趙曉珍,王 紅,王紅林,解 璞,馬玉華

(貴州省農(nóng)業(yè)科學院果樹科學研究所,貴陽,550006)

百香果PassifloraedulisSims又名西番蓮、雞蛋果,屬西番蓮科(Passifloraceae)西番蓮屬,原產(chǎn)于南美洲,主要種植于熱帶和亞熱帶地區(qū),在我國廣東、廣西、福建、臺灣、貴州、四川等地均有種植[1]。百香果富含維生素、氨基酸、礦質(zhì)元素、膳食纖維等營養(yǎng)物質(zhì),以及黃酮、類胡蘿卜素、多糖等生物活性成分,深受消費者喜愛[2-3]。貴州省百香果產(chǎn)業(yè)主要集中在黔東南苗族侗族自治州、黔西南布依族苗族自治州、黔南布依族苗族自治州等地區(qū),近年來發(fā)展迅速,種植面積已超1.07萬hm2,居全國第三[4]。隨著貴州省百香果種植面積快速增加,且種植區(qū)域夏季高溫多雨,病害問題日趨嚴重。目前我國百香果主要病害有病毒病、炭疽病、莖基腐病、果腐病、瘡痂病等[5-9],在貴州、廣西等地百香果炭疽病發(fā)生較為普遍[10-11]。百香果炭疽病主要為害果實,發(fā)病初期為褪綠黃色小點,逐步擴大為黃色病斑,圓形或不規(guī)則形,嚴重時病斑連片,后期病斑上會散生黑色小點,嚴重影響百香果的商品果率和產(chǎn)量。百香果炭疽病病原種類多,目前國內(nèi)外已報道病原主要有巴西炭疽菌Colletotrichumbrasiliense[11]、博寧炭疽菌C.boninense[12-13]、短孢炭疽菌C.brevisporum[14]、膠孢炭疽菌C.gloesporioides[15]等,冉飛等[10]報道貴州百香果炭疽病原為喀斯特炭疽菌C.karstii。同一植物上的炭疽病可能由不同種類炭疽菌引起,而不同種類炭疽菌對同種殺菌劑的敏感性可能存在顯著性差異[16-18],因此,明確貴州百香果炭疽病病原是防治病害的關鍵。本研究通過病原菌形態(tài)學、致病性和分子生物學鑒定,明確貴州百香果炭疽病病原,為貴州百香果炭疽病防治,以及百香果抗性育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

貴州省果樹科學研究所熱帶果樹種植基地(貴州省安順市鎮(zhèn)寧布依族苗族自治縣壩草鎮(zhèn))采集“紫香1號”百香果炭疽病典型癥狀病果及健康果實備用。

1.2 病原菌的分離和純化

采用常規(guī)組織分離法[19],在病果表面病健交界處取約為3 mm×3 mm大小組織,依次用75%酒精浸泡3 s,5%次氯酸鈉溶液浸泡4～5 min,滅菌水洗4～5次,滅菌濾紙干燥后置于PDA培養(yǎng)基,25 ℃恒溫培養(yǎng),待組織周圍長出菌落,挑取菌落邊緣菌絲純化,純化菌株接種于PDA斜面4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 致病性測定

將分離純化菌株于PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d,用直徑5 mm無菌打孔器取菌餅,采用針刺法[19-20]將菌餅接種于健康果實上,以接種無菌PDA培養(yǎng)基塊果實作為對照,無菌脫脂棉保濕,分別于28 ℃和22 ℃,相對濕度75%光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h,重復3次,5 d后觀察發(fā)病情況,并對發(fā)病百香果再次分離鑒定。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 形態(tài)學鑒定 將純化后致病菌株接種于PDA培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)5 d后,用顯微鏡觀察菌絲等形態(tài)。

1.4.2 分子生物學鑒定 采用Ezup柱式真菌基因組DAN試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司產(chǎn))提取致病菌DNA,對內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)基因(internal transcribed spacer gene,ITS)、肌動蛋白基因(actin gene,ACT)、β-微管蛋白基因(beta-tubulin gene,TUB2)、幾丁質(zhì)合成酶A基因(chitin synthase A gene,CHS-1)進行擴增[21-23]。PCR產(chǎn)物純化,克隆后送北京擎科生物科技有限公司測序。將測序結果進行比對分析,并參考Cannon等[24]報道的相關模式菌株序列,采用MAGA6.0經(jīng)比對校正,按ITS、TUB2、ACT、CHS-1順序拼接后,以甘薯黑痣病菌Monilochaetesinfuscans為外群,運用Maximum Likelihood構建進化樹(見表1)。

表1 用于構建百香果果實炭疽病病原菌進化樹的GenBank登錄號

2 結果與分析

2.1 百香果果實炭疽病癥狀

從圖1可以看出,發(fā)病初期為褪綠黃色小點,逐步擴大為黃色病斑,圓形或不規(guī)則形,稍凹陷;嚴重時病斑連片,布滿整個果實,后期病斑上會散生黑色小點。

圖1 百香果田間果實炭疽病癥狀和分離菌株B10和ZB3致病性測定

2.2 病原分離及致病性測定

從圖1可以看出,分離純化菌株B10和ZB3分別接種健康果實5 d后,接種部位均有明顯黃色病斑,與田間癥狀相似,對照未見明顯病斑。根據(jù)柯赫氏法則對接種后發(fā)病果實進行分離,并觀察菌落、孢子形態(tài)等與菌株B10、ZB3一致,表明分離菌株B10、ZB3均可引起果實炭疽病。

