宋海巖,孫淑霞,李 靖,涂美艷,王玲利,徐子鴻,陳 棟,江國良

(1 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室,成都,610066;2 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,成都,611130)

我國西南地區(qū)李種質(zhì)資源十分豐富[1],近年來大面積推廣的“青脆李[2]”“蜂糖李[3]”“脆紅李[4]”“茵紅李[5]”等新品種多由實生選育或芽變選種而得。通常果樹新品種選育首先需要經(jīng)過精準(zhǔn)鑒定和評價來篩選優(yōu)株,然后對優(yōu)株進行DUS測試[6]。但由于李種質(zhì)資源分子標(biāo)記開發(fā)[7]、基因分型、指紋圖譜構(gòu)建等分子生物學(xué)鑒定方法研究滯后[8],許多育成品種的遺傳背景不清晰[9],容易導(dǎo)致苗木市場混亂,育種者權(quán)益無法得到保障。此外,李育種材料的遺傳背景高度相似,還可能導(dǎo)致雜交育種過程中出現(xiàn)返祖現(xiàn)象。

“玉帶李”是四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所從龍泉驛區(qū)李種質(zhì)資源中選育出的晚熟李新品種(川認(rèn)果2022001),其成熟期晚于“蜂糖李”和“青脆李”,外觀又與“青脆李”相似,市場上常被果農(nóng)和果商稱作“晚熟蜂糖李”或“晚熟青脆李”,這嚴(yán)重影響了“玉帶李”的推廣和保護。本試驗以“玉帶李”等3個四川省主栽青皮李品種葉片DNA為模板,根據(jù)SSR標(biāo)記分型結(jié)果,結(jié)合果實成熟期與外觀特征,探索快速區(qū)分“玉帶李”等3個熟期或外觀相近的青皮李品種的方法,并基于重測序技術(shù)開展SNP和InDel變異檢測及可視化分析,簡析3個李品種的遺傳背景和親緣關(guān)系,以期為李配套授粉品種的選擇和雜交育種親本的組配提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

材料為5～8年生“玉帶李”“青脆李”“蜂糖李”的嫁接樹,均定植于成都市龍泉驛區(qū)柏合鎮(zhèn)(N30°31′44.55″,E104°17′49.46″)。常規(guī)栽培管理措施,無明顯病蟲害。在成都市龍泉驛區(qū),“玉帶李”的成熟期最晚且果實縫合線處水漬狀條帶十分明顯,“蜂糖李”的成熟期最早且果實縫合線凹陷,“青脆李”的成熟期介于“玉帶李”和“蜂糖李”之間,以上物候期和果實性狀的差異可以作為初步鑒定這3個青皮李品種的依據(jù)(見表1和圖1)。

表1 “玉帶李”“青脆李”“蜂糖李”3個李品種在成都市龍泉驛區(qū)栽培的主要差異特征

圖1 “玉帶李”“青脆李”“蜂糖李”3個李品種的果實

1.2 方法

1.2.1 SSR標(biāo)記檢測與基因分型 參照前人對李屬種質(zhì)資源多樣性研究結(jié)果[10-11],設(shè)計77對SSR引物用于3個青皮李品種的基因分型。于2021年8月10日采集無病蟲害葉片于錫箔紙中,隨即置于液氮中,采集完畢后放于-80 ℃超低溫冰箱中保存。使用CTAB法提取DNA,隨后使用NanoDrop one微量紫外可見分光光度計檢測DNA濃度和質(zhì)量,備用。PCR反應(yīng)體系:DNA模板(50 ng/μL)1.0 μL,I-5 PCR Mix(TSINGKE)15 μL,正反向引物(10 μmol/L)1.0 μL,加ddH2O至30 μL。PCR擴增程序:98 ℃預(yù)變性3 min;98 ℃變性10 s,53～59 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,循環(huán)40次;最后72 ℃延伸5 min。使用1%高純度低電滲瓊脂糖凝膠(TSINGKE)電泳對PCR產(chǎn)物進行基因分型。

