譚金曲，周 君，孫光華，劉丹妮，黃夏榮，羅 敷，周桂娟，屈萌艱，彭 婷，曾亞華

（南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，湖南 衡陽 421001）

急性肺損傷（acute lung injury,ALⅠ）是各種原因?qū)е碌囊缘脱跹Y為特征，最終導(dǎo)致呼吸衰竭的臨床病癥[1]。ALⅠ的病理核心是炎癥反應(yīng)，PⅠNK1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，與自噬、凋亡、氧化應(yīng)激、釋放突觸遞質(zhì)和線粒體鈣離子穩(wěn)態(tài)等有密切聯(lián)系，Parkin 是PⅠNK1 的 下游 蛋白[2]。研 究發(fā) 現(xiàn)PⅠNK1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬參與ALⅠ炎癥反應(yīng)[3]。調(diào)控PⅠNK1/Parkin 表達(dá)，促進(jìn)線粒體自噬，可以抑制炎癥反應(yīng)、細(xì)胞焦亡，起到保護(hù)肺組織的作用，可作為治療靶點(diǎn)。電針對(duì)ALⅠ有確切的治療作用，能明顯緩解ALⅠ炎癥反應(yīng)、減輕肺水腫[4]，但電針治療急性肺損傷的機(jī)制尚未完全闡明。本次研究通過觀察經(jīng)電針預(yù)處理后ALⅠ大鼠血清中白細(xì)胞介素-6（interleukin-6, ⅠL-6）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）等炎癥因子水平及肺組織中PⅠNK1、parkin 蛋白表達(dá)的變化，探討電針對(duì)ALⅠ的療效及機(jī)制，為電針防治ALⅠ提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物24 只3 月齡清潔級(jí)雄性大鼠，體質(zhì)量（327.0±10.7）g，購買自湖南省斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)為SYXK（湘）2020-0002。飼養(yǎng)于南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，盒籠備有墊料、飼料和飲水，將室溫調(diào)至20-26 ℃，將濕度調(diào)至50-60%，模擬正常晝夜更替。常規(guī)飼養(yǎng)1 周后開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)所需操作均符合我國(guó)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》及我院倫理委員會(huì)（ 批準(zhǔn)號(hào)：202012100289）的相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑與儀器 試劑：常規(guī)化學(xué)試劑、Tween-20、APS：中國(guó)上海國(guó)藥（貨號(hào)：71033942、10002618、30189328）；Tris、甘 氨 酸：美 國(guó)Sigma（貨 號(hào)：Ⅴ900483、Ⅴ900144）；蛋白酶抑制劑、蛋白磷酸酶抑制劑：上海愛必信生物科技有限公司（貨號(hào)：583794、P1260）；顯影液、定影液：中國(guó)上海佳信（BW-61、BW-62）；LPS：北京百奧萊博科技有限公司（貨號(hào)：BK-001）。儀器：臺(tái)式冷凍離心機(jī)：濟(jì)南童鑫生物科技有限公司（貨號(hào)：H1650R）；電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀：中國(guó)北京六一（貨號(hào)：DYY-6C、DYCZ-24DN、DYCZ-40D）；電子天平：美國(guó)雙杰（貨號(hào)：JJ224BC）；普通冰箱：中國(guó)奧克斯（貨號(hào)：BCD-196A）；PCR 儀、熒光PCR 板：湖南中美儀器有限公司（貨號(hào)：HD4925、GL-88B）。

1.3 分組及造模24 只大鼠參照隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分組，分別為空白對(duì)照組、ALⅠ組和電針預(yù)處理組，每組8 只。ALⅠ造模參照脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）尾靜脈注射方法[5-6]，具體操作：選取大鼠尾靜脈1/3 處進(jìn)行碘酒消毒，擴(kuò)張局部血管，1 ml 注射器抽取溶解好的LPS 溶液（劑量5 mg/kg，濃度5 mg/ml），斜45°進(jìn)針后平行進(jìn)針，回抽見靜脈血后注入LPS。

1.4 電針預(yù)處理操作 電針預(yù)處理組于大鼠造模前進(jìn)行電針預(yù)處理。具體操作：選取雙側(cè)“尺澤”、“足三里”穴，參照中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究制定的《動(dòng)物針灸穴位圖譜》進(jìn)行定位，“尺澤穴”在大鼠肘彎?rùn)M紋偏外的凹陷中，“足三里”穴在膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下約3mm 處。采用長(zhǎng)度40 mm、直徑0.25 mm 的華佗牌一次性無菌針灸針刺入，進(jìn)針后，針柄接電針，波形為疏密波，疏波頻率3 Hz，密波頻率15 Hz；強(qiáng)度以局部肌肉輕微收縮為度（約1.0 mA）。每次30 min，每天1次，共預(yù)處理5天。

