李雙花,周 俊,游 平,黃愛軍,易 龍

(贛南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/國(guó)家臍橙工程技術(shù)研究中心,江西贛州,341000)

柑桔衰退病是由柑桔衰退病毒(Citrustristezavirus,CTV)引起的對(duì)柑桔產(chǎn)業(yè)具有毀滅性危害的一種病毒病害,嚴(yán)重影響柑桔產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展。柑桔衰退病已在美洲、亞洲、非洲、歐洲、太平洋及地中海地區(qū)等區(qū)域的50多個(gè)國(guó)家或地區(qū)發(fā)生,保守估計(jì)全世界柑桔產(chǎn)業(yè)因衰退病爆發(fā)和流行造成的損失已達(dá)數(shù)億美元,并且徹底改變了柑桔產(chǎn)業(yè)的發(fā)展方向[1]。CTV是長(zhǎng)線形病毒科(Closteroviridae)長(zhǎng)線形病毒屬(Closterovirus)中的一員,是世界上已知的、最大的植物病毒,其基因組長(zhǎng)約19.3 kb,擁有12個(gè)開放閱讀框,5’端和3’端各有1個(gè)非編碼區(qū),編碼至少19種蛋白質(zhì)[1-3]。CTV主要通過(guò)染病的接穗嫁接和苗木調(diào)運(yùn)擴(kuò)散,其不能經(jīng)種子傳播。在自然條件下,CTV可以通過(guò)介體蚜蟲以半持久性方式進(jìn)行傳播,其中褐色桔蚜的傳播效率最高[4]。根據(jù)CTV在不同寄主上引起不同的癥狀,將其分為苗黃型(Seeding yellow,SY)、速衰型(Quick decline,QD)和莖陷點(diǎn)型(Stem pitting,SP)[1,5]。CTV存在復(fù)雜的株系分化,已報(bào)道的CTV基因型有11種:T3、VT、T36、RB、T68、T30、HA16-5、A18、S1、L1、M1[6-11]。不同柑桔寄主對(duì)不同基因型CTV侵染的敏感度存在較大差異,酸橙、甜橙和柚等柑桔種類對(duì)T3、VT、T36、T68較為敏感[6-8],而枳及其雜交種對(duì)大部分基因型具有抗性[12]。同時(shí),CTV不同基因型的致病性存在一定差異,VT、T3、T68基因型可誘發(fā)莖陷點(diǎn)癥狀,T36基因型主要引起酸橙砧木的速衰型衰退病,S1和T30基因型一般不引起癥狀[5,6],但隨著RB基因型突破了枳的抗性[13],并在枳上鑒定到L1和M1兩種新基因型[11],表明CTV種群仍處于擴(kuò)張期,這對(duì)于抗性品種培育和防治策略研制帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)。

最近,本課題組從來(lái)自湖南江永的一份道縣野桔上得到一株CTV分離物,根據(jù)序列多樣性和遺傳演化分析,推定其歸屬一種新的基因型,將其命名為JY(Genbank登錄號(hào)為ON094625)。為了明確JY基因型在我國(guó)的發(fā)生情況及其遺傳多樣性,對(duì)在湖南江永、湖南道縣、湖南宜章(莽山)和江西崇義地區(qū)采集的野生柑桔樣品,以及福建、浙江、廣東、廣西、湖北、重慶、四川、江西和湖南采集的栽培柑桔樣品進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),分析ORF1b、p33、p25、p23基因序列的多樣性,測(cè)定JY基因型種群內(nèi)和種群間的遺傳分化系數(shù)(Fst),構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。本研究結(jié)果將有助于明確JY基因型的遺傳特性和進(jìn)一步探索CTV基因型的多樣性,為探明CTV的遺傳演化提供幫助。

