王子豪，蘇迅，解孝滿，仝伯強(qiáng)，丁平，韓彪，劉丹，張萍，孔冬瑞，胡德昌

(1. 魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264025；2. 山東省林草種質(zhì)資源中心，山東濟(jì)南 250014)

胡桃楸(Juglans mandshuricaMaxim.)為胡桃科(Juglandaceae)胡桃屬(JuglansL.)植物，又稱核桃楸、野核桃，是一種高大溫帶落葉喬木，常作材用，與水曲柳和黃波羅并稱東北地區(qū)三大闊葉樹種，且種仁可食[1，2]。 作為核桃的近緣種，與栽培核桃雜交育種、用作核桃砧木等成為近年胡桃楸研究的熱點(diǎn)[3-5]。 另外，Xu 等[6]揭示了核桃青皮酚類物質(zhì)能夠有效抵御膠孢炭疽菌，對(duì)下一步開(kāi)發(fā)植物源核桃炭疽病綠色防控農(nóng)藥具有重要意義。 因此，對(duì)胡桃楸進(jìn)行相關(guān)研究具有巨大實(shí)際應(yīng)用潛力。

果實(shí)作為繁殖器官，與葉片等營(yíng)養(yǎng)器官相比特征相對(duì)穩(wěn)定，能在不同地理位置、復(fù)雜多變的環(huán)境下表現(xiàn)出較強(qiáng)的適應(yīng)性，能較好地體現(xiàn)進(jìn)化上的變異規(guī)律。 陳思羽等[7]發(fā)現(xiàn)分布在長(zhǎng)白山不同區(qū)域的核桃楸，種子質(zhì)量、種子長(zhǎng)度和種子寬度等性狀變異明顯。 宋佳興等[8]將遼東山區(qū)胡桃楸種質(zhì)資源的果實(shí)根據(jù)表型性狀劃分為球形、卵形等十余種果實(shí)形態(tài)，變異類型豐富。 高張瑩等[9]認(rèn)為不同種群間核桃楸果核性狀存在極顯著差異，主要受生境因子影響，但也受到很強(qiáng)的遺傳控制，基于表型性狀數(shù)據(jù)的聚類結(jié)果與地理分布并不完全一致，呈現(xiàn)隨機(jī)變異特征。 李紅莉等[10]研究得知黑龍江野生毛榛果實(shí)表型性狀多樣性豐富。 張深梅等[11]調(diào)查發(fā)現(xiàn)大別山19 個(gè)核桃野生居群的果實(shí)表型性狀在居群間和居群內(nèi)均存在極顯著差異，具有豐富的表型變異。 董勝君等[12]發(fā)現(xiàn)東北杏的果實(shí)性狀變異較為豐富，且變異主要來(lái)源于居群間。 王堯等[13]研究得知山東省鹽膚木果實(shí)表型性狀多樣性較為豐富，變異以居群間變異為主，而且受地理位置影響明顯，可作為鹽膚木優(yōu)質(zhì)種源篩選的重要指標(biāo)。 可見(jiàn)，以果實(shí)作為試驗(yàn)材料能更直觀地反映胡桃楸各個(gè)居群間的表型差異。

胡桃楸主要分布于我國(guó)東北及華北地區(qū)，然而近幾年的資源普查發(fā)現(xiàn)山東省的泰山、仰天山、昆崳山等地也有部分自然種群分布，呈現(xiàn)狹域分布格局。 目前，該物種已被列為山東省珍稀瀕危植物，相關(guān)的物種保護(hù)工作也已開(kāi)展[14-16]。 由于個(gè)體數(shù)量少且結(jié)實(shí)率低、嚙齒類動(dòng)物取食以及人為采集等因素影響，獲取一定數(shù)量的群體樣本和果實(shí)材料相對(duì)困難，這導(dǎo)致胡桃楸種質(zhì)資源相關(guān)研究甚少。 前期研究結(jié)果表明，各居群胡桃楸存在一定程度的表型性狀分化，遺傳背景不明確。因此，為探究不同種源地胡桃楸果實(shí)變異規(guī)律及造成其形態(tài)學(xué)特征差異的原因，本研究采集山東地區(qū)3 個(gè)生境的地理居群以及胡桃楸原生地吉林地區(qū)的長(zhǎng)白山居群共13 個(gè)單株的289 枚胡桃楸果實(shí)，測(cè)定其表型性狀，并通過(guò)差異性、相關(guān)性及聚類分析研究其變異程度，同時(shí)，基于ITS 區(qū)域測(cè)序獲得的生物學(xué)信息檢測(cè)其遺傳多樣性水平，挖掘各居群的遺傳背景，以期為胡桃楸種質(zhì)資源的分類鑒定、物種保護(hù)、資源圃建立以及核桃新品種選育等提供參考。

