江燕，任錕，馮霞蘭，張莞英，郭宏偉，趙代國

（1.四川省藥品檢驗研究院（四川省醫(yī)療器械檢測中心），成都 611731；2.成都市金鼓藥用包裝有限公司，成都 611530）

藥品包裝系統(tǒng)密封完整性是一項涉及藥品質(zhì)量的重要物理監(jiān)測指標(biāo)，良好的包裝形式能夠防止藥品內(nèi)容物的損失，阻止微生物和有害物質(zhì)的進入，從而保證藥品安全、穩(wěn)定[1]。歐美國家很早就認識到包裝密封完整性的重要性，制定了USP<1207>、PDANO.27、ASTM F 2391—05 等一系列標(biāo)準(zhǔn)指南，為藥品包裝系統(tǒng)密封完整性驗證提供了指導(dǎo)[2-7]。我國藥品監(jiān)管部門在藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010 年修訂）（衛(wèi)生部令第79 號）中提及了包裝系統(tǒng)密封完整性要求，并于2020 年正式發(fā)布了《化學(xué)藥品注射劑包裝系統(tǒng)密封性研究技術(shù)指南（試行）》，將藥品包裝系統(tǒng)密封完整性的要求提到了一個新的高度[8-9]。

包裝系統(tǒng)密封完整性測試方法多種多樣，包括色水法、微生物挑戰(zhàn)法、質(zhì)量提取法、示蹤氣體法、真空衰減法、高壓放電法、激光法、壓力衰減法等[10-20]。以上方法各有優(yōu)劣，如色水法對硬件的要求較低，但通常靈敏度較低；微生物挑戰(zhàn)法需要操作人員具備微生物相關(guān)的專業(yè)知識；其他方法諸如質(zhì)量提取法、高壓放電法等需要配備專用且昂貴的設(shè)備。此次試驗根據(jù)《化學(xué)藥品注射劑包裝系統(tǒng)密封性研究技術(shù)指南（試行）》的研究原則和思路，開發(fā)了熒光劑–示蹤液體法，以檢查包裝系統(tǒng)的密封完整性。以羅丹明B為示蹤劑，采用高效液相色譜–熒光檢測器法進行檢測，評價利巴韋林滴眼液貨架期密封性，模擬臨床開啟后的密封性。該方法無須專用的密封性測試設(shè)備，簡單可靠，通用性強，能為滴眼劑產(chǎn)品的包裝系統(tǒng)密封完整性檢測提供有力的技術(shù)支持，目前國內(nèi)尚無相關(guān)文獻報道。

1 實驗

1.1 材料與儀器

主要材料：羅丹明B（分析純，批號C10788105，純度100%），麥克林公司；甲醇（HPLC 級，批號201209），F(xiàn)isher Chemical 公司；利巴韋林滴眼液（樣品A、B、C 均為近效期產(chǎn)品），分別購自相關(guān)企業(yè)；實驗用水為自制超純水。

主要儀器：1100 型高效液相色譜儀（配熒光檢測器），美國安捷倫公司；XS205DU 電子天平，德國梅特勒公司；Milli–Q Advantage A10 超純水機，美國密理博公司。

1.2 方法

1.2.1 HPLC 色譜條件

以Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，流動相為甲醇–水溶液（V甲醇∶V水=65 ∶35 ），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL，激發(fā)波長為550 nm，發(fā)射波長為574 nm，PMT 增益為11。

1.2.2 對照品溶液的制備

取羅丹明B 約11 mg，精密稱定，置于10 mL 容量瓶中，加超純水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液（S0）。精密量取適量S0，用超純水逐級稀釋成系列濃度的對照品溶液（S1—S9）：0.055、0.110、0.221、0.552、1.103、2.206、5.515、11.03、22.06 μg/mL。