1.2.2 DNA提取與文庫構(gòu)建 采用CTAB法提取葉片DNA,瓊脂糖凝膠電泳分析DNA降解程度以及是否有RNA污染;隨后使用NanoDrop one微量紫外可見分光光度計檢測DNA純度;使用Qubit 2.0熒光儀對DNA濃度進行精確定量。其中,OD260/OD280值在1.8～2.0之間,含量在80 μg/mL以上的DNA樣品用于建庫。檢驗合格的DNA樣品通過Covaris破碎機隨機打斷成長度為350 bp的片段。采用TruSeq Library Construction Kit進行建庫。DNA片段經(jīng)末端修復(fù)、加ployA尾、加測序接頭、純化、PCR擴增等步驟完成整個文庫制備。構(gòu)建好的文庫通過Illumina HiSeq測序儀進行測序。

1.2.3 文庫質(zhì)量檢測與上機測序 文庫構(gòu)建完成后,先使用Qubit 2.0熒光儀進行初步定量,稀釋文庫至1 ng/μL,隨后使用Agilent 2100生物分析儀對文庫的插入片段大小(insert size)進行檢測,insert size符合預(yù)期后,使用qPCR方法對文庫的有效濃度進行準(zhǔn)確定量(文庫有效濃度>2 nmol/L),以保證文庫質(zhì)量。庫檢合格后,根據(jù)文庫的有效濃度及數(shù)據(jù)產(chǎn)出需求進行 Illumina HiSeq測序。

1.2.4 重測序數(shù)據(jù)分析 對下機得到的原始數(shù)據(jù)(raw data)進行過濾,得到有效數(shù)據(jù)(clean data)。將clean data與“中李6號”參考基因組(https://www.rosaceae.org/Analysis/9019655)數(shù)據(jù)[12]進行比對,比對工具為BWA軟件[13](參數(shù):mem -t 4 -k 32 -M),比對結(jié)果經(jīng)SAMTOOLS[14]去除重復(fù)(參數(shù):rmdup)。最后使用SAMTOOLS和ANNOVAR軟件進行單核苷酸多態(tài)性(SNP)和得失位(InDel)檢測及注釋[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記檢測與基因分型

試驗結(jié)果表明,在已公布的77對李屬種質(zhì)資源SSR引物中,沒有任何一對引物能夠同時區(qū)分出這3個李品種。但29號引物和UDP98-021可以作為區(qū)分“蜂糖李”的分子標(biāo)記:“玉帶李”和“青脆李”的29號引物PCR擴增產(chǎn)物為100～250 bp的單條帶,而“蜂糖李”的29號引物PCR擴增產(chǎn)物為1 000～2 000 bp的單條帶;“蜂糖李”的UDP98-021引物PCR擴增產(chǎn)物為100～250 bp的單條帶,“玉帶李”和“青脆李”未能擴增出條帶。ASS R71引物可以作為區(qū)分“青脆李”的分子標(biāo)記:“玉帶李”和“蜂糖李”的ASS R71引物PCR擴增產(chǎn)物為100～250 bp的單條帶,“青脆李”未能擴增出條帶。通過組合不同引物的基因分型結(jié)果能夠區(qū)分出這3個李品種(見圖2、圖3和表2)。

表2 可區(qū)分“玉帶李”“青脆李”“蜂糖李”的3對SSR引物信息及分型結(jié)果

注:1、2和3分別代表“玉帶李”“青脆李”“蜂糖李”;1#至40#指引物,M指Marker。

注:1、2和3分別代表“玉帶李”“青脆李”“蜂糖李”;中間的Marker,從上至下分別是5 000、3 000、2 000、1 000、750、500、250、100 bp。