1 材料與方法

1.1 果實(shí)材料采集

本試驗(yàn)對(duì)山東地區(qū)胡桃楸主要居群泰山居群(TS，117.10°E、36.25°N，山東泰安)、仰天山居群(YTS，118.45°E、36.71°N，山東濰坊)、昆崳山居群(KYS，121.74°E、37.30°N，山東煙臺(tái))以及吉林地區(qū)長(zhǎng)白山居群(CBS，121.08°E、38.46°N，吉林延邊)分別進(jìn)行單株取樣；居群內(nèi)各供試植株相距100 m 以上，以避免克隆單株。 于2021 年9 月底到10 月初果實(shí)成熟期采集成熟果實(shí)，分別編號(hào)并帶回實(shí)驗(yàn)室，人工剝離青皮獲得內(nèi)果實(shí)，蒸餾水清洗干凈后，置于通風(fēng)良好處室溫條件下風(fēng)干，然后裝入自封袋保存?zhèn)溆谩?/p>

共收集到4 個(gè)胡桃楸居群13 個(gè)單株的289枚果實(shí)(表1)。 由于結(jié)實(shí)數(shù)量存在差異，從各單株采集的果實(shí)數(shù)量不同，部分單株已達(dá)取樣極大值。 其中，泰山居群6 個(gè)單株140 枚果實(shí)，仰天山居群2 個(gè)單株60 枚果實(shí)，昆崳山居群2 個(gè)單株46枚果實(shí)，長(zhǎng)白山居群3 個(gè)單株43 枚果實(shí)。

表1 試驗(yàn)材料

1.2 DNA 提取

于各供試單株上分別采集成熟葉片3 ～5 枚，迅速置入盛有變色硅膠的封口塑料袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。 隨機(jī)抽取泰山居群的4 個(gè)單株、仰天山居群的2 個(gè)單株、昆崳山居群的2 個(gè)單株、長(zhǎng)白山居群的3 個(gè)單株共計(jì)11 份材料進(jìn)行ITS 區(qū)域測(cè)序分析。 應(yīng)用CTAB 法進(jìn)行DNA 提取，并通過(guò)紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其濃度及質(zhì)量，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 果實(shí)表型性狀數(shù)據(jù)獲取與統(tǒng)計(jì)分析

使用游標(biāo)卡尺(精準(zhǔn)度±0.2 mm)測(cè)量胡桃楸果實(shí)的橫徑(垂直于縱軸無(wú)棱處最大橫截面的長(zhǎng)度)、側(cè)徑(垂直于縱軸的2 條縱棱之間的長(zhǎng)度)與縱徑(果實(shí)縱軸的長(zhǎng)度)，精確到0.001 mm，并計(jì)算果型指數(shù)(果型指數(shù)＝縱徑/橫徑)，果型指數(shù)0.9～1.1 為圓形，＞1.1 ～≤1.5 為橢圓形，＞1.5 為長(zhǎng)橢圓形。 人工觀察判斷果核尖端類型、表面紋飾、縱脊數(shù)目等特征，果核尖端類型分為長(zhǎng)尖、漸尖、無(wú)尖三種，表面溝紋分為深、淺兩種。

運(yùn)用Microsoft Excel 2016 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 不同居群果實(shí)表型性狀差異采用單因素方差分析(ANOVA)，用Duncan’s 最小顯著差異法進(jìn)行多重比較，顯著、極顯著水平分別設(shè)置為0.05、0.01；將數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換，采用組間聯(lián)結(jié)-系統(tǒng)聚類法，以歐式平方距離進(jìn)行聚類分析；采用Pearson 法進(jìn)行相關(guān)性分析。

