真菌門(mén)類(圖3A)。 處理前土壤(CK)和覆蓋PE、MZS、FZS 地膜土壤擁有26 個(gè)共有細(xì)菌門(mén)類，覆蓋PE、MZS、FZS 地膜擁有1 個(gè)共有細(xì)菌門(mén)類(圖3B)。

圖3 覆蓋聚乙烯和不同生物降解地膜土壤真菌、細(xì)菌群落門(mén)類

2.4 土壤真菌FUNGuild 功能預(yù)測(cè)和土壤細(xì)菌PICRUSt2 功能預(yù)測(cè)

土壤真菌FUNGuild 功能預(yù)測(cè)Guild 層級(jí)排名前10 的有:Undefined Saprotroph(未定義腐生菌)、Wood Saprotroph(木腐生菌)、Dung Saprotroph(排泄物腐生菌)、Plant Pathogen(植物病原菌)、Plant Saprotroph(植物腐生菌)、Ectomycorrhizal(外生菌)、Animal Pathogen(動(dòng)物病原菌)、Fungal Parasite(真菌寄生菌)、Arbuscular Mycorrhizal(叢枝菌根)、Endophyte(內(nèi)生菌)，見(jiàn)圖4A。

圖4 土壤真菌FUNGuild 功能預(yù)測(cè)(A)和土壤細(xì)菌PICRUSt2 功能預(yù)測(cè)(B)

通過(guò)與KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，土壤細(xì)菌level 2 水平排名前10 的功能有:Global and overview maps、Carbohydrate metabolism(碳水化合物代謝)、Amino acid metabolism(氨基酸代謝)、Energy metabolism(能量代謝)、Metabolism of cofactors and vitamins(輔助因子和維生素代謝)、Translation(翻譯)、Nucleotide metabolism(核苷酸代謝)、Membrane transport(膜轉(zhuǎn)運(yùn))、Signal transduction(信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))、Replication and repair(復(fù)制和修復(fù))，見(jiàn)圖4B。

2.5 覆蓋聚乙烯和不同生物降解地膜對(duì)土壤酶活性的影響

覆蓋PE 和FZS、MZS 地膜對(duì)土壤過(guò)氧化氫酶活性的影響沒(méi)有顯著差異；覆蓋FZS 和MZS 地膜的蔗糖酶活性分別達(dá)到5.24 U/g 和5.38 U/g，較覆蓋PE 地膜分別顯著提高7.60%和10.47%(表1)。

表1 覆蓋聚乙烯和不同生物降解地膜對(duì)土壤酶活性的影響

2.6 覆蓋聚乙烯和不同生物降解地膜對(duì)番茄植株生長(zhǎng)的影響

由表2 可知，覆蓋PE 和FZS、MZS 地膜對(duì)番茄株高和節(jié)間距的影響無(wú)顯著差異；莖粗依次為FZS 地膜＞MZS 地膜＞PE 地膜；相較于覆蓋PE 和MZS 地膜，覆蓋FZS 地膜番茄莖粗分別顯著增加5.99%和3.14%。

表2 覆蓋聚乙烯和不同生物降解地膜對(duì)番茄植株生長(zhǎng)的影響

3 討論

覆蓋生物降解地膜可以通過(guò)改變微氣候而間接影響土壤微生物群落[15]。 土壤微生物能將有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化為腐殖質(zhì)，供植物吸收利用，并改良土壤。 在春玉米種植中不同覆蓋處理可以顯著改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性[16]。 春小麥種植中地膜覆蓋處理可顯著改變溫帶半干旱地區(qū)土壤真菌群落組成[17]。 已有研究顯示，在鹽脅迫下相較于CK，施用腐殖酸的T1、T2、T3 處理土壤真菌Ascomycota 的相對(duì)豐度分別顯著提高28.07%、26.48%、6.41%[18]；與常規(guī)施肥+石灰粉處理相比，常規(guī)施肥+石灰粉+腐殖酸處理能夠提高土壤細(xì)菌Bacteroidota 的相對(duì)豐度[19]。 這與本試驗(yàn)中覆蓋FZS 地膜真菌Ascomycota 和細(xì)菌Bacteroidota 物種豐度高于覆蓋PE 和MZS 地膜的結(jié)果相一致。 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、相對(duì)豐度等的改變可能有以下原因:①在實(shí)際生產(chǎn)中環(huán)境因素、管理措施等都會(huì)直接或間接影響土壤微生物代謝活性；②不同地膜之間的機(jī)械性能、保濕性能、光學(xué)性能等均有較大的差異，可能會(huì)通過(guò)改變土壤理化性質(zhì)、土壤溫濕度進(jìn)而對(duì)土壤微生物代謝活性造成一定的影響；③FZS 地膜添有腐殖酸，在其使用過(guò)程中會(huì)因膜下凝露將腐殖酸帶出，而腐殖酸可以提高肥料利用率，改善土壤理化性質(zhì)[20]。 以上說(shuō)明不同地膜覆蓋對(duì)土壤微生物相對(duì)豐度、群落結(jié)構(gòu)、多樣性以及土壤微生物功能基因結(jié)構(gòu)組成均有一定影響。

已有研究顯示，在基質(zhì)中添加2.0 mg/kg 腐殖酸可以有效促進(jìn)辣椒幼苗生長(zhǎng)[21]；當(dāng)椰糠∶菇渣∶草炭＝1 ∶1 ∶2時(shí)，添加4 g/L 腐殖酸番茄幼苗莖粗達(dá)到最大值[8]，這與本試驗(yàn)覆蓋FZS 地膜可以有效促進(jìn)番茄莖粗生長(zhǎng)的結(jié)果相一致。 FZS 處理可以有效促進(jìn)莖粗生長(zhǎng)的原因可能是腐殖酸可以促進(jìn)根系生長(zhǎng)發(fā)育、增加根系數(shù)量、延長(zhǎng)根系長(zhǎng)度，從而促進(jìn)作物對(duì)養(yǎng)分的吸收，達(dá)到促進(jìn)作物生長(zhǎng)的作用。

4 結(jié)論

不同地膜覆蓋處理通過(guò)影響土壤微生物群落及組成進(jìn)而影響土壤微生物的功能基因。 相較于覆蓋PE 地膜，覆蓋PBAT/PLA 腐殖酸生物降解地膜(FZS)有助于提高土壤真菌Ascomycota 和細(xì)菌Verrucomicrobiota、Bacteroidota 的物種豐度；覆蓋PBAT/PLA 腐殖酸生物降解地膜(FZS)后土壤蔗糖酶活性、番茄莖粗顯著高于覆蓋PE 地膜。