吳增玉，張躍川，彭越，吳南，邱貴興，莊乾宇，仉建國(guó)

青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸（adolescent idiopathic scoliosis,AIS）是一種發(fā)生在10～18 歲的病因不明的脊柱三維結(jié)構(gòu)畸形，總體患病率約為0.47%[1-3]。目前雖然對(duì)AIS的臨床治療取得了較大進(jìn)展，但其確切病因仍不清楚。以往的研究表明，遺傳多態(tài)性在AIS的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。最近的全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome wide association study,GWAS）和其他研究已確定幾種易感基因變異，例如GPR126、LBX1、PAX1等[4-6]。RUNX2 是骨和軟骨發(fā)育和分化重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，RNA 和蛋白質(zhì)分析表明，在AIS 松質(zhì)骨中，RUNX2 水平較低[7]。RUNX2 在AIS 患者中的異常表達(dá)和骨密度降低表明其成骨細(xì)胞分化的異常調(diào)節(jié)，推測(cè)RUNX2 可能在AIS 患者骨密度降低的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[8]。因此，本研究將RUNX2作為AIS的候選基因進(jìn)行進(jìn)一步研究。研究表明，RUNX2中的rs1321075 和rs1406846 與后縱韌帶骨化和黃韌帶骨化有關(guān)[9-12]，這與AIS 患者骨化異常存在相似之處，故將其選擇與AIS進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究。

AIS 是一種異質(zhì)性極大的疾病，如果將AIS 患者作為一個(gè)單一的群體進(jìn)行研究，就會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性或者假陰性的結(jié)果，因此本研究采取了分層研究的方法。AIS 主要有King、Lenke、PUMC（協(xié)和）分型3 種分型系統(tǒng)。邱勇等[13]對(duì)3 種分型系統(tǒng)的可信度和可重復(fù)性進(jìn)行比較，證明了PUMC（協(xié)和）分型包括脊柱側(cè)凸在三維平面內(nèi)的畸形特點(diǎn)，分型全面，易于掌握，而且具有很好的可信度和可重復(fù)性，適合脊柱側(cè)凸的三維矯形。PUMC（協(xié)和）分型系統(tǒng)將AIS 分為單彎（Ⅰ）、雙彎（Ⅱ）或三彎（Ⅲ）[4]，它是一種三維分型系統(tǒng)，使用相對(duì)簡(jiǎn)單，并有相應(yīng)的推薦手術(shù)方式。

文獻(xiàn)檢索顯示，在中國(guó)北方漢族人群中，尚無(wú)RUNX2基因多態(tài)性與AIS 的關(guān)聯(lián)分析研究。識(shí)別與RUNX2基因多態(tài)性相關(guān)的AIS特定亞組具有重要意義。本研究假設(shè)RUNX2風(fēng)險(xiǎn)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）可能與AIS PUMC（協(xié)和）分型系統(tǒng)相關(guān)，并對(duì)其相關(guān)性進(jìn)行初步研究。因此，本研究招募了來(lái)自中國(guó)北方漢族人群和相應(yīng)對(duì)照的隊(duì)列進(jìn)行病例對(duì)照研究。對(duì)RUNX2中的SNP進(jìn)行基因分型，隨后基于其PUMC（協(xié)和）分型進(jìn)行表型關(guān)聯(lián)分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

AIS 組患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷為AIS 且Cobb角＞20°的患者；②發(fā)病年齡10～18 歲；③使用Native Place 問(wèn)卷確定的來(lái)自中國(guó)北方漢族人群的患者；④影像資料完整的患者，包括X 線、CT 或脊柱MRI檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：①已知病因?yàn)槔^發(fā)的脊柱側(cè)凸患者，包括先天性脊柱側(cè)凸、神經(jīng)肌肉性脊柱側(cè)凸、繼發(fā)于骨骼發(fā)育不良和結(jié)締組織異常的脊柱側(cè)凸；②非中國(guó)北方漢族人群；③影像資料不完整者；④患有影響骨骼發(fā)育的慢性疾病的患者。

健康對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡10～18 歲；②使用Native Place 問(wèn)卷確定的來(lái)自中國(guó)北方漢族人群；③雙肩高度、彎腰試驗(yàn)、脊柱X 線檢查和家族史均正常。