1 材料與方法

1.1 柑桔材料及試劑

在湖南的江永(東經(jīng)111.34082°、北緯25.27233°)、宜章(莽山,東經(jīng)112.59467°、北緯24. 56694°)、道縣(東經(jīng)111.60195°、北緯25.52766°)及江西的崇義(東經(jīng)114.30835°、北緯25.68186°)分別采集道縣野桔(Citrusdaoxianensis)、莽山野桔(C.mangshanensis)和崇義野桔(C.reticulata)樣品共358份,各樣品采集地的生長(zhǎng)環(huán)境見圖1。另外,從福建、浙江、廣東、廣西、湖北、重慶、四川、江西和湖南(JY-2采集地附近栽培果園)等柑桔主產(chǎn)區(qū)采集的1 439份栽培柑桔樣品。

圖1 野生柑桔樣品生長(zhǎng)環(huán)境示例

RNAiso Plus總RNA提取試劑、TaqDNA polymerase、10×TaqBuffer、T載體和DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自購(gòu)自大連寶生物公司(TaKaRa)。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自普洛麥格(Promega)公司。dNTPs、DNA Marker、DNase/RNase Free ddH2O和DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)CTV JY-2分離物(Genbank登錄號(hào)為ON 094625)全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)JY基因型的檢測(cè)引物及ORF1b、p33、p25、p23基因序列擴(kuò)增引物(表1),引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 柑桔衰退病毒JY基因型檢測(cè)所用引物的信息

1.3 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

取柑桔葉片葉柄及中脈約0.1 g,利用RNAiso Plus(TaKaRa)提取總RNA,具體操作方法參照試劑盒說(shuō)明書。利用NanoDrop ND-2000(Thermo Scientific,USA)檢測(cè)總RNA濃度和純度,RNA樣品保存于-80 ℃冰箱。以1 μL總RNA為模板,以隨機(jī)六聚體(6N)為引物,按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶推薦方法進(jìn)行體系配制,在 37 ℃條件下反應(yīng)60 min合成cDNA,20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增及克隆測(cè)序

PCR反應(yīng)體系(25 μL):10 ×TaqBuffer(含Mg2+)4.5 μL,dNTPs 2.0 μL,上、下游引物(F/R)各0.5 μL,cDNA 1 μL,TaqDNA polymerase 0.4 μL,ddH2O 16.1 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,退火溫度30 s,72 ℃ 60 s/kb,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

參照DNA凝膠回收試劑盒方法,將擴(kuò)增到的預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物回收。將回收的目的片段連接到pMD-19 T載體中,并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng),通過(guò)PCR擴(kuò)增篩選陽(yáng)性單克隆4～6個(gè),送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.5 遺傳多樣性分析及系統(tǒng)發(fā)育分析

用MAFFT[14]軟件進(jìn)行序列比對(duì),通過(guò)Lasergene[15]序列分析軟件包中的MegAlign進(jìn)行序列同源性分析。運(yùn)用Dnasp[16]計(jì)算核苷酸多樣性、核苷酸分散度、種群間的遺傳分化系數(shù)(Fst)[17]和進(jìn)行Tajima’s D檢驗(yàn),分析種群內(nèi)及種群間的核苷酸差異。以GenAIEx[18]軟件對(duì)CTV種群進(jìn)行分子變異分析及主成分分析。應(yīng)用MEGA 7.0[19]軟件構(gòu)建單個(gè)基因序列的ML系統(tǒng)發(fā)育樹,參數(shù)設(shè)置為1 000 bootstrap重復(fù)。另外將比對(duì)好的各基因序列由Seqkit[20]軟件進(jìn)行拼接后,用MEGA軟件構(gòu)建4個(gè)基因序列的聯(lián)合ML樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 CTV及JY基因型發(fā)生情況

檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),各地栽培柑桔樣品CTV陽(yáng)性檢出率:福建50.6%,浙江33.3%,廣東100%,廣西48.6%,湖北100%,重慶50.5%,四川59.3%,江西34.1%,湖南47.1%。各地野生柑桔樣品CTV陽(yáng)性檢出率:崇義51.1%,道縣22.4%,莽山43.1%,江永32.6%(見表2)。對(duì)所有的CTV陽(yáng)性樣品進(jìn)行JY基因型檢測(cè)的結(jié)果發(fā)現(xiàn),僅江永的道縣野桔樣品中檢測(cè)出JY基因型(見圖2)。以上結(jié)果說(shuō)明CTV在我國(guó)栽培柑桔產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生,且野生柑桔也感染了CTV,但JY基因型僅分布于少數(shù)地區(qū)。

