周媛媛，趙春玲，侯夫云，李愛賢，秦楨，王慶美，董順旭

(1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，山東濟(jì)南 250100；2. 山東師范大學(xué)，山東濟(jì)南 250014)

多肽類激素與脫落酸、茉莉酸、細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素、赤霉素、乙烯等傳統(tǒng)植物激素一起，在植物抵御逆境脅迫過(guò)程中起重要作用，近年來(lái)多肽激素的研究進(jìn)展較快[1，2]。 CLAVATA3/Embryo surrounding region-related (CLE)多肽家族是研究最多的一類多肽激素[3，4]，其命名依據(jù)是擬南芥CLAVATA3(CLV3)和玉米胚胎周邊區(qū)(embryo surrounding region， ERS)；在結(jié)構(gòu)上，一般編碼50～200 個(gè)氨基酸的小蛋白，N-末端存在一個(gè)分泌信號(hào)肽，C-末端存在一個(gè)含14 個(gè)氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域，中間是可變區(qū)域[5]；根據(jù)CLE motif 的首個(gè)氨基酸類型將其分為R(arginine，Arg)和H(histidine， His)兩類，這兩類之外的統(tǒng)稱other類[6]。 相關(guān)研究表明，CLE 家族成員在根、莖尖分生組織的干細(xì)胞分裂和分化、維管(原)形成層、激素信號(hào)響應(yīng)以及抗逆性響應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用[7-9]。 目前，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)32 個(gè)CLE 成員[6]，其中，CLE25 多肽在根部響應(yīng)干旱脅迫，并通過(guò)BAM 受體將缺水信號(hào)傳導(dǎo)至葉片，與ABA共同調(diào)控氣孔的關(guān)閉，減少蒸騰作用，從而提高對(duì)干旱的抗性[9]。

甘薯[Ipomoea batatas(L.) Lam.]是世界主要農(nóng)作物之一，可用作糧食、飼料、工業(yè)原料和新型能源，廣泛種植于100 多個(gè)國(guó)家或地區(qū)，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[10，11]。 甘薯在生長(zhǎng)過(guò)程中經(jīng)常遭受干旱等逆境脅迫[12]，所以研究CLE 家族成員及其功能對(duì)提高甘薯抗逆性具有重要意義。 目前已有57 個(gè)植物基因組中的1628 個(gè)CLE 多肽得到預(yù)測(cè)，但在甘薯中尚未見研究報(bào)道。 本研究利用野生型甘薯Ipomoea trifida(H.B.K.) G. Don.的基因組[13]，系統(tǒng)挖掘甘薯CLE 家族成員，利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行分析，并進(jìn)一步從甘薯栽培種中克隆得到IbCLE12基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量法分析其在干旱脅迫下的表達(dá)，以期為探究甘薯CLE 多肽家族基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘薯近緣二倍體野生種Ipomoea trifida(H.B.K.) G. Don.，是栽培甘薯的祖先種之一，其基因組測(cè)序已經(jīng)完成。 甘薯栽培種選用濟(jì)薯25。

1.2 Ipomoea trifida CLE 家族基因的全基因組鑒定及分析

1.2.1 甘薯CLE 家族基因的篩選 基于甘薯組學(xué)資源網(wǎng)GT4SP 項(xiàng)目的基因注釋文件(http:/ /sweetpotato.plantbiology.msu.edu/index.shtml)查找所有已注釋的ItfCLE基因，并下載相關(guān)序列。

1.2.2ItfCLE基因結(jié)構(gòu)分析 利用ProtParam 在線軟件(https:/ /web.expasy.org/protparam)分析ItfCLE 蛋白理化性質(zhì)。 利用TMHMM 2.0(https:/ /services.healthtech.dtu.dk/service.php? TMHMM-2.0)分析基因的跨膜螺旋位點(diǎn)，利用Soft-Berry ProtComp 9.0 預(yù)測(cè)蛋白亞細(xì)胞定位情況。利用MEME (http:/ /meme-suite.org/tools/meme)分析ItfCLE 氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域，參數(shù)設(shè)置為允許保守結(jié)構(gòu)域重復(fù)出現(xiàn)、搜索得到的保守域上限為6 個(gè)、基序長(zhǎng)度為10 ～100。 利用TBtools工具繪制ItfCLE基因結(jié)構(gòu)圖。

