黃 楊,郭 明,孫雨婷,王義平,葉碧歡,陳友吾

(1 浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,杭州,311300;2 浙江農(nóng)林大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院,杭州,311300;3 浙江農(nóng)林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院,杭州,311300;4 浙江省林科院森林保護(hù)研究所,杭州,310023)

香榧綠藻(Chlorellasp.)屬綠藻門(Chlorophyta)藻類,為小球藻屬(Chlorella)的一個變異類型,是一種附著在榧樹枝和葉片表面的粗糙灰綠色苔狀物[1]。近些年,伴隨著香榧種植面積不斷擴大,香榧病害發(fā)生率也在逐年攀升,現(xiàn)階段香榧綠藻病害以化學(xué)防治為主要,常用石硫合劑作為除藻劑,防治效果較明顯,但存在抗藥性以及會對環(huán)境造成二次污染等問題[2]。為保證榧農(nóng)收益并貫徹可持續(xù)發(fā)展的理念,研發(fā)設(shè)計新型綠色滅藻劑具有重要意義。

有研究表明,植物源物質(zhì)具有抗癌、抗腫瘤、抗菌、抗瘧疾、抗病毒等作用,并且主要以生物堿為主[3-5]。生物堿是指存在于生物體內(nèi)具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的含氮堿性有機物,具有見效快、易控制、生態(tài)安全性高等特點,近幾年利用生物堿對藻類進(jìn)行抑制的研究也在不斷展開[6]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),粉防己堿、防己諾林堿能夠抑制蛋白核小球藻Chlorellapyrenoidosa的生長,當(dāng)浸提液相對質(zhì)量濃度1 g/L時抑制蛋白核小球藻的效應(yīng)最強[7]。有學(xué)者評價幾種典型植物化感物質(zhì)對銅綠微囊藻的抑制效果,發(fā)現(xiàn)生物堿類化感物質(zhì)對銅綠微囊藻的抑制效果最為明顯,抑制率超過80%;并且4種生物堿中又以小檗堿成本低,效果顯著[8]。大蒜素是一種具有刺激氣味的含硫有機物,已有文獻(xiàn)報道,幾種抗生素耐藥菌株均被發(fā)現(xiàn)對大蒜素敏感[9]。但大蒜素易揮發(fā),是一種酯類物質(zhì),難以溶解于藻類溶液中?；碧侵鳛楸砻婊钚詣┚哂猩锟山到狻o毒害的特點,并且有研究表明,槐糖脂對有害藻類具有較強抑制作用[10-12]。近10年來,利用植物源物質(zhì)進(jìn)行藻類防治的報道大多針對引起水體富營養(yǎng)化的銅綠微囊藻Microcystisaeruginosa、斜生柵藻Scenedesmusobliquus等[13-15],主要集中于海岸、河口、湖泊等大生態(tài)環(huán)境,并取得一定進(jìn)展[16-19]。對于為害高等植物的樹生藻類,如集球藻(Palmellococcussp.)、絲藻(Ulothrixsp.)、小球藻(Chlorellasp.)鮮有報道[1]。因此,針對香榧綠藻(Chlorellasp.),我們選取小檗堿和大蒜素作為抑藻藥物,通過測定分析香榧綠藻相關(guān)指標(biāo)變化,為利用小檗堿和大蒜素防治香榧綠藻提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

香榧綠藻(Chlorellasp.)來自浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院。

試劑與藥品:小檗堿,HPLC≥99%,上海超研生物科技有限公司產(chǎn);大蒜素,分析對照品,二甲基亞砜、BG11培養(yǎng)基、Na2HPO4,上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn);超氧化物歧化酶試劑盒,北京蘭杰柯科技有限公司產(chǎn);過氧化氫酶試劑盒、丙二醛試劑盒,北京源葉生物科技有限公司產(chǎn)。

儀器:顯微鏡(LEICA DM500)、酶標(biāo)儀、數(shù)顯恒溫水浴鍋,國華電器有限公司產(chǎn);全自動高壓蒸汽滅菌器,上海堯勛智能科技有限公司產(chǎn);電子分析天平、高速冷凍離心機(Thermo Fisher)、人工氣候箱,上海齊欣科學(xué)儀器有限公司產(chǎn);紫外分光光度計,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn);樣品快速研磨儀,上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn);超純水機,四川優(yōu)普超純科技有限公司產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 香榧綠藻培養(yǎng) 在無菌條件下,將藻液接種到經(jīng)高壓滅菌鍋滅菌的含有BG-11培養(yǎng)基溶液的錐形瓶中,封口膜封住瓶口,用橡皮筋扎緊,置于3級光照強度的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天早、中、晚振搖3次,每隔96 h 擴培1次,使藻細(xì)胞基本達(dá)到同步生長。