變異系數(shù)CV ＝S/X×100%，其中S 為性狀標(biāo)準(zhǔn)差，X 為性狀平均值；

相對(duì)極差RR ＝(Xmax- Xmin)/X×100%，其中Xmax、Xmin分別為性狀最大、最小值；

居群遺傳力H2＝1-1/F，其中F 為方差分析中的F 檢驗(yàn)值；

三徑均值D＝(D縱徑+D橫徑+D側(cè)徑)/3；

果實(shí)體積V＝4/3π(1/2D)3。

1.4 ITS 片段PCR 擴(kuò)增與數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用PCR 技術(shù)特異擴(kuò)增11 份胡桃楸材料相關(guān)ITS 片段，并進(jìn)行序列分析，獲得遺傳信息，檢測(cè)變異程度。 引物序列(ITS4:5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC - 3＇； ITS5: 5＇ - GGAAGTAAAA GTCGTAACAAGG-3＇)、擴(kuò)增體系及擴(kuò)增程序參考張浩[17]的方案。 引物合成及所獲得的PCR 產(chǎn)物單向測(cè)序委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行。 利用MEGA-X 軟件對(duì)序列信息進(jìn)行比對(duì)，分別計(jì)算各片段的堿基含量、變異位點(diǎn)數(shù)目、簡(jiǎn)約性信息位點(diǎn)等信息。 運(yùn)用DNAsp 5 軟件計(jì)算ITS 序列單倍型多樣性指數(shù)(Hd)、核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)以及平均核苷酸多樣性差異(K)等相關(guān)遺傳多樣性指數(shù)；應(yīng)用Arlequin 3.5 軟件對(duì)ITS 區(qū)域遺傳信息進(jìn)行分子方差(AMOVA)分析，計(jì)算其遺傳分化系數(shù)(FST)及基因流(Nm)，檢測(cè)胡桃楸居群內(nèi)和居群間的遺傳變異關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同居群胡桃楸果實(shí)表型性狀差異性分析

如圖1 所示，山東地區(qū)不同居群胡桃楸果實(shí)表面紋飾均較淺，多為8 個(gè)縱脊、具長(zhǎng)尖(僅泰山居群17 枚果實(shí)具漸尖和無(wú)尖)，而吉林地區(qū)長(zhǎng)白山居群多為表面紋飾較深、8 個(gè)縱脊、具長(zhǎng)尖。 經(jīng)比較，所收集的泰山居群果實(shí)體積中等，果型變化豐富，140 枚果實(shí)中，57.9%(81 枚)為橢圓形，30.0%(42 枚)為長(zhǎng)橢圓形，12.1%(17 枚)為圓形；仰天山居群胡桃楸果實(shí)體積偏大，51.7%(31枚)為橢圓形，48.3%(29 枚)為長(zhǎng)橢圓形；昆崳山居群果實(shí)體積整體較小，84.8%(39 枚)為橢圓形，15.2%(7 枚)為長(zhǎng)橢圓形；長(zhǎng)白山居群胡桃楸果實(shí)體積最大，32.6%(14 枚)為橢圓形，67.4%(29 枚)為長(zhǎng)橢圓形。

4 個(gè)居群胡桃楸果實(shí)的橫徑、側(cè)徑、縱徑、果型指數(shù)、三徑均值、體積變幅分別為1.85 ～3.15 cm、1.89～3.25 cm、2.17 ～5.17 cm、1.00 ～2.13、2.03 ～3.96 cm、4.38～32.50 cm3，平均值分別為2.39 cm、2.51 cm、3.34 cm、1.40、2.77 cm、11.56 cm3，變異系數(shù)在7.56%～36.07%之間，經(jīng)F 檢驗(yàn)居群間差異均達(dá)極顯著水平(P＜0.01)，遺傳力分別為0.93、0.97、0.98、0.97、0.98、0.98(表2)，推斷這些果實(shí)表型性狀受較強(qiáng)的遺傳特性控制，居群間差異相對(duì)穩(wěn)定。

表2 不同居群胡桃楸果實(shí)表型性狀統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

不同居群中，各單株果實(shí)表型性狀的變化程度存在差異。 對(duì)比果型指數(shù)，CBS 與YTS 居群內(nèi)個(gè)體間無(wú)顯著差異，果實(shí)性狀相似度較高；極值(最大2.14，最小0.93)均出現(xiàn)在TS 居群材料內(nèi)，說(shuō)明該居群個(gè)體間差異明顯，果實(shí)類型最為豐富，其中TS01 與TS02、TS05 單株之間差異顯著，TS03、TS04、TS06 之間差異不顯著。

