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        甘薯CLE 多肽家族的全基因組鑒定和IbCLE12 的克隆及抗旱性表達分析

        2023-06-19 12:04:24周媛媛趙春玲侯夫云李愛賢秦楨王慶美董順旭
        山東農(nóng)業(yè)科學 2023年5期
        關(guān)鍵詞:甘薯多肽擬南芥

        周媛媛,趙春玲,侯夫云,李愛賢,秦楨,王慶美,董順旭

        (1. 山東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所,山東濟南 250100;2. 山東師范大學,山東濟南 250014)

        多肽類激素與脫落酸、茉莉酸、細胞分裂素、生長素、赤霉素、乙烯等傳統(tǒng)植物激素一起,在植物抵御逆境脅迫過程中起重要作用,近年來多肽激素的研究進展較快[1,2]。 CLAVATA3/Embryo surrounding region-related (CLE)多肽家族是研究最多的一類多肽激素[3,4],其命名依據(jù)是擬南芥CLAVATA3(CLV3)和玉米胚胎周邊區(qū)(embryo surrounding region, ERS);在結(jié)構(gòu)上,一般編碼50~200 個氨基酸的小蛋白,N-末端存在一個分泌信號肽,C-末端存在一個含14 個氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域,中間是可變區(qū)域[5];根據(jù)CLE motif 的首個氨基酸類型將其分為R(arginine,Arg)和H(histidine, His)兩類,這兩類之外的統(tǒng)稱other類[6]。 相關(guān)研究表明,CLE 家族成員在根、莖尖分生組織的干細胞分裂和分化、維管(原)形成層、激素信號響應以及抗逆性響應中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用[7-9]。 目前,在擬南芥中發(fā)現(xiàn)32 個CLE 成員[6],其中,CLE25 多肽在根部響應干旱脅迫,并通過BAM 受體將缺水信號傳導至葉片,與ABA共同調(diào)控氣孔的關(guān)閉,減少蒸騰作用,從而提高對干旱的抗性[9]。

        甘薯[Ipomoea batatas(L.) Lam.]是世界主要農(nóng)作物之一,可用作糧食、飼料、工業(yè)原料和新型能源,廣泛種植于100 多個國家或地區(qū),具有重要的經(jīng)濟價值[10,11]。 甘薯在生長過程中經(jīng)常遭受干旱等逆境脅迫[12],所以研究CLE 家族成員及其功能對提高甘薯抗逆性具有重要意義。 目前已有57 個植物基因組中的1628 個CLE 多肽得到預測,但在甘薯中尚未見研究報道。 本研究利用野生型甘薯Ipomoea trifida(H.B.K.) G. Don.的基因組[13],系統(tǒng)挖掘甘薯CLE 家族成員,利用生物信息學方法進行分析,并進一步從甘薯栽培種中克隆得到IbCLE12基因,利用實時熒光定量法分析其在干旱脅迫下的表達,以期為探究甘薯CLE 多肽家族基因的功能奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        甘薯近緣二倍體野生種Ipomoea trifida(H.B.K.) G. Don.,是栽培甘薯的祖先種之一,其基因組測序已經(jīng)完成。 甘薯栽培種選用濟薯25。

        1.2 Ipomoea trifida CLE 家族基因的全基因組鑒定及分析

        1.2.1 甘薯CLE 家族基因的篩選 基于甘薯組學資源網(wǎng)GT4SP 項目的基因注釋文件(http:/ /sweetpotato.plantbiology.msu.edu/index.shtml)查找所有已注釋的ItfCLE基因,并下載相關(guān)序列。

        1.2.2ItfCLE基因結(jié)構(gòu)分析 利用ProtParam 在線軟件(https:/ /web.expasy.org/protparam)分析ItfCLE 蛋白理化性質(zhì)。 利用TMHMM 2.0(https:/ /services.healthtech.dtu.dk/service.php? TMHMM-2.0)分析基因的跨膜螺旋位點,利用Soft-Berry ProtComp 9.0 預測蛋白亞細胞定位情況。利用MEME (http:/ /meme-suite.org/tools/meme)分析ItfCLE 氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域,參數(shù)設置為允許保守結(jié)構(gòu)域重復出現(xiàn)、搜索得到的保守域上限為6 個、基序長度為10 ~100。 利用TBtools工具繪制ItfCLE基因結(jié)構(gòu)圖。

