陳 晨,廖佳興,牛亞捷,王 琦

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,北京,100193)

葡萄Vitisvinifera為葡萄科葡萄屬植物,在我國栽種歷史悠久。據(jù)統(tǒng)計,中國已成為全球第二大葡萄種植國[1-2]。安徽省適宜葡萄生長,2016年葡萄種植面積達(dá)2.1萬hm2,年產(chǎn)量48.32萬t,且在不斷增加[3]。貴州省是我國西南葡萄產(chǎn)區(qū)的重要組成部分,2020年葡萄種植面積達(dá)3.39萬hm2,產(chǎn)量約52.7萬t[4]。上海市葡萄種植面積約3 333 hm2[5],廣東省葡萄栽培面積4 000 hm2[6]。隨著我國葡萄種植面積逐年增加,加之侵染性病害對葡萄產(chǎn)業(yè)的直接影響,葡萄病害成為制約我國葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要限制因素之一[7-8]。目前國內(nèi)外報道的葡萄相關(guān)病害多達(dá)40多種,其中真菌性病害30多種,為害嚴(yán)重或較重的病害16種,細(xì)菌性病害2種,病毒性病害5種[8]。葡萄病害主要有炭疽病、霜霉病、灰霉病、潰瘍病、白粉病和酸腐病等,能引起葡萄病害的病原種類多樣,因此,對葡萄產(chǎn)區(qū)的主要病害及病原種類進(jìn)行調(diào)查研究對于病害防治十分必要。有學(xué)者報道,貴州葡萄產(chǎn)區(qū)有葡萄黑斑病、炭疽病、黑痘病、灰霉病、霜霉病和白粉病的發(fā)生[9]。也有報道青霉菌、炭疽病菌和鏈格孢菌在貴州為害葡萄[10]。上海有葡萄霜霉病、白粉病、灰霉病、炭疽病等病害的發(fā)生[5]。廣東有白粉病、潰瘍病、霜霉病、穗軸褐枯病、灰霉病等病害為害葡萄的報道[11]。由于病害發(fā)生種類與為害嚴(yán)重程度與栽培品種及栽培措施關(guān)系較大,為給現(xiàn)階段葡萄生產(chǎn)的病害防治提供依據(jù),很有必要進(jìn)行再調(diào)查。因此,筆者選擇貴州、廣東、安徽、上海的葡萄主產(chǎn)區(qū)進(jìn)行主要病害的聯(lián)合調(diào)查,并就安徽、貴州和廣東省的葡萄主要種植區(qū)進(jìn)行葡萄病原物分離純化和ITS的初步鑒定,為今后4省(市)的葡萄病害綜合防治提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查地點(diǎn)

2021年7—8月在廣東、貴州、安徽省和上海市進(jìn)行葡萄病害調(diào)查,共計調(diào)查66個點(diǎn)位。同年8—9月在廣東、貴州、安徽省進(jìn)行葡萄病樣的采集,以對葡萄病害病原種類進(jìn)行調(diào)查。詳細(xì)的病害樣本信息見表1。

表1 葡萄病害樣本調(diào)查采集信息統(tǒng)計

1.2 試驗方法

1.2.1 病害調(diào)查 采用五點(diǎn)取樣調(diào)查法[12]。在果園對角線中心選取1點(diǎn),圍繞該點(diǎn)為中心等距的四角各選擇1點(diǎn),每點(diǎn)分別選擇20穗葡萄進(jìn)行調(diào)查,共100穗,調(diào)查各病害的發(fā)生情況,并利用公式分別計算其發(fā)病率和病情指數(shù)。果實病害分級標(biāo)準(zhǔn)[13]:0級,整穗健康無發(fā)病;1級,病果面積占整個果穗面積的5%以下;3級,病果面積占整個果穗面積的6%～15%;5級,病果面積占整個果穗面積的16%～25%;7級,病果面積占整個果穗面積的26%～50%;9級,病果面積占整個果穗面積的51%以上。葉部病害同樣參照五點(diǎn)取樣,每點(diǎn)5株,隨機(jī)選擇20片葉,共調(diào)查100片,進(jìn)行各葉部病害發(fā)生情況的調(diào)查,并利用公式分別計算其發(fā)病率及病情指數(shù)。葉部病害分級標(biāo)準(zhǔn):0級:無病斑;1級:病斑面積占整個葉面積的5%以下;3級:病斑面積占整個葉面積的6%～25%;5級:病斑面積占整個葉面積的26%～50%;7級:病斑面積占整個葉面積的51%～75%;9級:病斑面積占整個葉面積的76%以上。

