馬銀花，劉桃梅，萬天雪，肖新波，胡瓊，李萍芳，段仁燕，張斌，金晨鐘，杜波

(1. 湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，湖南婁底 417000；2. 武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/雜交水稻國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430072)

類受體胞質(zhì)激酶(receptor-like cytoplasmic kinases，RLCKs)是一類只含有胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域、無胞外信號肽結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域的特殊蛋白激酶家族，在植物的生長發(fā)育、病原菌防御、脅迫等過程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能[1-4]。 研究表明這類蛋白在擬南芥中有200 個(gè)成員，水稻中有379 個(gè)成員，根據(jù)氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分支，RLCKs 在擬南芥中被分為13 個(gè)亞家族，在水稻中被劃分為17 個(gè)亞家族[3-6]，其在植物中通過磷酸化下游靶蛋白發(fā)揮功能，主要參與了植物的生長、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、非生物脅迫和生物脅迫應(yīng)答等生理過程[7]。 其中研究最多的為RLCK Ⅶ亞家族在植物免疫中的作用，有關(guān)RLCK Ⅵ亞家族基因的研究很少。 對OsRLCK57、OsRLCK107、OsRLCK118和OsRLCK176功能特性進(jìn)行的研究表明，其參與了XA21 介導(dǎo)的水稻先天免疫和BR 信號介導(dǎo)的水稻發(fā)育[8]；OsRLCK102是RLCK Ⅶ亞族蛋白基因，同時(shí)受生物與非生物脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，參與了水稻的生長發(fā)育與免疫反應(yīng)的調(diào)控[9，10]。

近些年，擬南芥中RLCK Ⅵ亞家族蛋白參與植物生長與病原體防御相繼被報(bào)道，如Rop 結(jié)合蛋白激酶1 和2(RBK1 和2)直接結(jié)合AtRop4 GTPase，是植物生長和病原體防御中多種信號傳導(dǎo)途徑的重要調(diào)節(jié)子[11]；Rop 相互作用類受體激酶1 和2(AtRRK1 和2)可以在體外被GTP 結(jié)合的Rop GTP 酶特異性激活[12]；屬于RLCK Ⅶ亞家族的BIK1 和PBL1 與細(xì)胞膜上的受體激酶FLS2和BAK1 相互作用，并且BIK1 和PBL1 在FLS2被其配體flg22 激活時(shí)迅速磷酸化，bik1和pbl1突變體在其FLS2 介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中表現(xiàn)出表型缺陷，表明BIK1 和PBL1 在FLS2 和BAK1 的相互作用介導(dǎo)的PTI 信號傳導(dǎo)過程中具有重要作用[13，14]。

與擬南芥RLCK Ⅵ亞家族相比，對于水稻中RLCK Ⅵ亞家族基因的研究報(bào)道更為稀少。 Os-RRK1(對應(yīng)編號為OsRLCK216)是一個(gè)與OsLec-RK 相互作用的蛋白，也是少有被報(bào)道過的水稻RLCK Ⅵ亞家族成員，研究發(fā)現(xiàn)OsRRK1 在葉片發(fā)育與稻飛虱抗性等方面發(fā)揮著重要作用；Os-RRK1基因的過表達(dá)能使得水稻葉片卷曲，表明RLCK Ⅵ亞家族可能在水稻發(fā)育和免疫方面發(fā)揮作用[4，15-17]。 前期課題組在對OsRRK1基因與其他RLCK Ⅵ亞家族成員同源蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析研究中發(fā)現(xiàn)OsRLCK167與其同源性很高，同屬于RLCK Ⅵ家族成員。 利用生物信息學(xué)分析可以研究蛋白質(zhì)序列、結(jié)構(gòu)以及功能，并對蛋白質(zhì)進(jìn)行同源分析，研究蛋白質(zhì)之間的進(jìn)化關(guān)系，揭示蛋白質(zhì)家族間的關(guān)系[18-20]。 因此對OsRLCK167 蛋白的理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行生物學(xué)信息學(xué)分析，可為深入研究其生物學(xué)特征提供一定理論基礎(chǔ)；通過熒光定量PCR 對OsRLCK167進(jìn)行組織表達(dá)模式分析，推測其在水稻葉片生長發(fā)育過程中可能發(fā)揮的作用能進(jìn)一步豐富對水稻RLCK Ⅵ亞家族基因功能的研究，深化對該家族基因的認(rèn)識，以期為深入探究水稻RLCK Ⅵ亞家族蛋白在水稻中的生物學(xué)功能和挖掘水稻抗性新基因提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

粳稻品種Hejiang 19(H1493)購自國家種質(zhì)資源庫，用于提取水稻RNA；OsRRK1和OsRLCK167的ORF 序列；Escherichia coli菌株TOP10為武漢大學(xué)雜交水稻國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室何光存教授課題組提供。