        1.2.3 ItfCLE 家族的系統(tǒng)發(fā)育分析 采用MEGA 5.0 軟件的NJ 法,基于保守CLE motif 氨基酸序列,構(gòu)建ItfCLEs 和擬南芥AtCLEs 的系統(tǒng)發(fā)育進化樹,Bootstrap 重復1000 次。

        1.2.4ItfCLEs基因的組織特異性表達和不同逆境下的表達譜分析 利用甘薯基因組學資源網(wǎng)站中的RNA-seq 基因表達數(shù)據(jù),用FPKM(fragments per kilobase per million mapped reads)值表示基因相對表達水平,利用TBtools 建立熱圖,進行不同基因間聚類。

        1.3 IbCLE12 基因的克隆及表達分析

        1.3.1IbCLE12基因的克隆 利用TRIzol 試劑盒(Invitrogen,上海,中國)提取總RNA,利用TaKa-Ra 反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)對樣品進行反轉(zhuǎn)錄,獲得濟薯25 的cDNA,利用TaKaRaLA Taq試劑盒擴增IbCLE12基因的完整CDS 序列。 擴增引物為IbCLE12-F(5'-ATGGGTAGTAATTTGAGGAGTAGGA-3')和IbCLE12-R(5'-TCATGGCTTGTCAAGCTCTCC-3')。 擴增體系(50 μL):LA Taq0.5 μL,LA Buffer(Mg2+plus)8 μL,dNTP Mixture 5 μL,引物混合物2 μL,cDNA 2 μL,ddH2O 32.5 μL。 擴增程序:94℃3 min;94℃30 s,55℃30 s,72℃30 s,34 個循環(huán);72℃10 min。

        1.3.2 干旱脅迫和ABA 處理下IbCLE12基因的表達分析 用2021 年收獲的濟薯25 薯塊,在溫室中培養(yǎng)4 周,取長勢一致、含5~6 個功能葉的莖段,分別用含20% PEG6000 和100 mmol/L ABA 的1/2 霍格蘭溶液處理,分別于處理0、3、6、12、24、48 h取葉片,用液氮速凍,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        利用Invitrogen TRIzol 試劑盒提取總RNA,利用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 對每個樣品進行反轉(zhuǎn)錄,利用SYBR PremixEx TaqⅡ定量試劑(Tli RNaseH Plus, TaKaRa, 大連, 中國) 在Roche LightCycler?480Ⅱ(Roche,英國)進行qRT-PCR分析。 擴增引物為ItfCLE-qPCR-F(5'-TATTGGTGGGAGTGGTTGGGT-3')和ItfCLE-qPCR-R(5'-CATGCTCATATGCCTCATGCT-3')。 擴增體系:SYBR Green Master Mix 5 μL,引物混合物0.4 μL,cDNA 1 μL,ddH2O 3.6 μL。 反應程序:95℃預變性2 min;95℃變性15 s,55℃退火15 s,72℃延伸15 s,40 個循環(huán)。

        使用內(nèi)參基因IbActin為校準,利用2-ΔΔCt計算基因的相對表達水平。 每個樣品進行3 次重復試驗,以未處理(0 h) 的樣品為對照,采用Student’st-test 方法進行顯著性分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 ItfCLE 基因的篩選和蛋白特征分析

        從I.trifida中篩選到12 個CLE 家族基因,根據(jù)其在染色體上的位置進行重新編號,分別命名為ItfCLE1~ItfCLE12(表1)。 這12 個ItfCLE 蛋白長度在81 ~154 個氨基酸之間,分子量在9.0 ~17.5 kDa 之間,等電點均大于7,屬于堿性蛋白。只有ItfCLE2 和ItfCLE6 為穩(wěn)定蛋白,其余均為不穩(wěn)定蛋白,且ItfCLE3 不穩(wěn)定系數(shù)最高。 除分子量最大的ItfCLE5 為疏水脂溶蛋白外,其余均為親水性脂溶蛋白。 根據(jù)保守區(qū)的首個氨基酸類型分類,只有ItfCLE6 屬于H 型,其余均為R 型。