表2 野生柑桔和栽培柑桔上柑桔衰退病毒及JY基因型的檢測(cè)結(jié)果 個(gè)

注:M為DNA 2 000 marker,PC為陽(yáng)性對(duì)照,NC為陰性對(duì)照,WC為水對(duì)照,1—15為檢測(cè)樣品。

圖3 柑桔衰退病毒野生柑桔種群與栽培柑桔種群主成分分析結(jié)果

2.2 JY基因型分離物遺傳特征

2.2.1 序列多樣性分析 將獲得的12個(gè)JY分離物的ORF1b、p33、p25、p23基因序列與JY-2的對(duì)應(yīng)基因序列進(jìn)行相似性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)各分離物ORF1b、p33、p25的核苷酸(nt)和氨基酸(aa)序列相似性非常高:ORF1b基因nt相似性為99.8%～100%,aa相似性為99.8%～100%;p33基因nt相似性為99.0%～100%,aa相似性為98.3%～100%;p25基因nt相似性為99.7%～100%,aa相似性為100%。與ORF1b、p33、p25相比,p23具有較高的多樣性,nt相似性為96.8%～100%,aa相似性為97.1%～100%?？傮w而言,JY分離物之間4個(gè)基因序列相似性均較高。說(shuō)明,JY基因型種群內(nèi)的遺傳變異較少,種群較為穩(wěn)定。

進(jìn)一步將所有JY分離物的ORF1b、p33、p25、p23基因序列與CTV各基因型代表分離物的對(duì)應(yīng)基因序列進(jìn)行序列相似性比對(duì)分析,結(jié)果顯示JY分離物ORF1b、p33、p25、p23基因序列與CTV各基因型代表分離物的平均核苷酸序列相似性分別為79.2%～92.7%、80.8%～85.9%、90.5%～93.6%、87.5%～91.8%,而平均氨基酸序列相似性分別為89.5%～98.1%、80.8%～84.4%、93.7%～97.3%、85.4%～91.6%(見表3)。說(shuō)明,JY基因型分離物ORF1b、p25蛋白氨基酸序列較p33、p23蛋白保守。另外,與CTV JY-2基因組全長(zhǎng)序列分析結(jié)果一致[21],ORF1b、p33基因序列與CN-M1-ZT1分離物相似性最高,而p25、p23基因序列與A18分離物相似性最高(見表3)。

表3 柑桔衰退病毒JY基因型分離物與其他基因型代表分離物在4個(gè)基因序列上的平均核苷酸和氨基酸序列一致性 %

2.2.2 遺傳分化與種群動(dòng)態(tài)分析 為進(jìn)一步明確JY分離物與現(xiàn)存已報(bào)道的CTV基因型分離物之間的遺傳分化程度與種群動(dòng)態(tài),運(yùn)用Dnasp計(jì)算核苷酸多樣性、核苷酸分散度、種群間遺傳分化系數(shù)(Fst)和進(jìn)行Tajima’s D檢驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ORF1b、p33、p25、p23基因的核苷酸多樣性分別為0.121 53、0.119 22、0.061 36和0.076 28,說(shuō)明CTV種群ORF1b、p33基因的核苷酸多樣性顯著高于p23、p25基因;ORF1b、p33、p25、p23基因的Tajima’s D檢驗(yàn)值分別為-0.263 15、-0.747 63、-0.878 30和-0.355 29,但差異不顯著(p>0.1),表明CTV種群可能處于擴(kuò)張趨勢(shì)中。JY基因型分離物與CTV其他基因型分離物之間,在ORF1b、p33、p25、p23等4個(gè)基因上的Fst均大于0.25(見表4)。這說(shuō)明JY基因型與CTV其他基因型存在明顯的遺傳分化。另外,核苷酸分散度分析結(jié)果顯示,JY分離物與VT、T30、T3、T68、S1、T36分離物ORF1b基因的Ks(Silent)和Ks(JC-Silent)較高,分別為0.177 95～0.206 36和0.203 13～0.241 33;JY分離物與RB、VT、T30、T3、T68、S1、T36分離物p33基因的Ks(Silent)和Ks(JC-Silent)較高,分別為0.167 85～0.189 05和0.190 01～0.217 83;JY基因型分離物與CTV其他基因型分離物p25、p23的核苷酸分散度較低,p25的Ks(Silent)和Ks(JC-Silent)分別為0.079 11～0.090 84和0.083 60～0.096 83,p23的Ks(Silent)和Ks(JC-Silent)分別為0.083 88～0.117 34和0.088 96～0.127 60(見表4)。這說(shuō)明JY分離物與CTV其他基因型遺傳分化來(lái)自O(shè)RF1b和p33基因的貢獻(xiàn)高于p23和p25基因。