1.5 實(shí)驗(yàn)過程 各組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后開始正式實(shí)驗(yàn)。電針預(yù)處理組進(jìn)行電針預(yù)處理5 天，空白對(duì)照組和ALⅠ組常規(guī)飼養(yǎng)5 天。5 天后電針預(yù)處理組和ALⅠ組開始造模，空白對(duì)照組不造模。造模6 h后，三組大鼠進(jìn)行麻醉取材。

1.6 實(shí)驗(yàn)取材

1.6.1 血清10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠，眼眶采血約1 mL，放入離心機(jī)，以轉(zhuǎn)速3000 r/min 離心30 min，使用移液槍取上清液至凍存管，并保存于-80 ℃冰箱，用于ELⅠSA檢測(cè)。

1.6.2 肺組織 大鼠取血后處死，并將其仰臥于鼠板上，胸前及上腹部剪毛備皮，局部皮膚碘酒消毒，用剪刀逐層剪開胸腔取出肺組織，取1/2 左下肺組織進(jìn)行HE 染色；1/2 右下肺組織放入凍存管，并保存于液氮罐中，用于熒光定量PCR和WB檢測(cè)。

1.7 標(biāo)本檢測(cè)

1.7.1 HE 染色及病理評(píng)分 將大鼠左上肺組織進(jìn)行包埋、切片，脫蠟、復(fù)水；滴加蘇木精染色液染色，清洗后返藍(lán)，再?zèng)_洗，取伊紅試劑染色，晾干固定好，光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)變化后，根據(jù)以下肺組織病理變化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[7]：①肺泡充血；②出血；③肺泡腔或血管壁中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)或聚集；④肺泡壁增厚和（或）透明膜形成。分別依病變輕重評(píng)為0-4分：0分指無病變或非常輕微病變；1分為輕度病變；2 分為中度病變；3 分為重度病變；4分為極重度病變。

1.7.2 血清ⅠL-6 和TGF-β1 含量檢測(cè) 采用ELⅠSA 檢測(cè)方法，嚴(yán)格按照試劑說明書操作，檢測(cè)血清ⅠL-6和TGF-β1水平。

1.7.3 PⅠNK1、parkin 的mRNA 表達(dá) 采用熒光定量PCR 檢測(cè)PⅠNK1、parkin 的mRNA 表達(dá)。具體操作：提前準(zhǔn)備好RNA 提取所需器械和試劑后。Trizol 提取組織總RNA，然后RNA 反轉(zhuǎn)錄以組織總mRNA 為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于PCR 反應(yīng)和熒光定量PCR 反應(yīng)。以cDNA 為模板加入靶基因上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，β-actin 為內(nèi)參，引物序列見表1。實(shí)驗(yàn)之后記錄PCR 儀測(cè)定的Ct值，按2-△△Ct（目的基因的相對(duì)表達(dá)量）方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，分析PⅠNK1、parkin的mRNA表達(dá)情況。引物信息見表1。

表1 引物信息

1.7.4 PⅠNK1、parkin 的蛋白 表達(dá) 采用WB 檢測(cè)PⅠNK1、Parkin 蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)。具體操作：剪取0.025 g組織，經(jīng)PBS清洗、研磨、裂解、離心后，取上清液移入離心管存于液氮罐中；取160 μL 蛋白上清液進(jìn)行WB 檢測(cè)，經(jīng)電泳（電泳恒定電壓75 Ⅴ，時(shí)間為130 min）、轉(zhuǎn)膜（轉(zhuǎn)膜300 mA 恒定電流，Parkin 約72 min，PⅠNK1 約83 min）、封閉、一抗及二抗孵育，孵育后用濾紙吸盡液體，用塑封膜將膜包裹雜交膜，在暗盒內(nèi)與X 膠片曝光1-30 min，最后顯影沖洗。掃描底片，分析細(xì)胞中PⅠNK1、parkin 蛋白表達(dá)含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 符合正態(tài)分布的計(jì)量資料均使用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不符合正態(tài)分布用四分位數(shù)和四分位數(shù)間距表示。應(yīng)用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組間采用單因素方差分析。兩兩比較方差齊時(shí)，事后檢驗(yàn)采用LSD 檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)，則采用Dunnett T3檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)完成情況 實(shí)驗(yàn)過程順利，動(dòng)物無脫失、死亡，取材時(shí)正常組因麻醉過量死亡1 只大鼠，缺少一個(gè)血清標(biāo)本，其余標(biāo)本均送檢，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.2 電針預(yù)處理對(duì)ALⅠ大鼠肺組織病理結(jié)構(gòu)改變的影響 肺組織HE 染色結(jié)果顯示，ALⅠ組大鼠肺組織有明顯的充血及出血表現(xiàn)，部分肺泡結(jié)構(gòu)消失、融合，其內(nèi)滲出明顯，伴大量炎性細(xì)胞聚集，部分肺泡壁顯著增厚。電針預(yù)處理組的肺組織輕度充血，肺泡有部分融合，但大部分結(jié)構(gòu)清晰可見，肺泡腔內(nèi)無透明膜形成，肺泡隔內(nèi)少量炎性細(xì)胞聚集。空白對(duì)照組的肺組織結(jié)構(gòu)正常，無明顯損傷、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖1。肺組織病理評(píng)分結(jié)果顯示，ALⅠ組的肺損傷評(píng)分較空白對(duì)照組增高（P＜0.01）；電針預(yù)處理組較ALⅠ組顯著降低（P＜0.01），見圖2。

