桑茜劉冰艷張雪嬌歐陽全喜諶馥佳陳建光

(1.安陽工學(xué)院，河南 安陽 455000；2.黃淮學(xué)院，河南 駐馬店 463000)

世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)監(jiān)測報告顯示，由于缺乏科學(xué)引導(dǎo)，抗生素濫用導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性增加已成為全球日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[1，2]。大腸桿菌是一種分布廣泛的條件致病菌，極易產(chǎn)生耐藥性?？股鼗蚩咕幬锏拇罅渴褂么龠M(jìn)了畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，造成大腸桿菌耐藥菌株數(shù)量不斷增加、耐藥性不斷增強(qiáng)，加劇了大腸桿菌病的防治難度[3]。針對抗生素過度使用，通過益生菌調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡已成為遏制大腸桿菌耐藥性增強(qiáng)的一項(xiàng)重要行動計劃。

常見的益生菌包括芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌等。芽孢桿菌廣泛存在自然界中，宋兆齊等[4]通過菌株形態(tài)和生理生化的鑒定試驗(yàn)，對整個河南省范圍內(nèi)農(nóng)田土壤環(huán)境中的芽孢桿菌多樣性進(jìn)行了調(diào)查，調(diào)查結(jié)果從分子水平證明，河南省的芽孢桿菌資源非常豐富。芽孢桿菌是一類重要的微生態(tài)制劑和益生菌添加劑。田照輝等[5]從池塘邊發(fā)酵魚肉湯中分離出6株芽孢桿菌，對其產(chǎn)淀粉酶、產(chǎn)蛋白酶能力及生長情況進(jìn)行研究，為篩選適合漁用微生態(tài)制劑的益生菌提供了新的思路。張同建[6]從健康的雞仔糞便種分離出9株芽孢桿菌，通過耐酸性試驗(yàn)、耐膽汁試驗(yàn)以及動物飼喂試驗(yàn)，為研究芽孢桿菌菌株及開發(fā)成益生菌制劑提供一定的理論指導(dǎo)。張榮嶺[7]認(rèn)為，芽孢桿菌具有拮抗病原菌、調(diào)節(jié)腸道菌群、提升機(jī)體免疫力、改善生產(chǎn)性能等作用。尹楊燕等[8]研究表明，枯草芽孢桿菌GX20200511-1對沙門菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有良好的抑菌效果，可以顯著降低共培養(yǎng)24h后的指示菌數(shù)量。崔亞微[9]研究證明，從土壤中分離鑒定的貝萊斯芽孢桿菌具有良好的耐酸、耐膽鹽及抗大腸桿菌作用，為其在動物養(yǎng)殖和飼料防霉中的應(yīng)用提供堅實(shí)的理論依據(jù)。

目前國內(nèi)外報道中，益生菌主要分離自動物腸道和非腸道(如植物和相關(guān)作物食品等)[10]，而分離自土壤中的芽孢桿菌則多應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生物防治領(lǐng)域。崔曉等[11]報道利用芽孢桿菌開發(fā)的生防菌劑和生物制劑被廣泛應(yīng)用。邱月[12]研究表明，枯草芽孢桿菌可以有效促進(jìn)植物病蟲害的防治、促進(jìn)植物營養(yǎng)吸收、提升作物產(chǎn)量品質(zhì)和改良土壤品質(zhì)。為了研究分離自土壤中的芽孢桿菌對大腸桿菌的抑制效果，本試驗(yàn)從河南省駐馬店市試驗(yàn)林中采用五點(diǎn)采樣法收集土壤樣品，通過菌株分離純化、大腸桿菌抑菌試驗(yàn)、16S rDNA序列分析鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建獲得具有抑菌效果顯著的2株枯草芽孢桿菌FX5和FX6，為研究土壤芽孢桿菌作為益生菌防治大腸桿菌的潛質(zhì)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)材料

土壤樣品來源于河南省駐馬店市黃淮學(xué)院試驗(yàn)林。大腸桿菌(Escherichia coli)由安陽工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要儀器