表4 柑桔衰退病毒JY基因型分離物與其他基因型分離物在4個(gè)基因上的核苷酸分散度及遺傳分化系數(shù)(Fst)

2.2.3 分子變異分析及主成分分析 為探究JY基因型遺傳分化的來(lái)源,根據(jù)CTV分離物來(lái)源將其劃分為野生柑桔種群(JY基因型分離物)和栽培柑桔種群(大部分其他基因型分離物)。分子變異分析結(jié)果顯示,來(lái)自CTV野生柑桔種群與栽培柑桔種群間、CTV野生柑桔種群內(nèi)個(gè)體間、CTV栽培柑桔種群內(nèi)個(gè)體間的變異分別占43%、42%和15%,說(shuō)明CTV野生柑桔種群與栽培柑桔種群的主要變異來(lái)自種群間;CTV野生柑桔種群與栽培柑桔種群間差異的p值為0.001(p<0.05為顯著),且Nm(Haploid) =0.396<1{Nm(Haploid) = [(1 / PhiPT) - 1] / 2},說(shuō)明差異非常大,且基因交流小。因此,推測(cè)野生柑桔獨(dú)特的生境可能是影響JY基因型種群出現(xiàn)明顯遺傳分化的重要因素。主成分分析顯示,CTV野生柑桔種群與栽培柑桔種群明顯分開(見圖 3),進(jìn)一步證實(shí)兩種群間存在明顯遺傳分化。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育

單基因的ML樹顯示,12個(gè)JY基因型分離物均與JY-2聚集在同一簇,且獨(dú)立于現(xiàn)有CTV基因型之外;但不同基因的系統(tǒng)發(fā)育中顯示的親緣關(guān)系有所差異,ORF1b基因ML樹顯示JY基因型分離物與M1基因型分離物親緣關(guān)系最近,p25和p33基因ML樹顯示JY基因型分離物與M1和L1基因型分離物親緣關(guān)系最近,p23基因的ML樹顯示JY基因型分離物與T30、S1基因型分離物親緣關(guān)系最近。在單基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果中,ORF1b、p33和p23系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果與基因序列多樣性分析和核苷酸分散度分析結(jié)果基本一致,僅p25基因略有不同。聯(lián)合4個(gè)基因構(gòu)建ML樹,發(fā)現(xiàn)與ORF1b單基因系統(tǒng)發(fā)育樹和JY-2全基因組序列分析[21]結(jié)果最為相似,即JY基因型與M1基因型分離物親緣關(guān)系最近,其次是T36、RB、A18基因型(見圖4)。

圖4 柑桔衰退病毒JY基因型12個(gè)分離物基于4個(gè)基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(ML)