1.2.3 供試品溶液的制備

1）陽性樣品。取低密度聚乙烯滴眼液空瓶（樣品C 包裝），加入超純水5 mL，在瓶塞及瓶蓋處用快速透明萬能膠（PP 膠）密封。在液面下方用外徑0.45 mm的注射針垂直于表面扎孔，取內(nèi)徑為5 μm 的標(biāo)準(zhǔn)毛細管（已用掃描電子顯微鏡確認內(nèi)徑）穿過上述扎孔，用PP 膠密封毛細管與孔的空隙，待PP 膠凝滯不流動后，向外拔出部分毛細管，使滴眼劑瓶內(nèi)露出的毛細管盡可能短，并確保毛細管不被堵塞，以此為標(biāo)準(zhǔn)陽性樣。同法制備5、10、20 μm 3 種標(biāo)準(zhǔn)陽性樣，各6 支。

2）陰性樣品。取低密度聚乙烯滴眼液空瓶（樣品C 包裝），按照陽性樣品的方法制備樣品，堵塞毛細管，以此為陰性樣品。

1.2.4 測試

將陽性樣品和陰性樣品置于裝有羅丹明B 溶液的燒杯中（質(zhì)量濃度約為1 mg/mL，已用0.45 μm 濾膜過濾），將液體浸沒樣品漏孔，置于正壓箱中，加壓至0.1 MPa，保持30 min，然后緩慢釋壓。取出樣品，用超純水洗滌樣品表面，用濾紙吸干樣品表面水分，振搖，使瓶內(nèi)液體混勻。取瓶內(nèi)液體，按1.2.1節(jié)色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 加壓測試方式的選擇

為了使染料快速進入樣品瓶內(nèi)，通常采用抽負壓或加正壓的方式。在抽負壓時，測試腔內(nèi)壓力降低，氣體從瓶內(nèi)轉(zhuǎn)移至測試腔中，再將測試腔恢復(fù)常壓，使樣品瓶內(nèi)的相對測試腔形成一定的真空度，從而促使測試腔中液體（如染料）進入樣品瓶內(nèi)。該方法通常耗時較長，尤其是當(dāng)漏孔尺寸較小時，藥品成分（如粉針劑、混懸制劑等）可能會在測試中堵塞漏孔，造成假陰性結(jié)果。文中采用加正壓方式，將羅丹明溶液直接壓入瓶內(nèi)，有效避免了該風(fēng)險。經(jīng)驗證，在加壓時間為30 min 時能保證測試的有效性。

2.2 檢測能力的驗證

取空白溶劑（超純水）、對照品溶液、陰性樣品、不同孔徑陽性樣品分別進行測試。結(jié)果表明，空白溶劑、陰性樣品在目標(biāo)組的分出峰位置均無響應(yīng)。在該條件下，5、10、20 μm 3 種陽性樣品均能檢測，檢測限級別達到《化學(xué)藥品注射劑包裝系統(tǒng)密封性研究技術(shù)指南（試行）》中的3 級（見表1）。統(tǒng)計空白溶劑、陽性樣品、陰性樣品的峰面積，結(jié)果見表2，色譜圖見圖1。5 μm 陽性樣品的照片見圖2，可觀察到明顯的紅色。

圖1 樣品色譜圖Fig.1 Chromatogram of samples

圖2 5 μm 孔徑陽性樣品照片F(xiàn)ig.2 Photograph of positive samples with 5 μm aperture

表1 氣體泄漏率與泄漏孔徑尺寸的關(guān)系Tab.1 Relationship between gas leakage rate and leakage aperture size

表2 樣品測試峰面積Tab.2 Peak area of tested samples

2.3 線性范圍和檢測限

進樣分析系列對照品溶液S1—S9，以主成分峰面積（Y）對濃度（X）進行線性回歸，計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明，羅丹明B 在測試濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程：Y=118.610 1X?2.432 0，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

將對照品溶液依次稀釋，按照信噪比3 ∶1 計算檢測限，按照信噪比10 ∶1 計算定量限，檢測限為9.675 μg/L，定量限為32.249 μg/L。羅丹明B 的檢測限濃度對應(yīng)的峰面積為1.10，即峰面積大于該值視為檢出，5、10、20 μm 3 種陽性樣品均能被有效檢出。