高溫高壓蒸汽滅菌鍋(LDZLDZM-40KCKCS)，購于上海中安醫(yī)療器械廠；超凈工作臺(SW-CJ-2D型)，購于上海樹立儀器儀表有限公司；恒溫培養(yǎng)箱(SHP型)，購于北京中興偉業(yè)儀器有限公司；恒溫震蕩培養(yǎng)箱，購于江蘇科析儀器有限公司；離心機(jī)(Centrifuge 5230R)，購于德國艾本德公司。

2 方法

2.1 樣品的采集

采用五點(diǎn)取樣法從試驗(yàn)林采集點(diǎn)采集5～10cm深的土壤。準(zhǔn)備無菌紙袋，無菌紙袋中放入采集得到的土壤樣品，標(biāo)記采集地點(diǎn)、時間、植被類型，將其放于陰涼通風(fēng)處陰干，經(jīng)研缽研碎備用。

2.2 菌株的分離和純化

采用李靜泉等[13]試驗(yàn)方法，通過稀釋平板涂布法從土壤樣品中分離純化菌種。制備土壤懸浮液，向150mL無菌三角瓶中加入90mL滅菌生理鹽水，稱取10g土壤樣品加入三角瓶中，制成土壤懸浮液；制備濃度梯度懸浮液，用移液器吸取1mL土壤懸浮液于無菌試管中，加入9mL無菌水，混勻后從中吸取1mL加入第2個無菌試管中并加入9mL無菌水，以此類推制成10-3、10-4、10-53個濃度梯度的土壤菌懸浮液，每個濃度梯度重復(fù)3次；分離純化菌株，分別吸取不同稀釋度的土壤懸浮液200μL均勻涂布于LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基上，重復(fù)3次，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h，挑選菌落進(jìn)行多次劃線純化得到純種菌株，將純種菌株轉(zhuǎn)入LB斜面培養(yǎng)基4℃保存。

2.3 牛津杯法抑制大腸桿菌試驗(yàn)

挑取純化后的菌種，進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對菌液進(jìn)行蒸餾，獲得純度較高的單菌落菌懸液。根據(jù)張同建[6]試驗(yàn)方法將10mL大腸桿菌菌懸液與45℃的LB培養(yǎng)基在無菌培養(yǎng)皿中混勻；用滅菌后的打孔器在冷卻后的培養(yǎng)基上進(jìn)行打孔(孔的直徑為0.6cm)；取100μL分離獲得的單菌落菌懸液置于每個孔中；將含有單菌落菌懸液的培養(yǎng)基放入恒溫培養(yǎng)箱中36.5℃恒溫培養(yǎng)12h，觀察記錄抑菌圈的大小。

2.4 16S rDNA序列分析鑒定

參考SK8255(細(xì)菌)Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司)對大腸桿菌拮抗菌株進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA的提取。參考李肖鶴等[14]方法，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物Primer A(5＇-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3＇)和Primer B(5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇)為上下游引物對菌株的16 SrDNA進(jìn)行基因擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測后，切膠回收，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序；獲得序列后上傳到GenBank中進(jìn)行BLAST 序列分析比對；運(yùn)用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[15]；參考菌株的菌落形態(tài)，綜合確定該菌株的親緣關(guān)系和種屬地位。

3 結(jié)果分析

3.1 菌株的分離和純化

經(jīng)過初篩、復(fù)篩，在分離培養(yǎng)基上分離得到7株遺傳性狀穩(wěn)定的土壤菌株，將其編號為FX1～7，各菌株的菌落形態(tài)特征見表1。

表1 菌落形態(tài)特征

3.2 牛津杯法抑制大腸桿菌試驗(yàn)結(jié)果

參考張同建[6]方法對初步篩選得到的7株菌株進(jìn)行大腸桿菌的抑菌性試驗(yàn)，抑菌結(jié)果分析表明：依據(jù)抑菌圈直徑大小比照與分析，F(xiàn)X7菌株對大腸桿菌無抑制作用，另外6株目的菌株對大腸桿菌抑菌效果依次為FX5>FX6>FX3>FX2>FX1>FX4。FX1菌株和FX4菌株抑菌圈直徑分別為1.8mm和0.8mm，抑菌效果較弱；FX2菌株和FX3菌株抑菌圈直徑分別為10.2mm和11.6mm，抑菌效果一般；FX5菌株和FX6菌株抑菌圈直徑分別為20.9mm和18.1mm，菌株抑菌效果明顯，拮抗作用顯著。其中FX5菌株的抑菌圈直徑最大，抑菌能力最顯著，為后續(xù)挑選具有優(yōu)良抑制大腸桿菌效果的微生物制劑提供一定的依據(jù)。