1.2.3 ItfCLE 家族的系統(tǒng)發(fā)育分析 采用MEGA 5.0 軟件的NJ 法，基于保守CLE motif 氨基酸序列，構(gòu)建ItfCLEs 和擬南芥AtCLEs 的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，Bootstrap 重復(fù)1000 次。

1.2.4ItfCLEs基因的組織特異性表達(dá)和不同逆境下的表達(dá)譜分析 利用甘薯基因組學(xué)資源網(wǎng)站中的RNA-seq 基因表達(dá)數(shù)據(jù)，用FPKM(fragments per kilobase per million mapped reads)值表示基因相對(duì)表達(dá)水平，利用TBtools 建立熱圖，進(jìn)行不同基因間聚類。

1.3 IbCLE12 基因的克隆及表達(dá)分析

1.3.1IbCLE12基因的克隆 利用TRIzol 試劑盒(Invitrogen，上海，中國(guó))提取總RNA，利用TaKa-Ra 反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)對(duì)樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得濟(jì)薯25 的cDNA，利用TaKaRaLA Taq試劑盒擴(kuò)增IbCLE12基因的完整CDS 序列。 擴(kuò)增引物為IbCLE12-F(5＇-ATGGGTAGTAATTTGAGGAGTAGGA-3＇)和IbCLE12-R(5＇-TCATGGCTTGTCAAGCTCTCC-3＇)。 擴(kuò)增體系(50 μL):LA Taq0.5 μL，LA Buffer(Mg2+plus)8 μL，dNTP Mixture 5 μL，引物混合物2 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 32.5 μL。 擴(kuò)增程序:94℃3 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，34 個(gè)循環(huán)；72℃10 min。

1.3.2 干旱脅迫和ABA 處理下IbCLE12基因的表達(dá)分析 用2021 年收獲的濟(jì)薯25 薯塊，在溫室中培養(yǎng)4 周，取長(zhǎng)勢(shì)一致、含5～6 個(gè)功能葉的莖段，分別用含20% PEG6000 和100 mmol/L ABA 的1/2 霍格蘭溶液處理，分別于處理0、3、6、12、24、48 h取葉片，用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

利用Invitrogen TRIzol 試劑盒提取總RNA，利用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用SYBR PremixEx TaqⅡ定量試劑(Tli RNaseH Plus， TaKaRa， 大連， 中國(guó)) 在Roche LightCycler?480Ⅱ(Roche，英國(guó))進(jìn)行qRT-PCR分析。 擴(kuò)增引物為ItfCLE-qPCR-F(5＇-TATTGGTGGGAGTGGTTGGGT-3＇)和ItfCLE-qPCR-R(5＇-CATGCTCATATGCCTCATGCT-3＇)。 擴(kuò)增體系:SYBR Green Master Mix 5 μL，引物混合物0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.6 μL。 反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性2 min；95℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸15 s，40 個(gè)循環(huán)。

使用內(nèi)參基因IbActin為校準(zhǔn)，利用2-ΔΔCt計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。 每個(gè)樣品進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)，以未處理(0 h) 的樣品為對(duì)照，采用Student’st-test 方法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ItfCLE 基因的篩選和蛋白特征分析

從I.trifida中篩選到12 個(gè)CLE 家族基因，根據(jù)其在染色體上的位置進(jìn)行重新編號(hào)，分別命名為ItfCLE1～I(xiàn)tfCLE12(表1)。 這12 個(gè)ItfCLE 蛋白長(zhǎng)度在81 ～154 個(gè)氨基酸之間，分子量在9.0 ～17.5 kDa 之間，等電點(diǎn)均大于7，屬于堿性蛋白。只有ItfCLE2 和ItfCLE6 為穩(wěn)定蛋白，其余均為不穩(wěn)定蛋白，且ItfCLE3 不穩(wěn)定系數(shù)最高。 除分子量最大的ItfCLE5 為疏水脂溶蛋白外，其余均為親水性脂溶蛋白。 根據(jù)保守區(qū)的首個(gè)氨基酸類型分類，只有ItfCLE6 屬于H 型，其余均為R 型。

表1 ItfCLEs 蛋白理化性質(zhì)

利用MEME 軟件分析ItfCLE 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，共獲得6 個(gè)保守基序，分別命名為Motif1 ～Motif6。 12 個(gè) ItfCLE 成員均含有 Motif1(VSKRKVPSGPBPJHN)，所以，Motif1 是甘薯CLE的特征保守基序(圖1)。