2.4 精密度

取對照品溶液S4，按照前述方法連續(xù)進樣6 針，記錄色譜圖，計算待測組分的精密度。峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.22%，該方法的精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性

取對照品溶液S4，按前述分析方法分別在0、81、99、207 h 時進樣分析，考察溶液的穩(wěn)定性，羅丹明B對照品溶液在207 h 內(nèi)穩(wěn)定，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.38%。

2.6 樣品測試結(jié)果及分析

2.6.1 利巴韋林滴眼液陽性樣品

由2.2 節(jié)的結(jié)果可知，以水為基質(zhì)，測得5 μm陽性樣的平均峰面積為5.40，測試樣品時的實際基質(zhì)為藥液。采用3 種利巴韋林藥液和水為溶劑，分別配制羅丹明B（質(zhì)量濃度為500 ng/mL）樣品。結(jié)果表明，此試驗中羅丹明B 的響應(yīng)在不同基質(zhì)中無顯著性差異，故以利巴韋林滴眼液（樣品C）為溶劑，配制與以水為基質(zhì)的5 μm 陽性樣響應(yīng)相當(dāng)?shù)娜芤海鳛槔晚f林滴眼液陽性樣。6 份樣品的峰面積均值為4.33，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.32%，此時羅丹明B 溶液的質(zhì)量濃度為62.52 ng/mL。以利巴韋林滴眼液為溶劑時，對應(yīng)的5 μm 陽性樣的峰面積為4.33。通過測定供試品，如果對應(yīng)峰面積小于該值，則視為樣品無泄漏，包裝系統(tǒng)密封性完整。

2.6.2 測定供試品

取3 批次樣品各10 支，按1.2.4 節(jié)方法操作，考察貨架期樣品的密封完整性。另取3 批次樣品各10支，模擬臨床使用情況。反復(fù)開封5 次，每次擠出5滴后旋緊瓶蓋，置于裝有羅丹明B 的燒杯中（質(zhì)量濃度約為1 mg/mL，已用0.45 μm 濾膜過濾）。采用相同方法制作樣品，將其作為反復(fù)開封樣品，考察多劑量滴眼液在實際使用過程中的密封完整性。

取貨架期樣品和反復(fù)開封樣品，按1.2.1 節(jié)的色譜條件進樣分析，并將所測結(jié)果與利巴韋林滴眼液5 μm陽性結(jié)果進行比較，見表3—4。以5 μm 漏孔為限度評價標(biāo)準(zhǔn)進行泄漏判定，結(jié)果表明，被測樣品在有效期內(nèi)的包裝系統(tǒng)密封性良好，未檢測到泄漏；反復(fù)開封后的樣品出現(xiàn)了不同程度的泄漏。

表4 反復(fù)開封樣品測試結(jié)果Tab.4 Test results of repeatedly opened samples

2.6.3 樣品瓶設(shè)計對密封性的影響

各滴眼劑瓶樣品具有不同的結(jié)構(gòu)設(shè)計。此次實驗考察了瓶身?瓶嘴一體式（樣品A）、瓶身?瓶嘴分體式（瓶嘴管路直通型）（樣品B）、瓶身?瓶嘴分體式（瓶嘴管路錐形）（樣品C）3 種結(jié)構(gòu)的樣品。在開啟前，由于瓶身?瓶嘴一體式樣品（樣品A）的瓶嘴和瓶身被完全密封（見圖3），因此在理論上它具有最良好的密封性，但在具體使用過程中發(fā)現(xiàn)其開口尺寸受人為因素的影響較大，且瓶嘴以下藥液流通管路內(nèi)徑迅速增大，樣品開封后在加壓過程中羅丹明B 溶液易進入瓶內(nèi)。瓶身?瓶嘴分體式（瓶嘴管路直通型）樣品（B）瓶內(nèi)接近瓶嘴部分具有相同內(nèi)徑（見圖4），相較于一體式設(shè)計降低了外界物質(zhì)的侵入風(fēng)險，但因采用分體式設(shè)計，瓶身與瓶嘴的配合性會影響其密封性。由于在瓶身?瓶嘴分體式（瓶嘴管路錐形）樣品（C）的瓶口與瓶身銜接部位設(shè)計了一段錐形管路（見圖4），孔徑較小，在加壓時羅丹明B 進入瓶內(nèi)的阻力較大，因此未檢測到泄漏，包裝系統(tǒng)的密封性較好。此次測試的3 種不同設(shè)計結(jié)構(gòu)樣品，在未開封時均具有良好的密封完整性，但開啟使用后的密封性顯現(xiàn)出較大的差異：C＞B＞A。由此可見，藥品生產(chǎn)企業(yè)在選擇滴眼劑藥包裝材料時應(yīng)關(guān)注結(jié)構(gòu)設(shè)計對藥液開啟后密封性的影響。