2.3 病原菌鑒定

2.3.1 病原菌形態(tài)特征 從圖2可以看出,菌株B10在PDA培養(yǎng)基上菌落圓形,邊緣整齊,正面為白色氣生菌絲,培養(yǎng)5 d后,菌落直徑可達4.9 cm,部分產(chǎn)生桔紅色分生孢子堆,反面因受分生孢子堆影響呈黃白色。菌株B10分生孢子透明,單孢,橢圓形、長橢圓形,一端鈍圓,另一端鈍圓或稍尖,未見明顯油球,大小(10～24) μm×(4.5～8.5) μm。菌株ZB3在PDA培養(yǎng)基上菌落圓形,邊緣整齊,正面氣生菌絲白色,培養(yǎng)5 d后,菌落直徑可達5.1 cm,反面初期白色,隨培養(yǎng)時間增加逐漸變?yōu)榈S色至黃色。菌株ZB3分生孢子透明,單胞,橢圓形或長橢圓形,一端鈍圓,另一端鈍圓或稍尖,未見明顯油滴,大小(10.5～19) μm×(5～7.5) μm。根據(jù)形態(tài)初步推斷菌株B10和ZB3均為炭疽菌屬(Colletotrichum)真菌。

圖2 菌株B10和菌株ZB3在PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)及其分生孢子形態(tài)

2.3.2 病原菌分子生物學鑒定 從圖3可以看出,菌株B10與Colletotrichumbrasiliense(菌株CBS 128501,GenBank登陸號:ITS,JQ005235;TUB2,JQ005669;ACT,JQ005583;CHS-1,JQ005409),菌株ZB3與C.karstii(菌株CORCG6,GenBank登陸號:ITS,HM585409;TUB2,HM585428;ACT,HM581995;CHS-1,HM582023;菌株CZ2-2,ITS,MT351103;TUB2,MT396845;ACT,MT396749,CHS-1,MT396781)聚于一支,外群菌株處在系統(tǒng)發(fā)育樹的外圍。因此,結合形態(tài)學分析、致病性驗證和多基因序列分析,推斷引起貴州百香果果實炭疽病病原菌主要為巴西炭疽菌Colletotrichumbrasiliense和喀斯特炭疽菌C.karstii。

圖3 基于ITS-TUB2-ACT-CHS-1基因序列構建的菌株B10和菌株ZB3系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結論與討論

炭疽菌屬(Colletotrichum)真菌是一類普遍存在的植物病原菌,可侵染果樹、蔬菜、花卉等多類植物,主要造成植物表皮組織形成規(guī)則或不規(guī)則的壞死病斑,導致發(fā)病組織壞死,嚴重時造成植株死亡,引起嚴重的經(jīng)濟損失[24]。炭疽菌屬傳統(tǒng)分類鑒定主要依靠孢子,附著胞及菌落生長速率、顏色等形態(tài)特征,但由于炭疽菌隨培養(yǎng)條件可變化,僅依靠形態(tài)不能有效地區(qū)分鑒定炭疽菌種類。在現(xiàn)代炭疽菌屬分類中,多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析可有效鑒定炭疽菌屬真菌種類[25-27]。

本研究結合形態(tài)學觀察、致病性驗證,以及ITS-TUB2-ACT-CHS-1多基因構建系統(tǒng)發(fā)育樹,明確引起貴州百香果果實炭疽病的致病菌為巴西炭疽菌C.brasiliense和喀斯特炭疽菌C.karstii,與冉飛等[10]報道貴州百香果炭疽病病原C.karstii以及SHI等[11]報道廣西百香果炭疽病病原C.brasiliense在孢子形態(tài)上較為一致,但菌落形態(tài)有差異,這可能與培養(yǎng)條件等有關。據(jù)報道博寧炭疽復合種[28]中的C.karstii[10]、C.Brasiliense[11]、C.boninense[12-13]、C.constrictum[29]以及膠孢炭疽復合種中的C.gloesporioides[15]等可引起百香果果實炭疽病。本研究結果表明,貴州產(chǎn)區(qū)百香果果實炭疽病可能同時由巴西炭疽菌C.brasiliense和喀斯特炭疽菌C.karstii復合侵染。目前關于百香果炭疽病防控藥劑篩選研究較少,冉飛等[30]篩選了9種殺菌劑對百香果炭疽病C.karstii的抑菌效果,鮮見關于百香果炭疽病C.brasiliense藥劑篩選的報道。同種植物炭疽病可由多種炭疽菌引起,不同炭疽菌種類對同種殺菌劑敏感性可能會有明顯差異。如許媛等[16]報道江蘇句容葡萄炭疽病至少有3個炭疽菌種群(C.aenima、C.viniferum、C.fructicola),且對多菌靈的抗藥性不同;霍建飛等[17]報道戊唑醇對2種辣椒炭疽菌(C.truncatum、C.scovillei)敏感性差異明顯;賀竟鋒等[18]報道橡膠樹不同種炭疽菌對殺菌劑的敏感性具有差異,并建議應先明確橡膠園病原菌種類再選擇合適的藥劑。因此,本研究中鑒定出的百香果果實炭疽病病原C.brasiliense和C.karstii對同種殺菌劑的敏感性可能不同,有待加強藥劑篩選工作。