2.2 基因組重測序數(shù)據(jù)質(zhì)量

以3個品種葉片DNA樣本為模板進行基因組重測序,共產(chǎn)生raw data 5.232 Gbp,過濾后的 clean data 5.19 Gbp,各樣本的raw data在(1 502.621 ～2 145.653)Mbp之間,測序質(zhì)量高(Q20≥96.95%,Q30≥91.94%),GC含量在38.8%～40.37%之間,所有樣本的數(shù)據(jù)量足夠,測序質(zhì)量合格,GC分布正常,建庫測序結(jié)果能夠滿足基因組之間的比較分析(見表3)。

表3 “玉帶李”“青脆李”“蜂糖李”3個李品種基因組重測序數(shù)據(jù)質(zhì)量情況

表4 “玉帶李”“青脆李”“蜂糖李”3個李品種基因組重測序深度及覆蓋度

2.3 基因組重測序數(shù)據(jù)與參考基因組比對結(jié)果

“中李6號”參考基因組大小為318 575 050 bp,所有樣本的比對率在88.61%～95.02%之間,對參考基因組(排除N區(qū))的平均覆蓋深度在7.13～8.03(×)之間,1(×)覆蓋度(至少有一個堿基的覆蓋)在76.95%以上。以上比對結(jié)果正常,可用于后續(xù)的變異檢測及相關(guān)分析。

2.4 基因組SNP與InDel檢測及注釋結(jié)果

與“中李6號”參考基因組相比,“玉帶李”“青脆李”“蜂糖李”基因組檢測到的SNP位點數(shù)分別為712 529、384 711和373 883個,InDel數(shù)量分別為101 979、47 410和48 445個。其中,“玉帶李”在基因上下游1 kb區(qū)域、內(nèi)含子區(qū)域、外顯子區(qū)域、剪接位點以及基因間區(qū)內(nèi)的SNP和InDel數(shù)量均遠高于“青脆李”“蜂糖李”,并且其轉(zhuǎn)換(ts)和顛換(tv)的SNP數(shù)量、插入和缺失的InDel數(shù)量也為最高值。這表明,“玉帶李”的遺傳背景與“青脆李”“蜂糖李”有極大差異(見表5和表6)。

表5 “玉帶李”“青脆李”“蜂糖李”3個李品種基因組SNP檢測及注釋結(jié)果統(tǒng)計

表6 “玉帶李”“青脆李”“蜂糖李”3個李品種基因組InDel檢測及注釋結(jié)果統(tǒng)計

2.5 SNP和InDel變異檢測結(jié)果可視化分析

為了更清晰地顯示各樣品染色體上SNP和InDel的分布情況,以100 kb為窗口,統(tǒng)計每個窗口上的SNP和InDel密度,繪制了3個李品種染色體上的SNP、InDel密度分布熱圖,詳見圖4。結(jié)果顯示,與“中李6號”參考基因組相比,“玉帶李”1～8號染色體上SNP和InDel密度分布均明顯高于“青脆李”和“蜂糖李”,表明“玉帶李”的遺傳背景與“青脆李”和“蜂糖李”差異較大?！扒啻嗬睢焙汀胺涮抢睢比旧w上SNP和InDel密度分布十分相似,表明“青脆李”和“蜂糖李”親緣關(guān)系相對較近?；谥販y序技術(shù)的SNP和InDel變異檢測結(jié)果錨定到染色體上后,可以用于初步鑒定這3種青皮李品種的遺傳背景和親緣關(guān)系。

