馬銀花,劉桃梅,萬天雪,肖新波,胡瓊,李萍芳,段仁燕,張斌,金晨鐘,杜波
(1. 湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,湖南婁底 417000;2. 武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/雜交水稻國家重點實驗室,湖北武漢 430072)
類受體胞質(zhì)激酶(receptor-like cytoplasmic kinases,RLCKs)是一類只含有胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域、無胞外信號肽結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域的特殊蛋白激酶家族,在植物的生長發(fā)育、病原菌防御、脅迫等過程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能[1-4]。 研究表明這類蛋白在擬南芥中有200 個成員,水稻中有379 個成員,根據(jù)氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分支,RLCKs 在擬南芥中被分為13 個亞家族,在水稻中被劃分為17 個亞家族[3-6],其在植物中通過磷酸化下游靶蛋白發(fā)揮功能,主要參與了植物的生長、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、非生物脅迫和生物脅迫應(yīng)答等生理過程[7]。 其中研究最多的為RLCK Ⅶ亞家族在植物免疫中的作用,有關(guān)RLCK Ⅵ亞家族基因的研究很少。 對OsRLCK57、OsRLCK107、OsRLCK118和OsRLCK176功能特性進(jìn)行的研究表明,其參與了XA21 介導(dǎo)的水稻先天免疫和BR 信號介導(dǎo)的水稻發(fā)育[8];OsRLCK102是RLCK Ⅶ亞族蛋白基因,同時受生物與非生物脅迫的誘導(dǎo)表達(dá),參與了水稻的生長發(fā)育與免疫反應(yīng)的調(diào)控[9,10]。
近些年,擬南芥中RLCK Ⅵ亞家族蛋白參與植物生長與病原體防御相繼被報道,如Rop 結(jié)合蛋白激酶1 和2(RBK1 和2)直接結(jié)合AtRop4 GTPase,是植物生長和病原體防御中多種信號傳導(dǎo)途徑的重要調(diào)節(jié)子[11];Rop 相互作用類受體激酶1 和2(AtRRK1 和2)可以在體外被GTP 結(jié)合的Rop GTP 酶特異性激活[12];屬于RLCK Ⅶ亞家族的BIK1 和PBL1 與細(xì)胞膜上的受體激酶FLS2和BAK1 相互作用,并且BIK1 和PBL1 在FLS2被其配體flg22 激活時迅速磷酸化,bik1和pbl1突變體在其FLS2 介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中表現(xiàn)出表型缺陷,表明BIK1 和PBL1 在FLS2 和BAK1 的相互作用介導(dǎo)的PTI 信號傳導(dǎo)過程中具有重要作用[13,14]。
與擬南芥RLCK Ⅵ亞家族相比,對于水稻中RLCK Ⅵ亞家族基因的研究報道更為稀少。 Os-RRK1(對應(yīng)編號為OsRLCK216)是一個與OsLec-RK 相互作用的蛋白,也是少有被報道過的水稻RLCK Ⅵ亞家族成員,研究發(fā)現(xiàn)OsRRK1 在葉片發(fā)育與稻飛虱抗性等方面發(fā)揮著重要作用;Os-RRK1基因的過表達(dá)能使得水稻葉片卷曲,表明RLCK Ⅵ亞家族可能在水稻發(fā)育和免疫方面發(fā)揮作用[4,15-17]。 前期課題組在對OsRRK1基因與其他RLCK Ⅵ亞家族成員同源蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析研究中發(fā)現(xiàn)OsRLCK167與其同源性很高,同屬于RLCK Ⅵ家族成員。 利用生物信息學(xué)分析可以研究蛋白質(zhì)序列、結(jié)構(gòu)以及功能,并對蛋白質(zhì)進(jìn)行同源分析,研究蛋白質(zhì)之間的進(jìn)化關(guān)系,揭示蛋白質(zhì)家族間的關(guān)系[18-20]。 因此對OsRLCK167 蛋白的理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行生物學(xué)信息學(xué)分析,可為深入研究其生物學(xué)特征提供一定理論基礎(chǔ);通過熒光定量PCR 對OsRLCK167進(jìn)行組織表達(dá)模式分析,推測其在水稻葉片生長發(fā)育過程中可能發(fā)揮的作用能進(jìn)一步豐富對水稻RLCK Ⅵ亞家族基因功能的研究,深化對該家族基因的認(rèn)識,以期為深入探究水稻RLCK Ⅵ亞家族蛋白在水稻中的生物學(xué)功能和挖掘水稻抗性新基因提供一定的理論基礎(chǔ)。
粳稻品種Hejiang 19(H1493)購自國家種質(zhì)資源庫,用于提取水稻RNA;OsRRK1和OsRLCK167的ORF 序列;Escherichia coli菌株TOP10為武漢大學(xué)雜交水稻國家重點實驗室何光存教授課題組提供。