1.2.2 葡萄病株的采集 選取發(fā)病初期的病果(葉、果梗),將其分別裝入50 mL底部加入脫脂棉或吸水紙的離心管中,置于裝有足量冰袋的泡沫箱暫存,并及時進(jìn)行病原菌的分離純化。

1.2.3 病原菌的分離純化 參考組織分離法[14]對病原菌進(jìn)行分離純化。將病果(葉、果梗)在超凈臺中先用無菌水沖洗材料表面2～3次,用2%次氯酸鈉溶液浸泡3 min進(jìn)行表面消毒,再用滅菌后的鑷子夾出放入75%乙醇中浸泡30 s,以無菌水清洗3次并用滅菌濾紙吸干組織材料殘留水分,將消毒后的病樣切取病健交界處部分組織,放至PDA培養(yǎng)基平板中央,在25 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～4 d,挑取菌落邊緣菌絲于新的PDA培養(yǎng)基上,如此重復(fù)直至獲得菌種單一的純培養(yǎng)物。將純化后的菌株轉(zhuǎn)至PDA 斜面4 ℃保存,或取菌餅放入滅菌石蠟油4 ℃封存,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 病原菌的分子鑒定 將分離純化后獲得的病原菌菌絲體利用CTAB 法[15]提取真菌DNA,再利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA質(zhì)量后將其稀釋作為PCR反應(yīng)體系的擴(kuò)增模板。用真菌18s rRNA 通用引物[16]ITSI 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和 ITS4 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系:模板DNA 1 μL、ITS1 0.5 μL、ITS4 0.5 μL,Mix12.5 μL、水10.5 μL。擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃,30 s;56 ℃,30 s;72 ℃,延伸1 min,35個循環(huán);72 ℃,延伸10 min。PCR 產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行純化及測序。獲得測序結(jié)果后在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast比對,將病原菌鑒定到屬水平并進(jìn)行病原種類統(tǒng)計。

1.3 統(tǒng)計分析

采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及制圖,數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 貴州和廣東兩省病害調(diào)查結(jié)果

廣東省葡萄病害包括潰瘍病、霜霉病、炭疽病、白腐病、黑痘病、白粉病、煤污病和灰霉病,其中潰瘍病發(fā)生普遍(見表2)。葡萄潰瘍病在廣州、韶關(guān)、南雄和惠州等市均有發(fā)生,其中在樂昌市、惠州市發(fā)生較多且為害嚴(yán)重;炭疽病在南雄市、惠州市均有發(fā)生,惠東縣“陽光玫瑰”的病果率高達(dá)77%;白粉病在惠州市3個果園有發(fā)生,發(fā)病率分別是97.6%、66.96%和27.02%;黑痘病僅在樂昌市“紫秋”葡萄上發(fā)現(xiàn),病果率為52%;白腐病僅在南雄市發(fā)生,病果率為21.71%;煤污病僅在惠州市“陽光玫瑰”葡萄上發(fā)現(xiàn),病葉率達(dá)65.32%。

表2 廣東省葡萄病害調(diào)查結(jié)果

貴州省有霜霉病、灰霉病、炭疽病的發(fā)生(見表3)。葡萄霜霉病發(fā)生嚴(yán)重,在都勻市、福泉市、貴定縣、貴陽市均有為害,其中在福泉市、貴定縣、息烽縣的發(fā)病率多在90%以上,為害嚴(yán)重;葡萄炭疽病僅為害水晶葡萄,不同葡萄園發(fā)病率存在較大差異,息烽縣的炭疽病發(fā)病率均在70%以上,都勻市炭疽病發(fā)病率僅有11.79%;灰霉病只在息烽縣葡萄園出現(xiàn),在“夏黑”“摩爾多瓦”和“巨峰”葡萄上均有發(fā)生。