1.2.2 小檗堿、大蒜素處理 向二甲基亞砜20 mL中加入小檗堿80 mg配制成小檗堿母液4 mg/mL,再各取小檗堿母液1、2、4、8 mL及二甲基亞砜1 mL(對照)加入至50 mL BG-11培養(yǎng)基中,在加入BG-11培養(yǎng)的處于對數(shù)生長期的香榧綠藻溶液,使最終體積為100 mL,小檗堿濃度為40、80、160、320 μg/mL,用封口膜封口,重復(fù)3次;測定綠藻細(xì)胞的起始濃度,將錐形瓶置于人工氣候箱中培養(yǎng),每4 d取樣1次測定香榧綠藻的藻細(xì)胞密度、葉綠素a含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性以及丙二醛(MDA)含量。

配制大蒜素母液40、80、160、320 μg/mL,方法同小檗堿配制;用二甲基亞砜400 mL分別配制槐糖脂溶液10、20、40、80 μg/ mL,以大蒜素用量、槐糖脂助劑用量分別為4個水平,培養(yǎng)時間為4、8、12 d等3個水平,采用L16(42×31)混合正交試驗,每處理重復(fù)3次。

1.2.3 香榧綠藻細(xì)胞密度測定 取樣前,將錐形瓶振蕩搖勻,用膠頭滴管吸取距藻液面下1 cm處的藻液1 mL,滴于細(xì)胞計數(shù)板上,每片計數(shù)板進(jìn)行兩次藻細(xì)胞數(shù)量測定,取平均值,若樣本的兩次計數(shù)結(jié)果與其平均數(shù)之差不大于其均數(shù)的15%,則視為有效數(shù)據(jù),否則重新測定。測定完畢后,向錐形瓶中加入BG-11培養(yǎng)液1 mL,維持原有體積[22]。藻細(xì)胞密度測定采用血細(xì)胞計數(shù)法,計算香榧綠藻抑制率。抑制率(%)=(對照藻細(xì)胞密度-處理藻細(xì)胞密度)/對照藻細(xì)胞密度×100。

1.2.4 葉綠素a含量測定 葉綠素提取采用丙酮加熱法[20],用移液槍吸取綠藻液2 mL置于離心管中,于10 000 r/min離心5 min,去除上清液,藻餅于80%丙酮2 mL中重懸浮,在黑暗條件下55 ℃水浴60 min后,于10 000 r/min離心5 min,吸出上清液轉(zhuǎn)移至10 mL刻度試管中,并用80%丙酮定容至5 mL,測定663 nm處的光吸收值,計算葉綠素a含量,葉綠素a含量(mg/L)=A663/82。

1.2.5 粗酶液提取及酶活性測定 酶液制備:取藻液2 mL,4 ℃、10 000 r/min離心5 min收集藻細(xì)胞,加入預(yù)冷的pH值7.8磷酸緩沖液0.05 mol/L 2 mL,在冰浴條件下,用樣品快速研磨儀75Hz研磨90 s后,于4 ℃、10 000 r/min離心5 min,所得上清液即為酶液。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑法(NBT)[21]測定,抑制率(%)=(A空白對照1-A樣品)/( A空白對照1-A空白對照2) ×100,SOD活性(U)=抑制率/(1-抑制率),式中,1個SOD活性單位為反應(yīng)體系中抑制百分率達(dá)到50%時的酶活性,A空白對照1、A樣品、A空白對照2分別為空白對照1、樣品和空白對照2的吸光度。

過氧化氫酶(CAT)活性采用鉬酸銨微板法,CAT活性(U/mL)=( A自身對照-A測定) /A空白×650,式中,A自身對照、A測定、A空白分別為自身對照、測定管和空白管的吸光度。

1.2.6 丙二醛含量測定 丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法測定,分解產(chǎn)物MDA常被用作細(xì)胞氧化損傷的生物指標(biāo)[22]。MDA(μmol/L)=6.45×(OD535-OD600)-0.56×OD450。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運用origin 2018軟件及SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行圖形繪制和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小檗堿的作用

2.1.1 對香榧綠藻生長的影響 從表1可以看出,處理4 d時,小檗堿40 μg/mL處理的藻細(xì)胞密度與對照無顯著性差異,抑制率僅為1.50%;處理12 d時,40 μg/mL處理的抑制率為59.60%。其余小檗堿處理的藻細(xì)胞密度隨小檗堿濃度升高而下降;處理12 d時,各處理之間均存在顯著性差異(p<0.05,下同),此時小檗堿320 μg/mL處理的抑制率為85.45%。說明處理4 d以前,小檗堿40 μg/mL對香榧綠藻的抑制能力較弱;4個濃度處理均隨處理時間延長,抑制率增加。