        表1 ItfCLEs 蛋白理化性質(zhì)

        利用MEME 軟件分析ItfCLE 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域,共獲得6 個保守基序,分別命名為Motif1 ~Motif6。 12 個 ItfCLE 成員均含有 Motif1(VSKRKVPSGPBPJHN),所以,Motif1 是甘薯CLE的特征保守基序(圖1)。

        圖1 ItfCLE 蛋白保守基序分析

        根據(jù)蛋白定位預測結(jié)果(表2),12 個ItfCLE蛋白在胞外都有分布;僅ItfCLE9 在質(zhì)膜中有分布,其余蛋白則在細胞質(zhì)、過氧化物酶體以及葉綠體中有分布。 據(jù)此推測ItfCLE 蛋白可能主要存在于過氧化物酶體、葉綠體以及細胞質(zhì)中,外排到胞外。

        表2 ItfCLE 蛋白的定位分析

        2.2 ItfCLEs 的進化分析

        通過ItfCLEs 與AtCLEs 的進化關(guān)系樹(圖2)可知,甘薯的ItfCLEs 主要分為5 個亞族。 Itf-CLE1、 ItfCLE4、 ItfCLE6、 ItfCLE8、 ItfCLE11、 Itf-CLE12 親緣關(guān)系較近,其中,ItfCLE1、ItfCLE8、Itf-CLE4 與擬南芥的AtCLE45 屬于同一組,ItfCLE12與AtCLE25 屬于同一組,ItfCLE6 與AtCLE46 屬于同一組;ItfCLE10 與AtCLE27 親緣關(guān)系較近;ItfCLE3 和ItfCLE2 屬于同一亞族,并與AtCLE20 親緣關(guān)系較近;ItfCLE7 與AtCLE9、AtCLE10 親緣關(guān)系較近;ItfCLE5 和ItfCLE9 屬于同一亞族,分別與AtCLE13 和AtCLE8 親緣關(guān)系較近。

        圖2 甘薯12 個ItfCLEs 和擬南芥32 個AtCLEs 進化樹分析

        2.3 ItfCLE 基因的組織特異性表達分析

        結(jié)果(圖3)表明,ItfCLE9、ItfCLE10在花中有較高的表達;ItfCLE4、ItfCLE12在根中有較高的表達;ItfCLE1、ItfCLE3、ItfCLE5、ItfCLE7、ItfCLE11在各組織中表達量較低,差異較??;ItfCLE2、ItfCLE6和ItfCLE8在莖中表達較高。

        圖3 甘薯12 個ItfCLE 基因的組織特異性表達分析

        2.4 ItfCLE 基因在不同逆境脅迫下的表達特征分析

        結(jié)果(圖4)表明,與對照相比,ItfCLE10受旱、鹽脅迫和兩種病害處理后下調(diào)表達;ItfCLE8受旱、鹽脅迫后上調(diào)表達,受冷和熱脅迫后下調(diào)表達;ItfCLE12受旱脅迫和病2 處理后上調(diào)表達,受鹽、冷和病1 脅迫后下調(diào)表達;ItfCLE3受鹽、冷、熱脅迫后下調(diào)表達。 其余基因受脅迫后表達量變化較小。

        圖4 甘薯12 個ItfCLE 基因的表達譜分析

        2.5 IbCLE12 基因的克隆和氨基酸序列比對

        利用同源克隆方法在濟薯25 中克隆得到Itf-CLE12的同源基因,命名為IbCLE12。 氨基酸序列比對結(jié)果(圖5)表明,IbCLE12 與ItfCLE12 一致性較高,僅在第23、26 位有兩個氨基酸的差異;IbCLE12與AtCLE25的一致性達到32.74%,兩者C 端保守CLE 基序一致。

        圖5 IbCLE12 與ItfCLE12、AtCLE25 的序列比對

        2.6 IbCLE12 基因受干旱和ABA 誘導表達分析

        結(jié)果(圖6)表明,IbCLE12基因受干旱和ABA 誘導上調(diào)表達,分別在處理6 h(5.48 倍)和12 h(5.06 倍)表達量最高。 處理時間延長,表達量顯著降低。