根據(jù)PUMC（協(xié)和）分型系統(tǒng)，所有患者均由至少兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的脊柱外科醫(yī)師分為三類。所有健康對(duì)照組受試者均由一名以上的脊柱外科醫(yī)師進(jìn)行評(píng)估。

本研究選擇在北京協(xié)和醫(yī)院就診的北方漢族患者。2017年12月至2021年12月，共有來(lái)自中國(guó)北方漢族人群的97 例診斷為AIS 的患者和100 名健康對(duì)照受試者在“系統(tǒng)解析脊柱側(cè)凸及合并癥協(xié)作組”研究中入組。

本研究經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)（審批號(hào)：JS-3403），并從所有參與者或其父母處獲得簽署的知情同意書(shū)。

1.2 樣本收集

AIS 組與健康對(duì)照組均于空腹時(shí)一次性抽取外周靜脈血2 mL 于乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA）抗凝管中，-80℃保存。血樣在24 h 內(nèi)進(jìn)行處理、標(biāo)記、登記、凍存。由專人負(fù)責(zé)將臨床資料、一般情況等數(shù)據(jù)錄入。

1.3 研究方法

采用常規(guī)的酚/氯仿提取法提取基因組DNA，并溶于TE 緩沖液中，獲得的基因組DNA 采用Nano Drop 測(cè)得光密度（optical density,OD）值和濃度，-20℃保存?zhèn)溆?。樣品采用全基因組測(cè)序方法對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)分型，所有測(cè)序工作均由華大基因公司（中國(guó)）完成。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件對(duì)臨床資料和實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行各項(xiàng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，包括樣本的一般統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)、Hardy Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)、等位基因-疾病關(guān)聯(lián)研究、基因型-疾病關(guān)聯(lián)研究和基因型-表型［性別和PUMC（協(xié)和）分型］關(guān)聯(lián)研究。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

AIS 組和健康對(duì)照組在rs1321075 位點(diǎn)的基因型TT 相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003），而兩組的等位基因頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.866）。AIS組rs1406846 等位基因、基因型與健康對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.196，P=0.252）。見(jiàn)表1。

表1 基因分型篩查及位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果（個(gè)數(shù)）

兩位點(diǎn)在AIS 組中的基因型分布與患者的性別無(wú)關(guān)（P=0.366，P=0.774）。rs1321075 位點(diǎn)在AIS 組中的基因型分布與PUMC（協(xié)和）分型相關(guān)（P=0.011），它的基因型G/G+T/G 與PUMCⅢ型相關(guān)。見(jiàn)表2。

表2 AIS患者的基因型-表型關(guān)聯(lián)分析結(jié)果（個(gè)數(shù)）

AIS 組與健康對(duì)照組rs1321075 位點(diǎn)在共顯性、隱性和超顯性遺傳模式下比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表3、4）。兩組rs1406846 位點(diǎn)在各種遺傳模式下比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表5、6）。

表3 rs1321075關(guān)聯(lián)分析（n=197）

表4 rs1321075關(guān)聯(lián)分析（n=197，調(diào)整性別變量后）

表5 rs1406846關(guān)聯(lián)分析（n=197）

表6 rs1406846關(guān)聯(lián)分析（n=197，調(diào)整性別變量后）

3 討論

3.1 研究主要結(jié)果總結(jié)

本研究調(diào)查了中國(guó)北方漢族人群中RUNX2基因中2 個(gè)SNP 位點(diǎn)（rs1321075、rs1406846）與AIS 的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)rs1321075不僅有助于AIS易感性，而且還與不同類型的AIS相關(guān)。

本研究驗(yàn)證了RUNX2基因多態(tài)性可能在AIS 發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用的假設(shè)，這是迄今為止中國(guó)北方漢族人群中最大的散發(fā)性AIS 隊(duì)列。選擇RUNX2基因中的2 個(gè)SNP，次要等位基因頻率大于0.05，被選為關(guān)聯(lián)分析的標(biāo)記。