圖1 ItfCLE 蛋白保守基序分析

根據(jù)蛋白定位預(yù)測(cè)結(jié)果(表2)，12 個(gè)ItfCLE蛋白在胞外都有分布；僅ItfCLE9 在質(zhì)膜中有分布，其余蛋白則在細(xì)胞質(zhì)、過(guò)氧化物酶體以及葉綠體中有分布。 據(jù)此推測(cè)ItfCLE 蛋白可能主要存在于過(guò)氧化物酶體、葉綠體以及細(xì)胞質(zhì)中，外排到胞外。

表2 ItfCLE 蛋白的定位分析

2.2 ItfCLEs 的進(jìn)化分析

通過(guò)ItfCLEs 與AtCLEs 的進(jìn)化關(guān)系樹(圖2)可知，甘薯的ItfCLEs 主要分為5 個(gè)亞族。 Itf-CLE1、 ItfCLE4、 ItfCLE6、 ItfCLE8、 ItfCLE11、 Itf-CLE12 親緣關(guān)系較近，其中，ItfCLE1、ItfCLE8、Itf-CLE4 與擬南芥的AtCLE45 屬于同一組，ItfCLE12與AtCLE25 屬于同一組，ItfCLE6 與AtCLE46 屬于同一組；ItfCLE10 與AtCLE27 親緣關(guān)系較近；ItfCLE3 和ItfCLE2 屬于同一亞族，并與AtCLE20 親緣關(guān)系較近；ItfCLE7 與AtCLE9、AtCLE10 親緣關(guān)系較近；ItfCLE5 和ItfCLE9 屬于同一亞族，分別與AtCLE13 和AtCLE8 親緣關(guān)系較近。

圖2 甘薯12 個(gè)ItfCLEs 和擬南芥32 個(gè)AtCLEs 進(jìn)化樹分析

2.3 ItfCLE 基因的組織特異性表達(dá)分析

結(jié)果(圖3)表明，ItfCLE9、ItfCLE10在花中有較高的表達(dá)；ItfCLE4、ItfCLE12在根中有較高的表達(dá)；ItfCLE1、ItfCLE3、ItfCLE5、ItfCLE7、ItfCLE11在各組織中表達(dá)量較低，差異較??；ItfCLE2、ItfCLE6和ItfCLE8在莖中表達(dá)較高。

圖3 甘薯12 個(gè)ItfCLE 基因的組織特異性表達(dá)分析

2.4 ItfCLE 基因在不同逆境脅迫下的表達(dá)特征分析

結(jié)果(圖4)表明，與對(duì)照相比，ItfCLE10受旱、鹽脅迫和兩種病害處理后下調(diào)表達(dá)；ItfCLE8受旱、鹽脅迫后上調(diào)表達(dá)，受冷和熱脅迫后下調(diào)表達(dá)；ItfCLE12受旱脅迫和病2 處理后上調(diào)表達(dá)，受鹽、冷和病1 脅迫后下調(diào)表達(dá)；ItfCLE3受鹽、冷、熱脅迫后下調(diào)表達(dá)。 其余基因受脅迫后表達(dá)量變化較小。

圖4 甘薯12 個(gè)ItfCLE 基因的表達(dá)譜分析

2.5 IbCLE12 基因的克隆和氨基酸序列比對(duì)

利用同源克隆方法在濟(jì)薯25 中克隆得到Itf-CLE12的同源基因，命名為IbCLE12。 氨基酸序列比對(duì)結(jié)果(圖5)表明，IbCLE12 與ItfCLE12 一致性較高，僅在第23、26 位有兩個(gè)氨基酸的差異；IbCLE12與AtCLE25的一致性達(dá)到32.74%，兩者C 端保守CLE 基序一致。

圖5 IbCLE12 與ItfCLE12、AtCLE25 的序列比對(duì)

2.6 IbCLE12 基因受干旱和ABA 誘導(dǎo)表達(dá)分析

結(jié)果(圖6)表明，IbCLE12基因受干旱和ABA 誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，分別在處理6 h(5.48 倍)和12 h(5.06 倍)表達(dá)量最高。 處理時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)量顯著降低。