表3 貴州省葡萄病害調(diào)查結(jié)果

2.2 安徽和上海兩地葡萄病害調(diào)查結(jié)果

安徽省有葡萄酸腐病、炭疽病、灰霉病、白腐病、黑曲霉病(見表4)。其中安徽省合肥市酸腐病發(fā)生較嚴(yán)重,巢湖市“夏黑”葡萄酸腐病發(fā)病率高達(dá)97.0%。葡萄炭疽病發(fā)病率均在10%以下。葡萄灰霉病僅在安徽省合肥市內(nèi)有發(fā)生,其中巢湖市“巨峰”葡萄灰霉病發(fā)病率高達(dá)63.0%。葡萄白腐病在合肥市、六安市均有發(fā)現(xiàn),且在“摩爾多瓦”“巨峰”“陽光玫瑰”3個葡萄品種上均有為害。葡萄黑曲霉病在六安市、合肥市有發(fā)現(xiàn)。

上海市發(fā)現(xiàn)了葡萄酸腐病、炭疽病和葡萄黑曲霉病(見表5),但由發(fā)病率及病情指數(shù)結(jié)果分析,總體葡萄病害的發(fā)生情況并不嚴(yán)重。奉賢區(qū)內(nèi)“陽光玫瑰”的葡萄酸腐病較嚴(yán)重,發(fā)病率達(dá)48.3%,區(qū)內(nèi)其余品種酸腐病零星發(fā)病,但發(fā)病率均在15%以下,病情指數(shù)也均低至2.0左右;浦東新區(qū)有少量病情發(fā)生;嘉定區(qū)未見酸腐病的發(fā)生。浦東新區(qū)及奉賢區(qū)有葡萄黑曲霉病的發(fā)生,其中,浦東新區(qū)“陽光玫瑰”葡萄發(fā)病率為53.3%;葡萄炭疽病發(fā)生不嚴(yán)重,發(fā)病率低于10%。

表5 上海市葡萄病害調(diào)查結(jié)果

2.3 3省市病原菌的分離鑒定結(jié)果分析

將分離獲得的純培養(yǎng)菌株通過基因組DNA提取以及ITS基因片段擴(kuò)增進(jìn)行初步鑒定,共鑒定了114株真菌(見表6)。廣東省惠州市、廣州市、韶關(guān)市分離的真菌有以下12個屬:Alternariaspp. (鏈格孢屬)、Botryosphaeriaspp. (葡萄座腔菌屬)、Colletotrichumspp. (炭疽菌屬)、Curvulariaspp. (彎孢屬)、Diaporthespp. (間座殼屬)、Fusariumspp. (鐮孢菌屬)、Lasiodiplodiaspp. (毛色二孢屬)、Nigrosporaspp. (黑孢霉屬)、Neofusicoccumspp. (新鐮刀菌屬)、Neopestalotiopsisspp. (新擬盤多毛孢屬)、Phomopsisspp. (擬莖點(diǎn)霉屬)和Rhizomucorspp. (根毛霉屬)。

表6 廣東等3省分離的菌株初步鑒定結(jié)果

貴州省的黔南州、貴陽市分離的真菌有8個屬:Alternariaspp. (鏈格孢屬)、Botrytisspp. (葡萄孢屬)、Colletotrichumspp. (炭疽菌屬)、Didymellaspp. (亞隔孢殼屬)、Diaporthespp. (間座殼屬)、Fusariumspp. (鐮孢菌屬)、Neopestalotiopsisspp. (新擬盤多毛孢屬)和Trichodermaspp. (木霉屬)。