RUNX2基因的2 個(gè)SNP 都進(jìn)行了基因分型，并且在健康對(duì)照組中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，但AIS 組中則沒(méi)有。這種現(xiàn)象提供了RUNX2基因與AIS之間疾病關(guān)聯(lián)的證據(jù)。

rs1321075 是RUNX2的內(nèi)含子SNP，研究發(fā)現(xiàn)其與中國(guó)漢族人群中的后縱韌帶骨化和黃韌帶骨化相關(guān)[9]。本研究中臨床表型分析發(fā)現(xiàn)，rs1321075 TT 基因型和健康對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003）；該位點(diǎn)在AIS 組中的G/G+T/G 基因型分布經(jīng)分層分析發(fā)現(xiàn)，與PUMCⅢ型相關(guān)（P=0.011），若患者臨床早期基因檢測(cè)結(jié)果為該基因型，則提示有可能會(huì)進(jìn)展為PUMCⅢ型。因此，AIS 患者在基因的多個(gè)環(huán)節(jié)可能存在不同程度的問(wèn)題，這可能進(jìn)一步從理論層面解釋患者疾病雖然有所相同，但卻會(huì)存在不同嚴(yán)重程度的畸形，即遺傳異質(zhì)性。未來(lái)需要更多樣本量的研究來(lái)確定rs1321075與PUMC（協(xié)和）分型其他亞組之間的關(guān)系。

rs1406846 被確定與股骨長(zhǎng)度相關(guān)[12]，位于RUNX2的內(nèi)含子區(qū)域。內(nèi)含子一度被認(rèn)為是無(wú)效片段或垃圾基因，但Parenteau 等[14]通過(guò)對(duì)酵母進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)和遺傳分析發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子通過(guò)對(duì)核糖體蛋白基因的抑制來(lái)促進(jìn)對(duì)饑餓的抵抗，這可能有助于解釋內(nèi)含子在基因中的進(jìn)化保存，因此內(nèi)含子應(yīng)當(dāng)引起重視和研究。RUNX2上多態(tài)性位點(diǎn)rs1406846 可能調(diào)節(jié)后縱韌帶骨化的嚴(yán)重程度[11]。但本研究發(fā)現(xiàn)，AIS 患者的rs1406846 等位基因和基因型與健康對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.2 RUNX2基因的影響及作用

RUNX2位于6p21.1，由10個(gè)外顯子組成，該基因的上述突變和其他突變與顱骨鎖骨發(fā)育不良（cleidocranial dysplasia,CCD）有關(guān)[15-17]。Kamamoto等[18]對(duì)1例臨床上診斷患有CCD的患者進(jìn)行研究，通過(guò)對(duì)RUNX2基因進(jìn)行的突變分析，確定了一個(gè)新的移碼突變，它產(chǎn)生了一個(gè)突變體RUNX2。Otto 等[19]使用lacZ 報(bào)告基因?qū)π∈笈咛UNX2 表達(dá)的分析顯示，在骨化的早期階段之前，RUNX2在骨形成部位強(qiáng)烈表達(dá)。因此，RUNX2基因?qū)Τ晒羌?xì)胞分化和骨形成至關(guān)重要。

3.3 本研究的局限性

本研究屬于回顧性病例對(duì)照研究，可調(diào)查多個(gè)因素與疾病的聯(lián)系，但不可避免存在一些不足之處，即該方法得出的結(jié)果是相關(guān)性，在未來(lái)的研究中，需要結(jié)合細(xì)胞和模式動(dòng)物進(jìn)一步驗(yàn)證其因果關(guān)系。除此之外，本研究主要研究對(duì)象為中國(guó)北方漢族人群，對(duì)于其他種族或國(guó)家仍需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

綜上所述，RUNX2rs1321075 TT 基因型和健康對(duì)照組相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即該位點(diǎn)TT基因型可能會(huì)促進(jìn)AIS的發(fā)生和發(fā)展，基因型G/G+T/G與PUMC Ⅲ型患者的發(fā)病相關(guān)，上述結(jié)果表明RUNX2基因可能有助于中國(guó)北方漢族人群的AIS 易感性，尤其與PUMC Ⅲ型患者的發(fā)病密切相關(guān)。這有助于進(jìn)一步了解AIS的發(fā)生和發(fā)展，相信在未來(lái)不久隨著基因測(cè)序價(jià)格的降低和普及，將為臨床診斷及預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展的可能性或可能的PUMC（協(xié)和）分型提供更多的判斷依據(jù)。

【利益沖突】所有作者均聲明不存在利益沖突