3 討論

本研究對(duì)湖南的道縣、江永、宜章(莽山)和江西的崇義4個(gè)地區(qū)的野生柑桔樣品,以及湖南、江西、浙江、福建、重慶、四川、湖北、廣西、廣東等柑桔主產(chǎn)區(qū)的栽培柑桔樣品進(jìn)行了CTV JY基因型的檢測(cè),結(jié)果僅湖南都龐嶺山脈江永地區(qū)的野生柑桔樣品檢出JY基因型分離物,說(shuō)明JY基因型的發(fā)生和分布并不普遍。2020年,從枳上鑒定到L1和M1兩種CTV新基因型[11],兩者也僅在重慶采集的樣品中檢出。此外,有研究在云南省哀牢山地區(qū)的野生柑桔中鑒定了4種長(zhǎng)線形病毒,包括CTV和長(zhǎng)線形病毒科的3個(gè)新成員(CiVB、CaAV-1、CaAV-2),同樣這些新的柑桔長(zhǎng)線形病毒分布并不廣泛[22]。因此,推測(cè)柑桔中可能存在許多未知的長(zhǎng)線形病毒或CTV新基因型,但前期缺乏相關(guān)研究[23]。盡管這些新病毒與CTV新基因型目前發(fā)生和分布并不普遍,但野生柑桔中的未知長(zhǎng)線形病毒和CTV新基因型很可能通過(guò)人為和昆蟲媒介的方式傳播至附近的栽培柑桔果園,從而對(duì)柑桔產(chǎn)業(yè)造成威脅。

本研究通過(guò)克隆測(cè)序ORF1b、p33、p25和p23 等4個(gè)基因序列,進(jìn)一步分析了JY基因型分離物的分子特征。其中,ORF1b編碼蛋白參與病毒基因組復(fù)制[24-25];p33編碼蛋白具有多種,如與致病性、寄主范圍、重復(fù)侵染和運(yùn)動(dòng)等有關(guān)[26];p25編碼蛋白是CTV主要的外殼蛋白[2]同時(shí)也作為RNA沉默抑制子[27];p23為CTV沉默抑制子[27]。遺傳多樣性分析顯示,JY基因型分離物間ORF1b、p33、p25、p23基因序列的核苷酸和氨基酸序列相似性(>96.8%)非常高,說(shuō)明JY基因型種群內(nèi)的遺傳變異較少,種群較為穩(wěn)定;其中,p23基因核苷酸和氨基酸序列多樣性相對(duì)最為豐富,這可能與其作為CTV RNA沉默抑制子的功能有關(guān)[27]。遺傳多樣性、遺傳分化、分子變異及主成分分析的結(jié)果均證實(shí),JY基因型分離物與CTV其他基因型分離物存在明顯的遺傳分化。進(jìn)一步通過(guò)核苷酸分散度分析發(fā)現(xiàn),JY基因型分離物與CTV其他基因型分離物ORF1b、p33基因的分化程度明顯高于p23、p25基因,說(shuō)明4個(gè)基因盡管種群內(nèi)都較為穩(wěn)定但其面臨的選擇壓卻不同。這一結(jié)果與之前的報(bào)道[6]一致,即CTV 5’端基因序列多樣性高于3’端。

基于ORF1b、p33、p25、p23基因單獨(dú)及4個(gè)基因聯(lián)合的系統(tǒng)發(fā)育分析,表明JY基因型分離物均聚集在同一分支,且獨(dú)立于現(xiàn)有CTV基因型之外。盡管ORF1b、p33、p25系統(tǒng)發(fā)育分析顯示JY基因型分離物與M1基因型分離物親緣關(guān)系較近,但p23基因系統(tǒng)發(fā)育分析顯示JY基因型分離物與T30、S1基因型分離物親緣關(guān)系較近,遺傳多樣分析也顯示JY基因型分離物的p25、p23基因與M1基因型分離物的相似性低于A18基因型分離物。M1基因型分離物可檢測(cè)到多個(gè)重組事件[11],推測(cè)其為重組而產(chǎn)生的新基因型,但JY基因型分離物未檢測(cè)到重組事件。因此,推測(cè)JY基因型與M1基因型擁有共同的母系基因型,但分化后JY基因型與M1基因型是相互獨(dú)立演化的。

本研究以JY新基因型為研究對(duì)象,通過(guò)分子檢測(cè)、序列多樣性分析、遺傳分化分析、分子變異分析和系統(tǒng)發(fā)育分析,明確了JY基因型分離物發(fā)生分布范圍和種群分化特征,豐富了關(guān)于CTV種群多樣性的信息,將對(duì)解析CTV起源和進(jìn)化提供參考。