2.2 胡桃楸果實(shí)表型性狀間的相關(guān)性分析

由表3 可知，胡桃楸果實(shí)的橫徑、側(cè)徑、縱徑、體積、三徑均值間均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，果型指數(shù)與果實(shí)縱徑、三徑均值、體積均極顯著正相關(guān)，表明果實(shí)橫徑、側(cè)徑、縱徑的變異具有互相適應(yīng)的協(xié)同變化特征。

表3 胡桃楸果實(shí)表型性狀間的相關(guān)性系數(shù)

2.3 基于果實(shí)表型性狀的不同居群胡桃楸材料聚類分析

根據(jù)胡桃楸果實(shí)表型性狀數(shù)據(jù)，運(yùn)用歐氏距離類平均法進(jìn)行聚類分析，結(jié)果(圖2)顯示，在歐氏距離25.0 處，可將胡桃楸居群分為2 組，第1組包括 CBS01、 CBS02、 CBS03、 TS01、 TS04、YTS01、YTS02，第2 組包括TS02、TS03、TS05、TS06、KYS01、KYS02。 可見(jiàn)泰山居群內(nèi)多樣性更豐富，呈現(xiàn)一定程度的分化，分別與長(zhǎng)白山居群、昆崳山居群有一定程度的相似。 供試材料間歐氏距離相對(duì)較小，相互混雜，推斷山東地區(qū)胡桃楸不同居群間以及與長(zhǎng)白山居群間存在著基因交流。

圖2 基于歐氏距離構(gòu)建的不同居群胡桃楸果實(shí)表型特征聚類圖

2.4 基于ITS 序列的不同居群胡桃楸遺傳分析

由表4 可見(jiàn)，YTS 居群的Hd、Pi、K 值均為零，其余3 個(gè)居群的Hd 均為1.000、Pi 和K 均表現(xiàn)為CBS＞KYS＞TS，表明YTS 居群遺傳多樣性水平最低，TS 和KYS 居群遺傳多樣性相對(duì)偏高，CBS 居群遺傳多樣性最高。 測(cè)序信息經(jīng)比對(duì)后，不同材料的堿基變異位點(diǎn)無(wú)明顯規(guī)律，呈現(xiàn)隨機(jī)變化。 綜合上述結(jié)論，果實(shí)表型性狀分析結(jié)果與遺傳分析結(jié)果基本一致。 因此，推斷山東地區(qū)3個(gè)胡桃楸居群以及東北地區(qū)CBS 居群各個(gè)體的表型性狀與遺傳背景存在一定程度的相關(guān)性。

表4 基于ITS 序列的胡桃楸居群遺傳多樣性

由遺傳距離分析結(jié)果(表5)可知，4 個(gè)胡桃楸居群間遺傳距離普遍較小(0.001～0.048)，平均值為0.027，其中TS 與KYS 居群遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)，呈現(xiàn)最大遺傳距離(0.048)；而TS 與YTS 居群遺傳距離相對(duì)較近，遺傳距離最小(0.001)。CBS 居群與TS、YTS、KYS 居群地理距離較遠(yuǎn)，但居群間遺傳距離較小，表明各胡桃楸居群間的遺傳距離與地理距離間未表現(xiàn)明顯的相關(guān)性。

表5 基于ITS 序列的胡桃楸居群間遺傳距離

應(yīng)用Arlequin 3.5 軟件對(duì)ITS 區(qū)域遺傳信息進(jìn)行分子方差(AMOVA)分析，結(jié)果(表6)顯示該物種群體總遺傳變異中有41.99%發(fā)生在居群內(nèi)，58.01%的變異發(fā)生在居群間。 3 個(gè)胡桃楸居群間的遺傳分化系數(shù)FST為0.665，居群間基因流Nm較大，為1.93，表明胡桃楸居群間存在基因交流。