安徽省的合肥市和六安市分離的真菌有Colletotrichumspp. (炭疽菌屬)。

3 討論與結(jié)論

經(jīng)病害調(diào)查發(fā)現(xiàn),廣東、貴州、安徽均有葡萄霜霉病、炭疽病發(fā)生。其中廣東省葡萄主要病害包括潰瘍病、炭疽病、白粉病和白腐病,其中霜霉病發(fā)生最普遍,其次是炭疽病。貴州省葡萄主要病害包括霜霉病、炭疽病和灰霉病,其中葡萄霜霉病普遍發(fā)生,調(diào)查發(fā)現(xiàn),避雨栽培能在一定程度上降低其發(fā)病率;炭疽病菌只為害水晶葡萄,且套袋處理的葡萄炭疽病的發(fā)病率低于不套袋。高永彬在2018年的調(diào)查發(fā)現(xiàn),黔南州水晶葡萄的主要病害包括炭疽病、灰霉病、白粉病、黑痘病和霜霉病[9],本文在水晶葡萄上并沒有發(fā)現(xiàn)灰霉病、白粉病和黑痘病。譚德龍等人在2016—2019年對廣東省的設(shè)施葡萄病害發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查,發(fā)現(xiàn)該省的主要病害是白粉病、霜霉病、穗軸褐枯病、潰瘍病、灰霉病、日灼病、氣灼病、毛氈病[11],而本文僅發(fā)現(xiàn)了白粉病、霜霉病、潰瘍病、炭疽病,推測可能與調(diào)查樣本量有關(guān)。安徽省葡萄病害有酸腐病、炭疽病、灰霉病、白腐病、黑曲霉病,其中酸腐病發(fā)生較嚴(yán)重。套袋可以有效減輕病害的發(fā)生,也有助于減輕葡萄灰霉病的發(fā)生。葡萄酸腐病是由酵母菌、病原細(xì)菌和真菌等微生物引起的復(fù)合侵染,還包括媒介昆蟲的再侵染傳播[18]。上海市葡萄病害的調(diào)查發(fā)現(xiàn)葡萄酸腐病、炭疽病和葡萄黑曲霉病,但病害發(fā)生情況并不嚴(yán)重,這與病害調(diào)查時間有關(guān)。

本研究共計分離純化獲得114株真菌。其中廣東省初步鑒定的葡萄病原菌涉及12個屬,主要有Alternariaspp. (鏈格孢屬)、Botryosphaeriaspp. (葡萄座腔菌屬)、Colletotrichumspp. (炭疽菌屬)等。貴州省分離的病原菌涉及8個屬,主要病原屬有Alternariaspp. (鏈格孢屬)、Botrytisspp. (葡萄孢屬)、Botryosphaeriaspp. (葡萄座腔菌屬)、Colletotrichumspp. (炭疽菌屬)等。安徽省葡萄分離到的有Colletotrichumspp. (炭疽菌屬)。其中,Colletotrichumspp.是葡萄炭疽病的病原菌;Fusariumspp.被報道能夠?qū)е缕咸压麑嵏癄€[19];Alternariaspp.是葡萄穗軸褐枯病的病原菌,主要為害葡萄果穗幼嫩的穗軸組織[20];Neopestalotiopsisspp.能導(dǎo)致葡萄腐爛和枝干病害的發(fā)生[21];Botryosphaeriaspp.主要引起葡萄枝干病害,是葡萄潰瘍病的病原菌[22];Diaporthespp.是引起葡萄蔓枯病的主要病原菌[23];Botrytisspp.是灰霉病的主要病原菌[24];Curvulariaspp.被報道是引起葡萄葉斑病的病原菌[25];Lasiodiplodiaspp.能夠?qū)е缕咸阎Ω刹『Φ陌l(fā)生,是葡萄潰瘍病的病原菌[26]。本研究僅擴(kuò)增了分離物的ITS基因片段,若想進(jìn)一步明確其分類地位,還需要結(jié)合形態(tài)學(xué)以及多基因系統(tǒng)發(fā)育分析等多種手段。此外,本試驗所分離的真菌其致病力有待進(jìn)一步分析。