圖4 “玉帶李”“青脆李”“蜂糖李”3個李品種錨定到染色體上的SNP密度分布

圖5 “玉帶李”“青脆李”“蜂糖李”3個李品種錨定到染色體上的InDel密度分布

3 討論與結(jié)論

目前四川省主栽青皮李品種為“青脆李”“蜂糖李”“巴山脆李”“玉帶李”等選育品種以及“江安李”等少量地方品種。一些青皮李的成熟期相近或果實外觀相似,又缺少鑒別方法,常有果農(nóng)和果商將“玉帶李”稱作“晚熟青脆李”或“晚熟蜂糖李”進行銷售。SSR分子標(biāo)記是一種具有操作簡單、重復(fù)性好、共顯性高、穩(wěn)定性強、位點特異等優(yōu)點的DNA分子標(biāo)記,是果樹新品種鑒定的常用技術(shù)。王清明等人[16]在構(gòu)建觀賞桃SSR指紋圖譜時,發(fā)現(xiàn)選用組合內(nèi)各引物多態(tài)性條帶總數(shù)最多的組合方式能夠為22份觀賞桃種質(zhì)構(gòu)建指紋圖譜。我國李品種選育和分子標(biāo)記開發(fā)相對滯后,因此本試驗參照李屬近緣作物桃的分子標(biāo)記方法(《桃品種鑒定SSR分子標(biāo)記法:NY/T 3642—2020》),從前人研究結(jié)果中篩選出77對李屬種質(zhì)資源SSR分子標(biāo)記對3個四川省主栽青皮李品種進行基因分型,雖然沒有任何一對SSR分子標(biāo)記可以同時區(qū)分出這3個李品種,但29號引物和UDP98-021可以作為區(qū)分“蜂糖李”的分子標(biāo)記;ASS R71可以作為區(qū)分“青脆李”的分子標(biāo)記。果實外觀特征和成熟期是生產(chǎn)中判斷不同李品種的常見指標(biāo),再結(jié)合“玉帶李”的果實成熟期和水漬帶狀縫合線特征,可以成功區(qū)分出這3個李品種。

近年來,由于測序成本的不斷降低,對許多果樹的認(rèn)知進入了基因組時代。逐漸豐富的李屬種質(zhì)資源基因組數(shù)據(jù)庫,為鑒定李種質(zhì)資源的遺傳背景和親緣關(guān)系提供了數(shù)據(jù)支撐。Wang等人[17]對377份分布于海拔2 067～4 498 m的西藏李屬種質(zhì)資源開展精細(xì)評價,發(fā)現(xiàn)不同李屬種質(zhì)資源之間的SNP數(shù)量分布在269 568～4 153 328之間。本試驗參照Wang等人[17]對西藏李屬種質(zhì)資源精細(xì)評價方法(測序平臺、測序深度等所有測試方法保持一致),對成熟期或外觀相近的3個李品種進行SNP和InDel變異檢測,結(jié)果顯示3個李品種與參考基因組(中李6號)的SNP位點數(shù)均在37萬個以上。一般果樹基因組的雜合度較高,在雜交組配過程中選擇遺傳背景差異較大的親本有利于避免返祖現(xiàn)象。本試驗中,“玉帶李”染色體上SNP和InDel密度分布熱圖均明顯高于“青脆李”和“蜂糖李”,表明其遺傳背景與“青脆李”“蜂糖李”有較大差異?！坝駧Ю睢蓖瑫r具有晚熟、高甜、果形端正和產(chǎn)量高等優(yōu)勢,可以作為“青脆李”“蜂糖李”的配套授粉品種,是李品種改良的優(yōu)良親本。值得注意的是,“青脆李”和“蜂糖李”雖然外觀有較大差異,但染色體上的SNP和InDel分布密度十分相似,遺傳背景相似度極高,因此,可能是研究果實縫合線形成和糖分積累差異機制的適宜材料。

綜上所述,利用29號、UDP98-021和ASS R71等3對SSR引物進行分型的結(jié)果,結(jié)合果實成熟期和外觀特征,可以準(zhǔn)確區(qū)分出“玉帶李”“青脆李”“蜂糖李”等3個青皮李品種?；谥販y序技術(shù)的SNP和InDel檢測分析結(jié)果表明,“玉帶李”的遺傳背景與“青脆李”“蜂糖李”有較大差異,“青脆李”“蜂糖李”的遺傳背景高度相似?！坝駧Ю睢笨梢宰鳛椤扒啻嗬睢焙汀胺涮抢睢钡呐涮资诜燮贩N,是李品種改良的優(yōu)良親本。