表6 胡桃楸居群ITS 序列AMOVA 分析

3 討論與結(jié)論

植物個(gè)體的表型性狀是基因型與環(huán)境共同作用的結(jié)果。 變異系數(shù)越大說(shuō)明對(duì)環(huán)境適應(yīng)性越強(qiáng)，變異系數(shù)小則說(shuō)明性狀相對(duì)穩(wěn)定，遺傳穩(wěn)定性較好，不易受到環(huán)境等因素的影響。 胡桃楸果實(shí)體積、形狀等相關(guān)指標(biāo)均屬于數(shù)量性狀，與個(gè)體生長(zhǎng)的立地生境和樹木生理年齡等因素存在一定相關(guān)性。 于國(guó)斌[18]發(fā)現(xiàn)東北地區(qū)胡桃楸果實(shí)存在豐富的變異類型，不同種源地的胡桃楸果實(shí)橫徑、縱徑、側(cè)徑之間有顯著性差異，推斷變異類型受多種環(huán)境因素影響。 Cosmulescu 等[19]對(duì)核桃屬J.regia的堅(jiān)果形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行比較后認(rèn)為所觀察的性狀變異可能是由農(nóng)業(yè)氣候條件和果實(shí)自身繁殖特性引起。 本研究結(jié)果表明，胡桃楸果實(shí)6 個(gè)表型性狀的變異系數(shù)在7.56%～36.07%之間，在居群間存在極顯著差異，4 個(gè)居群的地理位置、氣候條件和種群大小存在較大差異可能是導(dǎo)致其果實(shí)性狀變異的主要原因；另外，泰山居群的果實(shí)類型最為豐富，表明居群內(nèi)的單株間也存在一定程度的遺傳變異；與逄宏揚(yáng)等[20]的研究結(jié)果一致，本研究也發(fā)現(xiàn)胡桃楸果實(shí)橫徑、側(cè)徑、縱徑之間存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，表明這三個(gè)性狀間具有互相適應(yīng)的協(xié)同變化特征。 豐富的形態(tài)多樣性可為后期進(jìn)行胡桃楸資源收集和種質(zhì)保存提供研究基礎(chǔ)。

聚類分析結(jié)果顯示，泰山居群胡桃楸果實(shí)表型性狀呈現(xiàn)一定程度的分化，分別與長(zhǎng)白山和仰天山居群、昆崳山居群的果實(shí)表型較為相似，而且居群間遺傳距離較小，判斷可能存在著基因交流；而仰天山居群與昆崳山居群間表型性狀差異較大，未聚在一起。 表明這4 個(gè)居群的胡桃楸果實(shí)形態(tài)特征呈現(xiàn)片斷化分布，這與高張瑩等[9]的核桃楸果核形態(tài)特征在部分地區(qū)呈現(xiàn)區(qū)域板塊化特征的結(jié)論一致。

當(dāng)遺傳基礎(chǔ)較窄時(shí)，為適應(yīng)復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境，物種的表型性狀有可能會(huì)隨著外界環(huán)境條件的變化而產(chǎn)生與之相適應(yīng)的遺傳變異。 宋佳興等[8]調(diào)查發(fā)現(xiàn)立地條件相對(duì)一致的胡桃楸果實(shí)表現(xiàn)出豐富的變異類型，推斷胡桃楸種群具有豐富的遺傳多樣性。 高張瑩等[9]研究發(fā)現(xiàn)東北到華北天然分布的9 個(gè)核桃楸種群間果核性狀存在極顯著差異，且各性狀的遺傳力均大于0.9，受到很強(qiáng)的遺傳控制，各表型性狀并未完全按地理距離而聚類。 本研究基于ITS 序列分析結(jié)果顯示，山東地區(qū)的仰天山居群遺傳多樣性水平最低，泰山居群、昆崳山居群和長(zhǎng)白山居群遺傳多樣性相對(duì)偏高；基于形態(tài)學(xué)特征分析的結(jié)果也表明仰天山居群果實(shí)表型性狀較為單一，泰山居群的性狀變異相對(duì)豐富。 兩方面分析所得結(jié)論基本一致，推斷胡桃楸果實(shí)表型性狀的差異是其適應(yīng)不同生境條件的方式之一，且這種變異是不連續(xù)的，可能受遺傳多樣性影響。 因此，若要完全闡明胡桃楸果實(shí)表型變異規(guī)律，還需進(jìn)一步擴(kuò)大種質(zhì)資源的收集范圍，并結(jié)合分子手段對(duì)其遺傳多樣性和親緣關(guān)系等進(jìn)行深入研究。