3.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

從圖1可以看出，菌株FX1～6提取的DNA堿基對在1200～2000bp。

圖1 FX1～6的DNA凝膠電泳分析

將對大腸桿菌具有拮抗效果的6株菌株的16S rDNA基因測序交由上海生工生物工程有限公司完成。測序結(jié)果與NBCI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對分析，并使用MEGA軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2，鑒定結(jié)果顯示FX1菌株與Amycolatopsis japonica strain MG 417-CF 17親緣性強(qiáng)，歸為擬無枝菌屬；FX3菌株與Streptomyces sp.strain 2H-HV12親緣性強(qiáng)，歸為鏈霉菌屬；FX4菌株與Bacillus paramycoides strain Mu3 AM親緣性強(qiáng)，歸為芽孢桿菌屬。FX2、FX5和FX6菌株與Bacillus sp.(in：Bacteria)strain親緣關(guān)系最近，結(jié)合其菌落培養(yǎng)特征初步確定菌株FX2、FX5和FX6歸為枯草芽孢桿菌，針對抑制大腸桿菌效果最優(yōu)的拮抗菌株FX5和FX6后續(xù)應(yīng)補(bǔ)充菌株的生理生化特性等試驗(yàn)進(jìn)行下一步研究。

圖2 FX1～6菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

4 討論與分析

芽孢桿菌數(shù)量龐大、種類繁多，廣泛應(yīng)用于飼料加工、醫(yī)藥業(yè)、農(nóng)業(yè)、工業(yè)等諸多行業(yè)，具有極強(qiáng)的適應(yīng)能力、廣譜的生防潛力[16]和多方面的益生性能[17]。Bacon等[18]研究發(fā)現(xiàn)，玉米內(nèi)生芽孢桿菌和玉米病原菌(串珠鐮孢菌)競爭玉米相同的生態(tài)位點(diǎn)可以降低病原菌的致病性。蔣廣志等[19]、趙榮等[20]等研究表明，在動物飼料中添加芽孢桿菌益生菌活菌制劑，使益生菌成為動物腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌群，能夠有效控制和預(yù)防動物疾病。榮艷君等[21]等發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌R3分泌的surfactin類抗菌脂肽通過改變細(xì)胞膜通透性能夠破壞細(xì)胞膜、裂解細(xì)胞，抑制產(chǎn)生多重耐藥性的大腸桿菌。本研究從自然土壤中篩選出6株大腸桿菌拮抗菌株，根據(jù)菌株生物學(xué)形態(tài)觀察與分子生物學(xué)鑒定分析，最終得到對大腸桿菌拮抗效果顯著的FX5和FX6菌株，與崔亞微[9]、楊熾光[16]研究結(jié)果一致，說明分離自自然土壤中的芽孢桿菌對大腸桿菌具有較好的抑制作用，為土壤益生菌的開發(fā)利用提供一些理論依據(jù)。

張榮嶺[7]報道枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是重要的工業(yè)菌株，也是飼料添加劑品種目錄中可直接飼喂動物的微生物添加劑菌種；目前以枯草芽孢桿菌及細(xì)菌素為主要成分的微生態(tài)制劑作為飼用抗生素替代品被廣泛使用。本試驗(yàn)對大腸桿菌拮抗菌株進(jìn)行BLAST比對分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，結(jié)合其菌落培養(yǎng)特征，初步認(rèn)為拮抗效果顯著的FX5和FX6菌株歸為枯草芽孢桿菌，后續(xù)應(yīng)補(bǔ)充其生理生化特性的試驗(yàn)和對其他有害細(xì)菌如沙門氏菌、金黃色葡萄球菌拮抗效果的研究。本試驗(yàn)為不斷豐富和開發(fā)利用具有優(yōu)良大腸桿菌拮抗效果的土壤微生物資源提供了一定的理論依據(jù)和技術(shù)支持，可以考慮將FX5和FX6菌株嘗試運(yùn)用于動物飼料添加劑中[22]，對其益生特性和益生作用機(jī)理做深入研究，為其合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。