運用ExPASy-Protparam、Protscale、NCBI 網(wǎng)站的CD-search、SOPMA、Phyre 和Psort 等在線工具對OsRLCK167 蛋白的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測與分析。
通過DNAMAN 軟件將OsRLCK167基因與OsRRK1基因進(jìn)行序列比對,再用MEGA 5.10 對OsRLCK167 蛋白、水稻中與OsRLCK167 相似性較高的5 個RLCK 和擬南芥RLCK ⅥA 家族的7個成員構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。
采用TRIzol 試劑(Invitrogen, USA)提取粳稻品種Hejiang 19(H1493)的幼芽、幼根、二分蘗期的根、二分蘗期的葉、成熟期的劍葉、倒二葉、莖、葉鞘、幼穗等組織mRNA;RNA 的反轉(zhuǎn)錄按RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)
的操作步驟進(jìn)行;用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計特異性引物qRT-OsRLCK167f:5'-CCTCGTCCTTCCCTCTCGTG-3'和qRT-OsRLCK167r:5'-CTGCTGCTGCTGTCTGTCTC-3';以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,以水稻Actin基因為內(nèi)參,利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析OsRLCK167在不同組織中的表達(dá)模式,每個樣品3 次重復(fù)。 PCR 反應(yīng)體系:DNase/RNase-Free ddH2O(TIANGEN) 2.9 μL,2×Super mix 4 μL,上、下游引物(5 mmol/L)各0.3 μL,cDNA 模板0.5 μL。 反應(yīng)程序:95℃變性2 min;95℃變性5 s;60℃退火20 s,共40 個循環(huán)。
2.1.1 OsRLCK167 蛋白的理化性質(zhì)分析OsRLCK167基因編碼含有391 個氨基酸的蛋白質(zhì),通過ExPASy-Protparam 在線工具對OsRLCK167 蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析,結(jié)果顯示該蛋白分子式為C1920H2951N547O600S15;相對分子量為43.77776 kD;理論等電點為4.87;富含強堿性氨基酸(Arg、Lys 共42 個)和強酸性氨基酸(Asp、Glu 共67個),蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為47.35,為不穩(wěn)定蛋白,脂肪系數(shù)為77.83。 氨基酸組成分析結(jié)果表明,天冬氨酸(Asp)、亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、精氨酸(Arg)、絲氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)所占比例較高,分別為10.0%、9.7%、7.7%、7.7%、7.4%、7.4%、7.2%,甲硫氨酸(Met)和谷氨酰胺(Gln)占比較低,分別為1.5%和1.8%(表1)。 OsRLCK167 蛋白的親水性預(yù)測表明,OsRLCK167 蛋白的氨基酸組成中大多為疏水性氨基酸,因此該蛋白為疏水性蛋白(圖1)。 綜上,OsRLCK167 蛋白是一個疏水性的、不穩(wěn)定的酸性蛋白。
圖1 OsRLCK167 蛋白的疏水性/親水性預(yù)測分析
表1 OsRLCK167 蛋白的氨基酸含量
2.1.2 OsRLCK167 蛋白保守功能域的預(yù)測 通過NCBI 網(wǎng)站的CD-search 工具對OsRLCK167 蛋白的保守功能域進(jìn)行預(yù)測,OsRLCK167 蛋白特定匹配(specific hits)在SPS1,非特定匹配(non-specific)在STKc_IRAK(圖2),因此,OsRLCK167 蛋白屬于PKc_like superfamily(RKc_like 超級家族)。
圖2 OsRLCK167 蛋白的保守功能域
2.1.3 OsRLCK167 蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過在線網(wǎng)站SOPMA 預(yù)測OsRLCK167 蛋白的二級結(jié)構(gòu),結(jié)果表明,OsRLCK167 蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲(random coil 41.94%)、α-螺旋(alpha helix 35.29%)、延伸鏈(extended strand 15.35%)和β-轉(zhuǎn)角(beta turn 7.42%)組成(圖3)。 因此,該蛋白晶體的空間構(gòu)象可能以無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)所構(gòu)成的。
圖3 OsRLCK167 蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測