圖3 樣品照片F(xiàn)ig.3 Photograph of samples

圖4 瓶嘴照片F(xiàn)ig.4 Photographs of bottle mouth

3 結(jié)語

包裝系統(tǒng)密封完整性檢測最理想的情況是能進行全樣品檢測和樣品全生命周期檢測。根據(jù)《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（2010 版）和《化學(xué)藥品注射劑包裝系統(tǒng)密封性研究技術(shù)指南（試行）》的規(guī)定，熔融封口產(chǎn)品（如玻璃或塑料安瓿）應(yīng)進行100%檢漏試驗，其他包裝容器的密封性應(yīng)根據(jù)操作規(guī)程進行抽樣檢查。玻璃或塑料安瓿等產(chǎn)品采用熔融封口工藝，不能精確控制其封口質(zhì)量，在實踐中通常需進行100%檢漏試驗。全樣品密封性檢查需要避免對樣品引入污染和產(chǎn)生破壞，因此在選用檢測方法時有較大的局限性，需要綜合考慮。對于采用多劑量滴眼劑瓶等由多組件配合密封的產(chǎn)品，可通過模具和生產(chǎn)工藝精確控制組件尺寸及組件間的配合性，以保證包裝系統(tǒng)的密封性，通過抽檢即可保證密封性測試的有效性。

目前，針對包裝系統(tǒng)密封性的檢查多局限于出廠產(chǎn)品的包裝密封性檢測，對于需要反復(fù)開啟的多劑量產(chǎn)品，其密封完整性能否得到保證，也應(yīng)在產(chǎn)品設(shè)計時考慮，并進行驗證。在采用文中方法進行反復(fù)開啟密封性檢查時，應(yīng)保證樣品在重新密封時的擰瓶蓋圈數(shù)或扭矩保持一致，同時避免選用有磨損或變形的樣品，避免產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

陽性樣品的制備是驗證檢測方法能力的關(guān)鍵，常用的方式為激光打孔。塑料橡膠材質(zhì)包裝材料具有一定彈性和收縮性，如果采用常規(guī)的激光打孔方式，則所制孔徑大小不固定，與理論值的偏差較大。文中采用毛細管制備陽性樣品，能夠準(zhǔn)確控制孔徑尺寸，同時在實際操作中使毛細管的長度與樣品瓶身的厚度基本保持一致。可供檢查藥品包裝系統(tǒng)密封完整性的方法較多，但在具體推廣中需要平衡考量檢測靈敏度和使用成本。文中采用改進的色水法（熒光劑?示蹤液體法），可準(zhǔn)確檢測低密度聚乙烯材質(zhì)滴眼液包裝系統(tǒng)中存在的5 μm 孔徑泄漏，檢測限級別達到相關(guān)技術(shù)指南的3 級，可有效評價利巴韋林滴眼液產(chǎn)品包裝系統(tǒng)的密封完整性。該方法具有通用性強、靈敏度高等優(yōu)點，對設(shè)備和人員的要求較低，為滴眼劑產(chǎn)品密封完整性檢查和評估提供了新的檢測方法參考。