圖6 干旱(A)和ABA(B)脅迫下IbCLE12 基因的表達(dá)情況

3 討論與結(jié)論

CLE 家族基因編碼的多肽是21 世紀(jì)以來(lái)發(fā)現(xiàn)的新型多肽激素，在細(xì)胞間的信號(hào)交流中發(fā)揮重要作用[3，5，14]。 CLE 蛋白信號(hào)肽使蛋白遷移至細(xì)胞膜，并與膜上的受體激酶特異性結(jié)合，將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至下游分生組織發(fā)育的WUSCHEL(WUS)轉(zhuǎn)錄因子，形成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模塊，從而調(diào)控分生組織的干細(xì)胞增殖和分化，最終影響根、莖等器官的分化[15]。 甘薯野生種I.trifida中包含12 個(gè)CLE 家族基因，蛋白C 端均包含CLE 保守結(jié)構(gòu)域，家族基因數(shù)量少于擬南芥等模式植物，可能與數(shù)據(jù)庫(kù)組裝過(guò)程中小分子基因的覆蓋度相關(guān)[16]。 甘薯作為塊根作物，根中分生組織的干細(xì)胞分化和增殖直接影響形成層的發(fā)育，并最終與產(chǎn)量密切相關(guān)。 有研究表明，通過(guò)對(duì)人參CLE 家族序列特征和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PgCLE基因?qū)ζ涓桶l(fā)育起重要的調(diào)控作用[17]。 本研究結(jié)果表明，ItfCLE在野生型甘薯中存在明顯的組織表達(dá)差異性，其中，ItfCLE9、ItfCLE10在花中有較高的表達(dá)；ItfCLE4、ItfCLE12在根中有較高的表達(dá)；Itf-CLE2、ItfCLE6和ItfCLE8在莖中表達(dá)較高；Itf-CLE1、ItfCLE3、ItfCLE5、ItfCLE7、ItfCLE11在各組織中表達(dá)量較低，差異較小。 可見，甘薯中CLE成員在不同器官發(fā)育過(guò)程中可能發(fā)揮不同的調(diào)控作用。

CLE 家族基因在作物響應(yīng)生物脅迫中也具有重要調(diào)節(jié)作用。 研究表明，在大豆囊線蟲、馬鈴薯囊線蟲和根結(jié)線蟲中具有和宿主類似的CLE，并通過(guò)與宿主中的CLE 受體相互作用，提高線蟲對(duì)宿主的侵染力[18，19]。 敲除CLE 受體可以顯著提高大豆對(duì)大豆囊線蟲的抵抗能力[20]。 本研究結(jié)果表明，與對(duì)照相比，在兩種病害脅迫下大部分ItfCLEs表達(dá)量變化不大，但I(xiàn)tfCLE7、ItfCLE10明顯下調(diào)表達(dá)，ItfCLE12在病1 處理下也表達(dá)下調(diào)，推測(cè)其在生物脅迫中主要起負(fù)調(diào)控作用。

CLE 家族基因在作物抵御非生物脅迫中也發(fā)揮重要作用。 研究表明，擬南芥的AtCLE25 多肽可以實(shí)現(xiàn)從根到芽的長(zhǎng)距離信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并通過(guò)介導(dǎo)ABA 信號(hào)途徑促進(jìn)氣孔關(guān)閉，感應(yīng)根的缺水信號(hào)，提高植物的抗旱性[9]；AtCLE45通過(guò)下游受體SKM1 和SKM2 調(diào)節(jié)擬南芥種子形成過(guò)程中的耐熱性[21]。 在擬南芥缺失突變體cle40-2中，ABA合成通路上的AtCLE25、AtCLE45基因表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明其在ABA 合成通路上起關(guān)鍵的正調(diào)控功能[22]。 在本研究中，受旱脅迫后明顯上調(diào)表達(dá)的有ItfCLE8和ItfCLE12，而ItfCLE12 與擬南芥At-CLE25 親緣關(guān)系較近，推測(cè)ItfCLE12在甘薯抗旱性中發(fā)揮調(diào)控作用。 為此，我們?cè)诟适碓耘嗥贩N中克隆了ItfCLE12的同源基因IbCLE12，并進(jìn)行模擬干旱和ABA 處理，結(jié)果表明該基因分別在處理6 h 和12 h 受干旱和ABA 誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)，可為深入研究IbCLE12在甘薯抗旱性中的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。