圖1 各組大鼠造模6 h后肺組織的病理切片（HE染色×200倍）

圖2 各組大鼠造模6 h后肺組織病理評(píng)分的比較（± s，8只鼠/組）

2.3 電針預(yù)處理對(duì)ALⅠ大鼠血清ⅠL-6 和TGF-β1 含量的影響ALⅠ組血清TGF-β1 表達(dá)較空白對(duì)照組明顯降低（P＜0.01），血清ⅠL-6 較空白對(duì)照組有升高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；電針預(yù)處理組血清TGF-β1較ALⅠ組有上升趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），血清ⅠL-6較ALⅠ組有下降趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠造模6 h后血清ⅠL-6和TGF-β1含量比較（± s，7只鼠/組）

2.4 電針預(yù)處理對(duì)ALⅠ大鼠肺組織中PⅠNK1、parkin mRNA 表達(dá)的影響ALⅠ組PⅠNK1 mRNA 表達(dá)較空白對(duì)照組顯著增高（P＜0.01），parkin mRNA 表達(dá)較空白對(duì)照組明顯增高（P＜0.01）；電針預(yù)處理組PⅠNK1 mRNA 表達(dá)較ALⅠ組降低（P＜0.01），parkin mRNA表達(dá)較ALⅠ組顯著降低（P＜0.01）。見圖4。

圖4 各組大鼠造模6 h后肺組織PⅠNK1、parkin的mRNA表達(dá)水平的比較（± s，8只鼠/組）

2.5 電針預(yù)處理對(duì)ALⅠ大鼠肺組織中PⅠNK1、parkin蛋白表達(dá)的影響ALⅠ組PⅠNK1 蛋白表達(dá)較空白對(duì)照組明顯增高（P＜0.01），parkin 蛋白表達(dá)較空白對(duì)照組明顯增高（P＜0.01）；電針預(yù)處理組PⅠNK1 蛋白表達(dá)較ALⅠ組降低（P＜0.01），parkin蛋白表達(dá)較ALⅠ組有降低趨勢(shì)，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5、圖6。

圖5 各組大鼠造模6 h后肺組織PⅠNK1、parkin蛋白表達(dá)水平的比較（± s，8只鼠/組）（WB蛋白檢測(cè)）

圖6 各組大鼠造模6 h后肺組織PⅠNK1、parkin的蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（± s，8只鼠/組）

3 討論

ALⅠ高發(fā)病率、死亡率，嚴(yán)重威脅病人生命安全，尋找安全有效治療手段有重要意義[8]。目前，臨床上引起ALⅠ最常見的原因?yàn)楦锾m氏陰性細(xì)菌所致的重癥感染[9]，而LPS 作為革蘭陰性菌細(xì)胞壁主要成分之一[10]。LPS 進(jìn)入體內(nèi)，激活免疫反應(yīng)，促炎與抑炎平衡失調(diào)，爆發(fā)炎癥反應(yīng)、肺組織發(fā)生充血水腫[11]，形成內(nèi)毒素性ALⅠ[12]。因此，LPS 誘導(dǎo)的ALⅠ的病理機(jī)制與過度的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[13]。另外，LPS 會(huì)增加膠原沉積、羥脯氨酸以及Ⅰ型膠原含量，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，刺激肺組織TGF-β1 生成[14]，最終形成肺部纖維化及空間重構(gòu)[15]。