表1 不同質(zhì)量濃度小檗堿處理對香榧綠藻的抑制作用

2.1.2 對香榧綠藻葉綠素a和丙二醛含量的影響 從圖1可以看出,葉綠素a含量變化趨勢與藻細(xì)胞密度變化趨勢基本一致。處理4 d 時,小檗堿40 μg/mL處理與對照之間無顯著性差異;處理8 d時,小檗堿各處理葉綠素a含量均顯著低于對照。處理4 d 時,80 μg/mL與160 μg/mL處理間存在顯著性差異;處理12 d時,兩組之間無顯著性差異。

圖1 不同質(zhì)量濃度小檗堿處理對香榧綠藻葉綠素a和丙二醛含量的影響

試驗期間,對照的丙二醛含量保持在正常水平,除了處理4 d時40 μg/mL,其他時間其余小檗堿處理的丙二醛含量均比對照顯著增加;40 μg/mL和80 μg/mL處理的丙二醛含量在各時間段差異均不顯著。160 μg/mL與320 μg/mL在處理4 d 和8 d 差異不顯著,處理12 d這兩個處理間差異顯著。

2.1.3 對香榧綠藻酶活性的影響 從圖2可以看出,處理4 d 時,小檗堿40 μg/mL和80 μg/mL處理的SOD活性均顯著高于對照,160、320 μg/mL處理的SOD活性與對照無顯著性差異。處理8 d 時,小檗堿40 μg/mL處理的SOD活性仍顯著高于對照,80、160 μg/mL處理的SOD活性低于對照,但差異不顯著;320 μg/mL處理SOD活性顯著低于對照。處理12 d時,小檗堿處理的SOD活性均顯著低于對照,且各處理間存在顯著性差異。說明小檗堿對香榧綠藻SOD活性存在低促高抑現(xiàn)象。

圖2 不同質(zhì)量濃度小檗堿處理對香榧綠藻超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性的影響

CAT活性與SOD變化趨勢一致,處理4 d時,40、80 μg/mL處理CAT活性顯著高于對照,前兩者間差異不顯著;160、320 μg/mL處理與對照間差異不顯著。處理8 d 時,40、80 μg/mL處理與對照間無顯著性差異,160、320 μg/mL處理顯著低于對照160 μg/mL與320 μg/mL處理間無顯著性差異。處理12 d時,小檗堿處理CAT活性均低于對照,160 μg/mL與320 μg/mL處理間、40 μg/mL與80 μg/mL處理間差異不顯著。說明高濃度(160、320 μg/mL)小檗堿從開始就能夠通過降低酶活性來抑制藻細(xì)胞生長。

2.2 大蒜素的作用

從表2和圖3可以看出,A4B2C3,即大蒜素320 μg/mL+槐糖脂助劑20 μg/mL+培養(yǎng)12 d處理效果最好,抑制率為85.50%,略高于小檗堿。A4B2C3處理與對照之間差異明顯,可從培養(yǎng)平板直觀看出對照藻細(xì)胞數(shù)量逐漸增多,大蒜素處理的藻細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。為進(jìn)一步驗證3個因素交互效應(yīng)所產(chǎn)生的誤差是否會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性,對表2中A、B、C 3個因素進(jìn)行方差分析可得各因素主體間效應(yīng),并進(jìn)行方差分析,得出的誤差、自由度、均方計算出交互效應(yīng)的顯著性為0.130 2>0.05,因此3個因素之間的交互效應(yīng)不顯著,此時可以忽略交互效應(yīng)所帶來的誤差,表明表2數(shù)據(jù)真實可靠。

圖3 不同培養(yǎng)時間大蒜素320 μg/mL+槐糖脂助劑20 μg/mL處理對香榧綠藻的抑制作用

表2 大蒜素、槐糖脂、培養(yǎng)時間L16(42×31)混合正交試驗對香榧綠藻的抑制作用

經(jīng)過試驗組數(shù)與藻細(xì)胞密度間的效應(yīng)檢驗,大蒜素濃度與處理時間對香榧綠藻細(xì)胞的作用存在顯著影響,而助劑濃度的影響并不顯著,推測可能由于槐糖脂對綠藻液無直接抑制作用,而是使大蒜素更均勻地分散在藻液中,從而提高抑制率。說明大蒜素添加合適的生物助劑能夠獲得良好的抑藻效果。推算的最佳方案為A4B2C3,與表2中實際測定結(jié)果一致。