2.1.4 OsRLCK167 蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過在線軟件Phyre 對OsRLCK167 蛋白三級結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行預(yù)測分析表明,該蛋白由α-螺旋(alpha helix)、β-轉(zhuǎn)角(beta turn)和無規(guī)則卷曲(random coil)連接而成(圖4)。
圖4 OsRLCK167 蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測
2.1.5 OsRLCK167 蛋白的亞細(xì)胞定位 通過在線網(wǎng)站Psort 進(jìn)行預(yù)測分析表明,該蛋白最可能定位于細(xì)胞質(zhì),這與OsRRK1 蛋白的亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)的結(jié)果一致[16],其次可能定位于線粒體、細(xì)胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng),定位于分泌系統(tǒng)囊泡和液泡的可能性較低(表2)。
表2 OsRLCK167 蛋白的亞細(xì)胞定位
對OsRRK1及同源基因OsRLCK167序列進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn),OsRRK1的ORF 序列為1179 bp,OsRLCK167的ORF 序列是1176 bp,兩者長度接近。OsRLCK167含有6 個外顯子、5 個內(nèi)含子。用DNAMAN 軟件將兩者的ORF 序列進(jìn)行比對,兩者的一致性達(dá)70.06%(圖5)。
圖5 水稻OsRRK1 與OsRLCK167 的序列比對
將OsRLCK167 蛋白、水稻中與OsRLCK167相似性較高的5 個RLCK 和擬南芥RLCK ⅥA 家族的7 個成員做親緣關(guān)系分析發(fā)現(xiàn),OsRRK1 與RLCK ⅥA 亞家族親緣關(guān)系最近;進(jìn)化樹分析結(jié)果表明,OsRLCK167 屬于RLCK ⅥA 亞家族成員,并且與水稻中的OsRRK1 同源性最高(圖6)。
圖6 OsRRK1 與擬南芥和水稻中其他RLCK 家族的進(jìn)化分析
由圖7 可知,OsRLCK167基因在葉鞘中的表達(dá)量最高,其次是在劍葉和倒二葉中;在幼芽、幼根、二分蘗期的根中表達(dá)量很低;二分蘗期的葉、莖和幼穗中表達(dá)量較低。OsRRK1基因在所檢測的組織中都有表達(dá),是一個組成性表達(dá)基因;Os-RRK1基因在水稻生長發(fā)育的各個時期都有表達(dá),在葉片中的表達(dá)量較高,在抽穗期的劍葉中表達(dá)量最高[17]。 通過對比分析表明,OsRRK1和Os-RLCK167并非同一基因,在不同組織中表達(dá)量存在一定差異;另一方面,OsRRK1和OsRLCK167是同源基因,且在水稻生長發(fā)育的各個時期都有表達(dá),但組織表達(dá)模式完全不同,這暗示兩個基因雖然結(jié)構(gòu)上相似,但基因功能可能不同。
圖7 OsRLCK167 基因在水稻不同組織中的表達(dá)量
RLCK 家族基因存在多種植物中,并在植物生長、發(fā)育、防御等方面起著重要作用。 采用生物信息學(xué)方法進(jìn)行分析,約60%的水稻RLCK基因序列中含有至少5 個內(nèi)含子,379 個水稻RLCK基因的內(nèi)含子數(shù)目從0 到26 個不等,約70%左右的RLCK 蛋白序列中只含有1 個蛋白激酶結(jié)構(gòu)域,且參與許多重要的生理過程[3,7,11,21,22]。 而OsRLCK167 蛋白屬于RLCK ⅥA 亞家族成員,并且與水稻中的OsRRK1 同源性最高,從基因序列對比來看,OsRLCK167與OsRRK1序列長度十分接近,一致性達(dá)到70.06%,且OsRLCK167基因在根、莖、葉、葉鞘等均有表達(dá),說明OsRLCK167基因可能與OsRRK1基因一樣參與多個組織器官的發(fā)育過程。 前期研究已發(fā)現(xiàn)OsRRK1 與水稻植株葉片直立有關(guān),OsRLCK167 也與水稻葉片生長發(fā)育相關(guān),其在水稻生長發(fā)育中的功能可能與OsRRK1相似,但基因功能可能不同;將OsRRK1抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株與野生植株對比,沒有產(chǎn)生顯著的表型差異,且發(fā)現(xiàn)其同源基因OsRLCK167在Os-RRK1抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)量與野生型相比并無差異。 據(jù)此我們推測,抑制OsRRK1基因的表達(dá)并不影響水稻葉發(fā)育表型的原因可能是OsRRK1基因與同源基因OsRLCK167存在功能冗余關(guān)系。
本研究表明,OsRLCK167 是一個具有疏水性、保守的、酸性、不穩(wěn)定蛋白,以高水平、保守方式調(diào)控水稻多個生物學(xué)過程,且與同源基因Os-RRK1在組織表達(dá)模式上相似。 本研究進(jìn)一步豐富了對RLCK Ⅵ亞家族基因的研究,為后續(xù)深入研究OsRLCK167 蛋白的不同生理功能提供了理論基礎(chǔ)。