        圖6 干旱(A)和ABA(B)脅迫下IbCLE12 基因的表達情況

        3 討論與結(jié)論

        CLE 家族基因編碼的多肽是21 世紀以來發(fā)現(xiàn)的新型多肽激素,在細胞間的信號交流中發(fā)揮重要作用[3,5,14]。 CLE 蛋白信號肽使蛋白遷移至細胞膜,并與膜上的受體激酶特異性結(jié)合,將信號轉(zhuǎn)導至下游分生組織發(fā)育的WUSCHEL(WUS)轉(zhuǎn)錄因子,形成信號轉(zhuǎn)導模塊,從而調(diào)控分生組織的干細胞增殖和分化,最終影響根、莖等器官的分化[15]。 甘薯野生種I.trifida中包含12 個CLE 家族基因,蛋白C 端均包含CLE 保守結(jié)構(gòu)域,家族基因數(shù)量少于擬南芥等模式植物,可能與數(shù)據(jù)庫組裝過程中小分子基因的覆蓋度相關(guān)[16]。 甘薯作為塊根作物,根中分生組織的干細胞分化和增殖直接影響形成層的發(fā)育,并最終與產(chǎn)量密切相關(guān)。 有研究表明,通過對人參CLE 家族序列特征和系統(tǒng)進化關(guān)系進行分析,發(fā)現(xiàn)PgCLE基因?qū)ζ涓桶l(fā)育起重要的調(diào)控作用[17]。 本研究結(jié)果表明,ItfCLE在野生型甘薯中存在明顯的組織表達差異性,其中,ItfCLE9、ItfCLE10在花中有較高的表達;ItfCLE4、ItfCLE12在根中有較高的表達;Itf-CLE2、ItfCLE6和ItfCLE8在莖中表達較高;Itf-CLE1、ItfCLE3、ItfCLE5、ItfCLE7、ItfCLE11在各組織中表達量較低,差異較小。 可見,甘薯中CLE成員在不同器官發(fā)育過程中可能發(fā)揮不同的調(diào)控作用。

        CLE 家族基因在作物響應生物脅迫中也具有重要調(diào)節(jié)作用。 研究表明,在大豆囊線蟲、馬鈴薯囊線蟲和根結(jié)線蟲中具有和宿主類似的CLE,并通過與宿主中的CLE 受體相互作用,提高線蟲對宿主的侵染力[18,19]。 敲除CLE 受體可以顯著提高大豆對大豆囊線蟲的抵抗能力[20]。 本研究結(jié)果表明,與對照相比,在兩種病害脅迫下大部分ItfCLEs表達量變化不大,但ItfCLE7、ItfCLE10明顯下調(diào)表達,ItfCLE12在病1 處理下也表達下調(diào),推測其在生物脅迫中主要起負調(diào)控作用。

        CLE 家族基因在作物抵御非生物脅迫中也發(fā)揮重要作用。 研究表明,擬南芥的AtCLE25 多肽可以實現(xiàn)從根到芽的長距離信號轉(zhuǎn)導,并通過介導ABA 信號途徑促進氣孔關(guān)閉,感應根的缺水信號,提高植物的抗旱性[9];AtCLE45通過下游受體SKM1 和SKM2 調(diào)節(jié)擬南芥種子形成過程中的耐熱性[21]。 在擬南芥缺失突變體cle40-2中,ABA合成通路上的AtCLE25、AtCLE45基因表達下調(diào),說明其在ABA 合成通路上起關(guān)鍵的正調(diào)控功能[22]。 在本研究中,受旱脅迫后明顯上調(diào)表達的有ItfCLE8和ItfCLE12,而ItfCLE12 與擬南芥At-CLE25 親緣關(guān)系較近,推測ItfCLE12在甘薯抗旱性中發(fā)揮調(diào)控作用。 為此,我們在甘薯栽培品種中克隆了ItfCLE12的同源基因IbCLE12,并進行模擬干旱和ABA 處理,結(jié)果表明該基因分別在處理6 h 和12 h 受干旱和ABA 誘導顯著上調(diào)表達,可為深入研究IbCLE12在甘薯抗旱性中的分子機制奠定基礎(chǔ)。

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