3 討論

小檗堿作為公認(rèn)的抑制藻類生長的生物堿,已被廣泛應(yīng)用于抑藻研究,但其抑制樹生藻類的研究鮮有報道。本研究探討了其對香榧綠藻生長的抑制情況,結(jié)果表明,不同濃度小檗堿對香榧綠藻的抑制作用不同。處理4 d時,低濃度(40、80 μg/mL)處理的SOD和CAT活性均達(dá)到頂峰并顯著高于對照,推測其原因可能是低濃度的小檗堿在前4 d時促使香榧綠藻細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧并未超出其細(xì)胞的承受范圍,因此在綠藻細(xì)胞內(nèi)形成了短期的負(fù)反饋調(diào)節(jié),使得SOD、CAT活性升高。有研究表明,藻細(xì)胞面對低濃度生物堿進(jìn)攻時會形成較好的抵御機制,通過提高酶活性來清除短時間內(nèi)因環(huán)境脅迫而產(chǎn)生的自由基[23-24],這與本試驗結(jié)果一致。不同于活性氧(ROS)系統(tǒng),低濃度小檗堿仍然可以降低香榧綠藻葉綠素a含量從而影響藻細(xì)胞光合作用,致使細(xì)胞死亡。劉彥彥探究了白屈菜紅堿對銅綠微囊藻光合系統(tǒng)的影響,認(rèn)為白屈菜紅堿能夠攻擊微囊藻光合系統(tǒng)反應(yīng)中心供體,影響電子傳遞從而致使葉綠素a含量下降,光合作用系統(tǒng)受損[25]。處理8 d后,藻細(xì)胞內(nèi)的活性氧含量逐漸增多,超出了抗氧化系統(tǒng)的承受能力,從而導(dǎo)致SOD、CAT活性下降,丙二醛含量逐漸增多,細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化,葉綠素a含量下降,光合系統(tǒng)無法正常進(jìn)行,最后藻細(xì)胞凋亡。高濃度小檗堿致使香榧綠藻細(xì)胞內(nèi)的葉綠素a含量急速下降,無法正常進(jìn)行光合作用,活性氧濃度不斷升高,超過其耐受范圍,ROS清除系統(tǒng)無法正常運行,形成正反饋調(diào)節(jié),SOD、CAT活性持續(xù)下降,活性氧濃度進(jìn)一步升高,丙二醛含量也逐步升高,細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化加劇,最終導(dǎo)致細(xì)胞新陳代謝機制受損,細(xì)胞死亡。盡管室內(nèi)試驗結(jié)果顯示小檗堿對香榧綠藻的抑制效果十分明顯,但還缺少林間應(yīng)用試驗,林間防治時需考慮藥劑漂移,氣候因素等條件對藥效的影響,有待進(jìn)一步研究。

大蒜素作為一種高效的抗菌藥物被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域,被譽為天然抗生素[26-27]。大量研究表明,其抑菌機制主要為還原型谷胱甘肽(γ-L-Glutamyl-L-cysteinylglycine,GSH)作用于含有二硫鍵的大蒜素,使二硫鍵斷裂,自身被氧化成氧化型谷胱甘肽(L-Glutathione Oxidized,GSSG),而GSH被認(rèn)為是許多生物體細(xì)胞質(zhì)中含量高達(dá)10 mmol/L的主要抗氧化物質(zhì),是保護(hù)細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激的第一道防線[28-29]。Sharifi-Rad等研究表明,銀納米粒子和大蒜素的聯(lián)合作用可有效用于治療耐藥性微生物菌株引起的皮膚感染[30]。Strehlow等開發(fā)出一種用于治療肺部疾病的微粒制劑,將大蒜素封裝于由乳糖形成的微球中[31]。盡管大蒜素具有廣闊的應(yīng)用前景,但仍需要克服其易揮發(fā)的特點,以及存在化感效應(yīng),大蒜素或有可能在林間使用時對香榧生長造成影響,需進(jìn)一步研究驗證[32-33];后續(xù)將圍繞降低大蒜素的揮發(fā)性以及提高其對香榧綠藻的靶向性開展試驗。有研究表明,藻類生長過程中會使自身環(huán)境pH值上升呈堿性[34-35],對此可以設(shè)計響應(yīng)pH值變化以及將二硫鍵接到緩釋載體上并包覆大蒜素,在克服大蒜素?fù)]發(fā)性的同時提高其對香榧綠藻的靶向性。

本研究結(jié)果表明,小檗堿能夠影響藻細(xì)胞光合作用造成其抗氧化系統(tǒng)失衡,過多活性氧積累超出細(xì)胞耐受范圍,干擾細(xì)胞代謝,致使細(xì)胞膜過脂化,細(xì)胞結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損,從而抑制香榧綠藻的生長;大蒜素有望制備成一種新型的殺藻劑,需進(jìn)一步開展其與香榧綠藻互作機制以及改良其性能的相關(guān)研究。