電針具備簡(jiǎn)便驗(yàn)廉、安全可靠的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于臨床各類疾病，本次實(shí)驗(yàn)探究電針在ALⅠ的作用及其機(jī)制。研究中電針預(yù)處理組中穴位選擇雙側(cè)“尺澤”“足三里”穴，電針參數(shù)選用：波形為疏密波3/15 Hz；強(qiáng)度以局部肌肉輕微收縮為度(約1.0 mA)。疏密波使肌肉有節(jié)律的收縮，促進(jìn)組織代謝，以消除炎癥水腫[16]。研究顯示，低頻率、輕刺激在肺損傷的應(yīng)用較多，能有效減輕炎癥緩解肺損傷[17-22]。穴位處方中“尺澤穴”善治咳喘、氣逆等肺部病癥，“足三里穴”有扶正、培土生金之功，二穴相配共奏祛邪扶正、標(biāo)本兼治之效。前期研究[23]發(fā)現(xiàn)電針預(yù)處理可以減輕ALⅠ大鼠的炎癥反應(yīng)。同樣，本次研究結(jié)果中也顯示，經(jīng)LPS 復(fù)制的ALⅠ大鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞，炎癥水腫明顯，電針預(yù)處理可有效預(yù)防損傷，減輕造模后炎癥反應(yīng)。

近年來研究發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞因子參與肺損傷形成，它們相互協(xié)調(diào)、相互拮抗。在眾多促炎性細(xì)胞因子中，ⅠL-6是LPS誘導(dǎo)ALⅠ的重要炎性因子之一，在參與ALⅠ炎癥反應(yīng)的同時(shí)，能作為中間物質(zhì)激活其他炎性因子，誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞損傷，促進(jìn)ALⅠ的發(fā)生、發(fā)展[24]。ALⅠ早期即可見TGF-β1 被激活，激活后的TGF-β1 導(dǎo)致肺泡毛細(xì)血管的通透性增加，誘發(fā)肺水腫及炎癥因子的釋放[25]。而且，TGF-β1 可誘導(dǎo)膠原分子生成過量，沉積在上皮進(jìn)而造成氣道重塑。同時(shí)，TGF-β 還可激活基質(zhì)金屬蛋白酶分解肺組織細(xì)胞外基質(zhì),啟動(dòng)上皮間充質(zhì)化，導(dǎo)致氣道上皮屏障功能受損[26]。因此抑制過度炎癥反應(yīng)，阻止肺上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，能有效的控制疾病的發(fā)展，造成不可逆損傷，降低病死率。研究發(fā)現(xiàn)，LPS 誘導(dǎo)形成ALⅠ過程中，PⅠNK1 以及Parkin蛋白含量明顯上升，細(xì)胞焦亡數(shù)量增加，線粒體自噬能力增強(qiáng)[27]。可以清除受損肺組織細(xì)胞、減輕炎癥反應(yīng)。同時(shí)也有發(fā)現(xiàn)PⅠNK1/Parkin 蛋白不斷增加，會(huì)加重肺部損傷，促進(jìn)肺上皮細(xì)胞壞死凋亡[2,28-29]。本次研究結(jié)果顯示，ALⅠ大鼠血清中ⅠL-6含量增加，血清中TGF-β1 含量降低，經(jīng)電針預(yù)處理的ALⅠ大鼠血清中ⅠL-6 表達(dá)減少、TGF-β1 含量上升。本次結(jié)果中TGF-β1 的表達(dá)與以往研究結(jié)果不一致，可能跟數(shù)據(jù)少有關(guān)，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。ALⅠ組PⅠNK1、Parkin 蛋白表達(dá)明顯上升，說明造模后的大鼠肺組織中自噬蛋白表達(dá)增加，電針預(yù)處理組較ALⅠ組含量減少，同時(shí)血清中炎癥因子（ⅠL-6）表達(dá)下調(diào)，可能是電針預(yù)處理后的ALⅠ大鼠消耗自噬蛋白吞噬炎性細(xì)胞、焦亡細(xì)胞，從而改善炎癥反應(yīng)。

綜上所述，電針預(yù)處理能減輕LPS 誘導(dǎo)的大鼠ALⅠ炎癥反應(yīng)，可能與PⅠNK1/Parkin蛋白表達(dá)有關(guān)，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為電針防治ALⅠ提供依據(jù)，為治未病思想提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)也可將針灸用于急危重癥中。但結(jié)論仍需更多的實(shí)驗(yàn)論證，以及進(jìn)一步研究其相關(guān)通路，以期更加全面的證實(shí)電針在ALⅠ中的防治作用。