1.2 生物學(xué)信息分析

運(yùn)用ExPASy-Protparam、Protscale、NCBI 網(wǎng)站的CD-search、SOPMA、Phyre 和Psort 等在線工具對OsRLCK167 蛋白的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測與分析。

1.3 同源基因序列比對與進(jìn)化樹分析

通過DNAMAN 軟件將OsRLCK167基因與OsRRK1基因進(jìn)行序列比對，再用MEGA 5.10 對OsRLCK167 蛋白、水稻中與OsRLCK167 相似性較高的5 個(gè)RLCK 和擬南芥RLCK ⅥA 家族的7個(gè)成員構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.4 組織表達(dá)模式分析

采用TRIzol 試劑(Invitrogen， USA)提取粳稻品種Hejiang 19(H1493)的幼芽、幼根、二分蘗期的根、二分蘗期的葉、成熟期的劍葉、倒二葉、莖、葉鞘、幼穗等組織mRNA；RNA 的反轉(zhuǎn)錄按RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)

的操作步驟進(jìn)行；用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異性引物qRT-OsRLCK167f:5＇-CCTCGTCCTTCCCTCTCGTG-3＇和qRT-OsRLCK167r:5＇-CTGCTGCTGCTGTCTGTCTC-3＇；以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以水稻Actin基因?yàn)閮?nèi)參，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析OsRLCK167在不同組織中的表達(dá)模式，每個(gè)樣品3 次重復(fù)。 PCR 反應(yīng)體系:DNase/RNase-Free ddH2O(TIANGEN) 2.9 μL，2×Super mix 4 μL，上、下游引物(5 mmol/L)各0.3 μL，cDNA 模板0.5 μL。 反應(yīng)程序:95℃變性2 min；95℃變性5 s；60℃退火20 s，共40 個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsRLCK167 蛋白的生物信息學(xué)分析

2.1.1 OsRLCK167 蛋白的理化性質(zhì)分析OsRLCK167基因編碼含有391 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，通過ExPASy-Protparam 在線工具對OsRLCK167 蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該蛋白分子式為C1920H2951N547O600S15；相對分子量為43.77776 kD；理論等電點(diǎn)為4.87；富含強(qiáng)堿性氨基酸(Arg、Lys 共42 個(gè))和強(qiáng)酸性氨基酸(Asp、Glu 共67個(gè))，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為47.35，為不穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為77.83。 氨基酸組成分析結(jié)果表明，天冬氨酸(Asp)、亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、精氨酸(Arg)、絲氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)所占比例較高，分別為10.0%、9.7%、7.7%、7.7%、7.4%、7.4%、7.2%，甲硫氨酸(Met)和谷氨酰胺(Gln)占比較低，分別為1.5%和1.8%(表1)。 OsRLCK167 蛋白的親水性預(yù)測表明，OsRLCK167 蛋白的氨基酸組成中大多為疏水性氨基酸，因此該蛋白為疏水性蛋白(圖1)。 綜上，OsRLCK167 蛋白是一個(gè)疏水性的、不穩(wěn)定的酸性蛋白。

圖1 OsRLCK167 蛋白的疏水性/親水性預(yù)測分析

表1 OsRLCK167 蛋白的氨基酸含量

2.1.2 OsRLCK167 蛋白保守功能域的預(yù)測 通過NCBI 網(wǎng)站的CD-search 工具對OsRLCK167 蛋白的保守功能域進(jìn)行預(yù)測，OsRLCK167 蛋白特定匹配(specific hits)在SPS1，非特定匹配(non-specific)在STKc_IRAK(圖2)，因此，OsRLCK167 蛋白屬于PKc_like superfamily(RKc_like 超級家族)。

圖2 OsRLCK167 蛋白的保守功能域

2.1.3 OsRLCK167 蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過在線網(wǎng)站SOPMA 預(yù)測OsRLCK167 蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，OsRLCK167 蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲(random coil 41.94%)、α-螺旋(alpha helix 35.29%)、延伸鏈(extended strand 15.35%)和β-轉(zhuǎn)角(beta turn 7.42%)組成(圖3)。 因此，該蛋白晶體的空間構(gòu)象可能以無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)所構(gòu)成的。

圖3 OsRLCK167 蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.1.4 OsRLCK167 蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過在線軟件Phyre 對OsRLCK167 蛋白三級結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行預(yù)測分析表明，該蛋白由α-螺旋(alpha helix)、β-轉(zhuǎn)角(beta turn)和無規(guī)則卷曲(random coil)連接而成(圖4)。

圖4 OsRLCK167 蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.1.5 OsRLCK167 蛋白的亞細(xì)胞定位 通過在線網(wǎng)站Psort 進(jìn)行預(yù)測分析表明，該蛋白最可能定位于細(xì)胞質(zhì)，這與OsRRK1 蛋白的亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)的結(jié)果一致[16]，其次可能定位于線粒體、細(xì)胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，定位于分泌系統(tǒng)囊泡和液泡的可能性較低(表2)。

表2 OsRLCK167 蛋白的亞細(xì)胞定位

2.2 OsRLCK167 同源基因序列比對與進(jìn)化分析

對OsRRK1及同源基因OsRLCK167序列進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn)，OsRRK1的ORF 序列為1179 bp，OsRLCK167的ORF 序列是1176 bp，兩者長度接近。OsRLCK167含有6 個(gè)外顯子、5 個(gè)內(nèi)含子。用DNAMAN 軟件將兩者的ORF 序列進(jìn)行比對，兩者的一致性達(dá)70.06%(圖5)。

圖5 水稻OsRRK1 與OsRLCK167 的序列比對

將OsRLCK167 蛋白、水稻中與OsRLCK167相似性較高的5 個(gè)RLCK 和擬南芥RLCK ⅥA 家族的7 個(gè)成員做親緣關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，OsRRK1 與RLCK ⅥA 亞家族親緣關(guān)系最近；進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，OsRLCK167 屬于RLCK ⅥA 亞家族成員，并且與水稻中的OsRRK1 同源性最高(圖6)。

圖6 OsRRK1 與擬南芥和水稻中其他RLCK 家族的進(jìn)化分析

2.3 OsRLCK167 基因的組織表達(dá)模式分析

由圖7 可知，OsRLCK167基因在葉鞘中的表達(dá)量最高，其次是在劍葉和倒二葉中；在幼芽、幼根、二分蘗期的根中表達(dá)量很低；二分蘗期的葉、莖和幼穗中表達(dá)量較低。OsRRK1基因在所檢測的組織中都有表達(dá)，是一個(gè)組成性表達(dá)基因；Os-RRK1基因在水稻生長發(fā)育的各個(gè)時(shí)期都有表達(dá)，在葉片中的表達(dá)量較高，在抽穗期的劍葉中表達(dá)量最高[17]。 通過對比分析表明，OsRRK1和Os-RLCK167并非同一基因，在不同組織中表達(dá)量存在一定差異；另一方面，OsRRK1和OsRLCK167是同源基因，且在水稻生長發(fā)育的各個(gè)時(shí)期都有表達(dá)，但組織表達(dá)模式完全不同，這暗示兩個(gè)基因雖然結(jié)構(gòu)上相似，但基因功能可能不同。

圖7 OsRLCK167 基因在水稻不同組織中的表達(dá)量

3 討論與結(jié)論

RLCK 家族基因存在多種植物中，并在植物生長、發(fā)育、防御等方面起著重要作用。 采用生物信息學(xué)方法進(jìn)行分析，約60%的水稻RLCK基因序列中含有至少5 個(gè)內(nèi)含子，379 個(gè)水稻RLCK基因的內(nèi)含子數(shù)目從0 到26 個(gè)不等，約70%左右的RLCK 蛋白序列中只含有1 個(gè)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，且參與許多重要的生理過程[3，7，11，21，22]。 而OsRLCK167 蛋白屬于RLCK ⅥA 亞家族成員，并且與水稻中的OsRRK1 同源性最高，從基因序列對比來看，OsRLCK167與OsRRK1序列長度十分接近，一致性達(dá)到70.06%，且OsRLCK167基因在根、莖、葉、葉鞘等均有表達(dá)，說明OsRLCK167基因可能與OsRRK1基因一樣參與多個(gè)組織器官的發(fā)育過程。 前期研究已發(fā)現(xiàn)OsRRK1 與水稻植株葉片直立有關(guān)，OsRLCK167 也與水稻葉片生長發(fā)育相關(guān)，其在水稻生長發(fā)育中的功能可能與OsRRK1相似，但基因功能可能不同；將OsRRK1抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株與野生植株對比，沒有產(chǎn)生顯著的表型差異，且發(fā)現(xiàn)其同源基因OsRLCK167在Os-RRK1抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)量與野生型相比并無差異。 據(jù)此我們推測，抑制OsRRK1基因的表達(dá)并不影響水稻葉發(fā)育表型的原因可能是OsRRK1基因與同源基因OsRLCK167存在功能冗余關(guān)系。

本研究表明，OsRLCK167 是一個(gè)具有疏水性、保守的、酸性、不穩(wěn)定蛋白，以高水平、保守方式調(diào)控水稻多個(gè)生物學(xué)過程，且與同源基因Os-RRK1在組織表達(dá)模式上相似。 本研究進(jìn)一步豐富了對RLCK Ⅵ亞家族基因的研究，為后續(xù)深入研究OsRLCK167 蛋白的不同生理功能提供了理論基礎(chǔ)。